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心肌锚定重复序列蛋白基因心脏特异敲除小鼠模型构建与鉴定
目的 构建心肌锚定重复序列蛋白(CARP)基因心脏特异敲除小鼠模型,为研究CARP基因与心脏疾病的关系奠定基础.方法 构建CARP基因条件打靶载体pL253-CARP-LoxP电转入小鼠胚胎干细胞(ES)细胞,G418和GANC药物筛选阳性细胞克隆,Southern blot确定CARP基在条件打靶载体转染成功.胚胎注射ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠与心脏特异启动子Cre小鼠(α-MHC-Cre)杂交.结果 得到6只嵌合体小鼠,与α-MHC-Cre小鼠杂交获得CARP基因心脏特异敲除小鼠(CARP-KO),半定量RT-PCR和Westem blot确定CARP基因在CARP-KO小鼠心脏缺失.该小鼠早期胚胎发育和个体生长、心脏发育正常,但心肌肥厚标志基因β-MHC和ANF显著升高(分别为2.25±0.04和1.45 +0.03)(P＜0.05).结论 成功构建CARP基因心脏特异敲除小鼠,CARP基因缺失对小鼠胚胎发育、个体生长和心脏发育没有显著影响.
关键词： 心肌锚定重复序列蛋白 基因打靶 心肌肥厚 -
CARP抗体制备及表达模式分析
目的: 制备心肌锚定重复序列蛋白(CARP)的抗体并分析其表达模式.方法: 通过生物信息学对其抗原性进行分析, 通过RT-PCR从小鼠的心肌cDNA中扩增了N-端279 bp的片段, 并克隆到表达载体pET 28b中, 使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达, 用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化CARP蛋白, 用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.利用制备的抗体, 通过Western blot和免疫荧光的方法, 分别检测了CARP在各组织和细胞中的表达模式.结果: 制备了CARP抗体, 进一步验证了CARP表达在蛋白水上呈心肌特异性, 在大鼠心肌原代细胞中主要在细胞核中表达.结论: 成功制备了CARP抗体, 分析了CARP的表达模式, 为进一步CARP的功能奠定了基础.
关键词： 心肌锚定重复序列蛋白 原核表达 抗体制备 表达模式
