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变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因失活菌株的构建和鉴定
目的利用基因打靶技术构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因(gbpD)失活株,用于葡聚糖结合蛋白D基因功能的研究.方法体外培养变异链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因内部序列进行PCR扩增,连接自杀载体pVA8912,分别用酶切及PCR鉴定;转化变异链球菌UA159株,用PCR及Western blot鉴定.结果经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功构建了自杀质粒pVA8912-gbpD;经PCR鉴定及Western blot鉴定,gbpD基因失活株基因组中gbpD基因内部成功插入目的片段,且该菌株不表达GbpD蛋白.结论成功构建了用于变异链球菌gbpD基因打靶的自杀质粒和gbpD基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础.
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变形链球菌GbpA的GBD免疫防龋实验研究
目的:观察变形链球菌GbpA的GBD融合蛋白免疫SD大鼠的防龋效果.方法:用纯化的变形链球菌GbpA的GBD融合蛋白皮下免疫SD大鼠,喂Keyes改良的高糖Diet 2000,第1次免疫20d时,连续3d大鼠口腔中接种S.mutans Ingbritt,在接种S.mutans后第77天处死大鼠,收集大鼠颌骨标本,用于龋齿记分分析,用t检验进行统计学分析.结果:GBD融合蛋白免疫大鼠,实验组龋损范围及龋坏程度均显著低于对照组,P＜0.01.结论:变形链球菌GbpA的GBD融合蛋白疫苗可有效降低龋齿的发生.
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达
目的 原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-binding protein C gene,gbpC)特异片段.方法 将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物.结果 在SDS - PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43 000,与预计大小相符合.结论 成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体.
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白研究进展
葡聚糖结合蛋白是变形链球菌致龋的重要毒力因子。与变形链球菌的粘附、聚集、细胞壁生理功能、酶活性和形成生物膜并维持其结构稳定起重要作用。该文就变形链球菌4种葡聚糖结合蛋白研究现状，葡聚糖结合蛋白与生物膜、防龋疫苗的关系及当前存在的问题作一综述。
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达
目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(Glucan-binding protein C gene,gbpC)编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达.方法:根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342 bp～1794 bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定.将克隆获得的约0.45 kb的gbpC基因特异片段经EcoRI/SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物.结果:测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合.结论:成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,为制备GbpC抗体打下了基础.
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纳米基因防龋疫苗的构建及其免疫大鼠的实验研究
目的:制备pcDNA3.1(+)-gbpB-壳聚糖纳米基因防龋疫苗,并检测其经鼻免疫大鼠的效果.方法:制备两种pcDNA3.1(+)-gbpB-壳聚糖纳米颗粒载体系统,经鼻粘膜免疫SD大鼠,用ELISA 法检测血清中针对葡聚糖结合蛋白B的特异IgG抗体滴度及唾液中针对葡聚糖结合蛋白B的特异SIgA 抗体滴度.与阳性对照组霍乱毒素- pcDNA3.1(+)-gbpB及未免疫组、空白壳聚糖纳米颗粒组作比较.结果:该载体系统经鼻免疫SD大鼠所产生的血清及唾液中针对GbpB的IgG和SIgA 抗体滴度远大于未免疫组和空白壳聚糖纳米颗粒组,而与阳性对照组霍乱毒素- pcDNA3.1(+)-gbpB组抗体滴度相当.且维持的抗体滴度更稳定和持久.结论:成功构建了以葡聚糖结合蛋白B基因为免疫原的纳米基因防龋疫苗,并获得较好的免疫效果.
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携带变形链球菌表面蛋白、葡聚糖结合蛋白及信号肽基因的真核表达质粒的构建
目的 通过构建带有变形链球菌表面蛋白SpaP的P区、葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区(glucan binding domain,GBD)及一段信号肽基因的嵌和体真核表达质粒pSSG,为基因疫苗的制备提供实验基础.方法 通过PCR扩增,获得分别编码SpaP的P区和GBD的两个基因片段sp和gg,以及人白介素2信号肽基因(signal).将它们分别定向插入pMD20-T克隆载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,初步鉴定后测序.将获得的3个基因片段分别双酶切,胶回收纯化后将同样进行双酶切的pVAX1质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,获得真核表达质粒pSSG,并转化DH5α,提取纯化pSSG,进行质粒RCR,酶切电泳鉴定并测序.结果 真核表达质粒pSSG构建正确,目的 基因sp、gg和signal 定向插入至真核表达载体.结论 真核表达质粒pSSG包含了SpaP的P区和GBD以及人白介素2信号肽的编码基因,为基因疫苗研究奠定基础.
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白A真核表达质粒pcDNA3.1/GBD在哺乳动物细胞中的表达
目的观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白A(GbpA)的葡聚糖结合区(GBD)真核表达质粒pcDNA3.1/GBD在哺乳动物细胞COS-7的表达情况.方法通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3.1/GBD,通过脂质体转染法将其转染至COS-7细胞,通过免疫组化SABC法检测其在COS-7细胞的表达.结果 pcDAN3.1/GBD质粒转染的细胞质呈棕黄色染色,胞核无着色,pcDAN3.1空载体转染的细胞质及胞核无着色,空白对照组也无着色.结论质粒pcDAN3.1/GBD转染COS-7后能够在细胞内翻译、表达,表达的蛋白质位于细胞质中,可与抗GbpA抗体特异性结合,具有抗原性,可作为基因疫苗.
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防龋基因疫苗pVAX1-SPG在BALB/c小鼠免疫部位的原位表达
目的 观察防龋基因疫苗pVAX1-SPG免疫BALB/c小鼠后的原位表达.方法 重组质粒pVAX1-SPG经颌下腺区皮下注射、股四头肌注射和鼻腔黏膜滴注免疫BALB/c小鼠,免疫组化技术观察目的蛋白SpaP-P/GbpA-GBD在免疫部位的表达情况.结果 小鼠双侧颌下腺组织内均可见目的蛋白的弥漫性表达,尤以导管区域表达强烈,导管细胞的胞浆内呈强阳性染色;股四头肌肌纤维胞浆和肌膜下方阳性染色,呈不均匀的受限表达;鼻腔黏膜上皮下方的固有层与结缔组织中可见呈浅棕黄色染色的目的蛋白表达.结论 重组质粒pVAX1-SPG能够在BALB/c小鼠的免疫部位正确表达目的蛋白.
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经鼻腔黏膜免疫途径投递防龋DNA疫苗的研究进展
20世纪90年代以来,因DNA疫苗具有其它疫苗不可比拟的优点——免疫原性强,制备简单,免疫应答持久,安全等特点,成为防龋疫苗的研究热点.为寻找免疫防龋的佳途径,国内外许多学者在多种免疫方法和途径上进行了研究.唾液是口腔局部抗卷染的重生理屏障.以分泌型IgA (sIgA)作为主体液防御因子的黏膜免疫系统是机体抗感染的第一道防线,在抵抗感染方面起着极其重的作用.而且实验证明通过黏膜免疫之后,黏膜局部的抗体比血清抗体出现早、效价高,且维持时间长.鼻腔免疫它不仅能避免肝脏的首过效应,有效地诱导黏膜局部免疫和系统免疫应答,具有远隔共同黏膜效应,而且与其它免疫途径相比更加简便、安全、文明,无创伤.近年来鼻黏膜途径受到了基因免疫与基因治疗领域的广泛关注,因而对经鼻腔黏膜途径免疫的方式进行深入的研究,对将来防龋DNA疫苗的临床应用具有重的意义.
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因的克隆和序列分析
目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(glucan binding protein B, GbpB)的编码区基因片段.方法:提取变形链球菌基因组DNA,采用PCR方法,以特异性引物扩增GbpB编码区基因片段,并克隆到pBluescript KS载体,筛选阳性克隆进行序列测定.结果:PCR扩增到一特异性的约1300 bp的片段,克隆后筛选出阳性克隆进行序列分析,测定结果表明与国外已发表的序列完全一致.结论:利用分子生物学技术能成功克隆目的基因,进而为下一步的研究奠定基础.
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葡聚糖结合蛋白A抗体对变形链球菌黏附影响的研究
目的:了解葡聚糖结合蛋白(Gbp)A抗体对变形链球菌黏附的影响情况.方法:利用核素闪烁计数法,测定不同浓度的葡聚糖结合蛋白抗体影响两种变形链球菌对羟基磷灰石(HA)的黏附率.结果:葡聚糖结合蛋白抗体可明显抑制两种变形链球菌对羟基磷灰石的黏附率,并且随着葡聚糖结合蛋白抗体浓度的提高,抑制作用增强.结论:葡聚糖结合蛋白抗体可抑制变形链球菌对羟基磷灰石的黏附,在免疫防龋方面具有一定的意义.
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嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG的构建及表达研究
目的：构建含变异链球菌表面蛋白SpaP的P区编码基因spap-P和葡聚糖结合蛋白GbpA的葡聚糖结合区编码基因gbd的嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG,并观察其在哺乳动物细胞293T中的表达。方法：通过基因工程技术构建嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG,并采用脂质体转染法将其转染至293T细胞中；然后分别采用免疫组化SABC法和Western-blot检测嵌合蛋白SpaP/P-GBD在真核细胞中的表达。结果：重组真核表达质粒pVAX1-SPG经酶切、测序鉴定证实,其所携带的外源基因片段为2.4 kb的目的基因片段,序列同源性为99%；免疫组化染色结果显示,经pVAX1-SPG转染的293T细胞胞质呈棕褐色染色；Western-blot检测结果显示,分子量为72 kDa的嵌合蛋白SpaP/P-GBD能够被正确表达。结论：构建成功的嵌合体真核表达质粒pVAX1-SPG能在真核细胞293T中正确表达目的蛋白。
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变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的分子克隆
目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白 C基因(gbpC) 编码序列的特异片段.方法:根据文献报道的gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1105～1554bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定.结果:测序结果与Sato等报道的序列一致.结论:成功克隆了gbpC基因片段,为进一步的研究(探针标记、杂交及表达等)奠定了基础.
