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056 丝裂原活化蛋白激酶信号通路及其生物学功能
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路广泛存在于哺乳动物细胞中,主要由MAPKKK、MAPKK和MAPK 3类保守的蛋白激酶组成,与多种细胞反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)及机体多种生理病理过程(如脑发育、癌症及糖尿病等)密切相关.本文重点讨论了ERK1/2、JNK、p38及BMK1/ERK5通路的激活机制、下游底物及其生物学功能的研究进展.
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哺乳动物细胞中MAPK信号转导途径的研究进展
丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可被多种刺激所活化.MAPK在所有真核细胞中均有表达.近年来,人们越来越关注MAPK在细胞反应中所起的重要作用.目前,哺乳动物细胞中已明确了5条MAPK途径.本文主要对哺乳动物细胞中MAPK信号转导途径--ERK1/2、JNK、P38等途径的研究情况进行综述.
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中国生物制药产业的发展与展望——访中国工程院院士、第四军医大学细胞工程研究中心主任陈志南教授
2009年6月4~5日, "2009中国新药创制关键技术国际研讨会"在北京隆重举行.中国工程院院士、第四军医大学细胞工程研究中心主任陈志南教授应主办方邀请出席了大会并作了重要演讲.<中国医药技术经济与管理>杂志编辑部联合生物谷记者,有幸就我国生物制药产业的发展及其关键技术之一的哺乳动物细胞大规模培养技术的现状及展望独家采访了陈志南院士.
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腺苷二磷酸核糖基化及其生物学效应
真核生物体内蛋白质表达后均需经过一系列的修饰过程才能发挥作用,主要包括腺苷二磷酸(ADP)核糖基化、乙酰化、磷酸化、糖基化等.ADP-核糖基化是蛋白质翻译后的重要修饰方式之一,分为单-ADP-核糖基化,聚-ADP-核糖基化2种,其与染色质的功能与调节、肿瘤的发生、细胞死亡、细胞分化与信号转导、程序性细胞死亡等很多重要的生命活动相关[1-2].笔者将重点介绍哺乳动物细胞中的酶促的单-ADP-核糖基化反应和聚-ADP-核糖基化反应,以及这些反应的主要生物学效应.
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从哺乳动物细胞中快速分离质粒
介绍一种从哺乳动物细胞中快速分离质粒的方法.哺乳动物细胞经裂解后,乙醇沉淀其上清,然后用沉淀下来的核酸转化大肠杆菌.可以从大肠杆菌中大量提取和纯化质粒.
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小分子干扰RNA(siRNA)表达载体沉默靶基因的研究
目的研究siRNA表达载体在体外培养细胞中对目的基因的干扰作用,建立利用RNA干扰技术研究基因功能的平台.方法构建针对β-actin基因的表达siRNA载体,转染HeLa细胞,然后在mRNA水平、蛋白水平和细胞形态水平评价siRNA表达载体对β-actin基因表达的抑制作用.结果siRNA表达载体可以有效的抑制体外培养细胞β-actin基因的表达,使β-actin基因的mRNA和蛋白表达量显著下降,细胞形态发生显著变化.结论siRNA表达载体可以在体外培养细胞中有效的沉默β-actin基因,为研究基因功能提供了一个快速、有效的系统.
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哺乳动物细胞在生物技术药物研究与开发中的应用
分析了20多年来欧美已上市的生物技术药物,指出哺乳动物细胞已成为生物技术药物研发主要采用的基因表达系统.对外源基因高表达工程细胞株、高效工程细胞培养工艺、工程细胞产物分离纯化技术及工程细胞制品的安全性评价等进行了综述分析,并论述了中国哺乳动物细胞工程化技术现状和在药物研发中的作用.
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基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术
抗体等重组蛋白产品是以基因工程和细胞工程为关键技术的生物技术产品,其特异性高、均一性好、靶点明确,广泛应用于各类重大疾病、尤其是对肿瘤治疗[1-2].目前,在FDA批准的32种抗体药物治疗疾病的分类中,肿瘤类疾病占32%、免疫性疾病占37%、器官移植疾病占11%、感染性疾病占8%、心血管疾病占4%、其他疾病占6%.
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人源抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的表达
目的:构建人源抗-HAV全分子抗体的CHO细胞表达体系.方法:将抗-HAV抗体轻链全分子(信号肽与VL-CL)基因克隆至表达载体pCI-neo中;将重链信号肽、重链(γ)VH-CH1和Fc基因进行重组形成重链全分子基因,再将其克隆到真核表达载体pCdhfr1中.将轻、重链全分子表达载体共转染CHO/dhfr-细胞,用G-418和甲氨蝶呤(MTX)筛选细胞克隆,ELISA法检测细胞培养上清中的抗-HAV活性,增加MTX浓度进行加压筛选.用蛋白L亲和层析柱从培养上清中纯化重组抗体.结果:构建的真核表达载体可实现抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中的分泌表达,纯化的重组抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约25000、50000两条带;Western印迹表明,重组抗体全分子和重链分子均可和羊抗人Fc抗体发生特异性免疫反应.结论:抗-HAV全分子抗体在CHO细胞中表达,为基因工程生产具有完整功能的全分子抗体奠定了基础.
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人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的:构建表达人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的重组腺病毒载体,利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3.1-FⅦ载体得到FⅦ基因片段,补平后,插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白( GFP)表达盒的pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体,构建pAdTrack-CMV-FⅦ,继而进行酶切和测序鉴定;经PmeⅠ单酶切线性化后,pAdTrack-CMV-FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy-1腺病毒骨架发生同源重组,构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd-FⅦ;经PacⅠ酶切后的pAd-FⅦ,使用PEI试剂转染293 A细胞,包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad-FⅦ;利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad-FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平;通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定,FⅦ克隆到pAdTrack-CMV腺病毒穿梭载体中,获得重组质粒pAdTrack-CMV-FⅦ;将其与pAdEasy-1在细菌内发生同源重组,成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd-FⅦ;在293A细胞内包装重组腺病毒,Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad-FⅦ,并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达,为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。
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不同LET碳离子对哺乳动物细胞的生物学效应
目的研究不同传能线密度(IET)的重离子对体外培养细胞存活率、微核率和染色体畸变的效应.方法用集落形成法研究细胞的存活情况,观察统计细胞微核率和染色体结构的变化.结果①细胞存活:不同LET碳离子引起细胞失活效应由大到小的顺序依次为125,200,700keV/μm.②细胞微核:相同剂量下,200 keV/μm碳离子所致微核率高于700 keV/μm时的结果.③染色体畸变:可看到多种染色体结构变异.结论在本实验中,LET为125 keV/um的碳离子引起的失活效应大,200 keV/μm碳离子引起的微核率高于700 keV/um碳离子引起的微核率.
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转录因子FoxO4的研究现状
自1989年Weigle等首次从果蝇中发现第一个Fox基因即Forkhead以来,对该基因家族的研究就一直进行着.目前发现Fox家族共有19个(A-S)亚家族[1-2],FoxO(forkhead box subtype O,FoxO)是其中研究深的一个亚类.在哺乳动物细胞中FoxO包括FoxO1、FoxO3a、FoxO4及FoxO6.尽管FoxO成员之间具有不同程度分子结构和生理效应上的相似性,然而各成员在组织中表达并不均衡,提示不同FoxOs 分子具有其独特的细胞功能.近年来研究发现,FoxO4通过转录调控及信号转导途径对机体的生理调节、代谢、应激抵抗和细胞凋亡、自噬等诸方面起重要作用,逐渐成为生命科学研究的热点.
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微小RNA对血细胞分化及功能调控的研究进展
微小RNA(miRNA或miR)是近几年发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA,通过与靶mRNA互补结合,在转录后水平调节靶基因的表达,是细胞内基因表达的调控机制之一.迄今为止,已在哺乳动物细胞中鉴定出800多种miRNA.
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无义密码子介导的mRNA降解机制与疾病
无义密码子介导的mRNA降解(nonsenfe mediated mRNAdecay,NMD)现象的发现,早源于1979年美国学者Losson和Lacroute在对酵母菌URA 3基因的研究中观察到无义密码子突变体在mRNA瞬时合成率并非很低的情况下能够降低mRNA水平[1].随着分子生物学的研究进展,NMD机制在酵母、果蝇、线虫以及哺乳动物细胞中都得到了证实.1999年Hentze和Kulozik[2]在
上发表了关于NMD的文章,NMD机制开始引起人们重视.近年来的研究揭示了NMD与人体遗传病和癌症的发生机制有着十分密切的关系[3].本文就NMD机制以及与人类遗传疾病的研究综述如下. | -
哺乳动物细胞转染技术概述
本文介绍了三大类哺乳动物细胞转染方法,并概述了这些方法的应用及其优缺点。
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免疫细胞和肿瘤细胞外泌体及其免疫调节作用
细胞来源和组织分布:外泌体(Exosomes,microvesicles or exovesicles)是生活的哺乳动物细胞主动向细胞外芽生释放的囊泡样膜性细胞器,直径30~1 000 nm[1-3].外泌体的质膜与细胞膜略有不同,富含胆固醇、鞘磷脂和神经节苷脂,因而耐受Triton处理但皂草甙和十二烷基磺酸钠可使之裂解.
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BCL-G的研究进展和意义
细胞凋亡(Apoptosis)也称为"程序性细胞死亡"或"细胞自杀",是由基因介导的一系列变化,是存在于所有哺乳动物细胞中的保守途径.细胞凋亡是调节生物体正常发育和生命活动的一种不可缺少的机制,该调节一旦失败,可能导致机体疾病、畸形甚至死亡.对免疫系统而言,细胞凋亡不仅是免疫系统发育过程中必不可少的一个环节,而且是免疫系统行使功能的一种方式.
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丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在动脉粥样硬化中的意义
动脉粥样硬化是多种心脑血管疾病共同的主要病理基础,严重危害人类的健康.尽管目前AS的发病机制尚不完全清楚,但一般认为其发病的机制与氧化应激、炎性反应、剪切力、高糖等相关,其中炎性反应和氧化应激在AS病变进展中是两个重要的因素.研究表明,MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性,在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内,目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路,不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路,通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应.那么MAPK信号通路与AS是否存在相应的关系,而在AS中又起到什么样的作用与意义,本文就JAK-STAT信号通道在动脉粥样硬化中的研究进展做一个简单综述.
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稳定表达甲型流感病毒血凝素蛋白的哺乳动物细胞系的建立
目的 建立稳定表达甲型流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白的哺乳动物细胞系.方法 PCR扩增流感病毒(A/PR/8/34)全长HA基因,并将其克隆人真核表达载体pcDNA5/FRT(pDF)中,构建重组表达质粒pDF-HA,将其与表达Flp重组酶的pOG44质粒共转染Flp-In-CHO细胞,通过体内同源重组使目的 基因整合至宿主细胞染色体上.采用Hygromycin B持续压力筛选重组细胞系CHO-HA,通过间接免疫荧光法(IFA)和Western blot法检测HA蛋白的表达.重组细胞连续培养10代后,采用PCR和IFA法检测细胞中HA的基因遗传和蛋白表达的稳定性.结果 重组表达质粒pDF-HA经双酶切及测序,证实构建正确;通过Hygromycin B抗性及IFA,共筛选出20株高表达HA蛋白的重组细胞株,Western blot结果进一步证实,HA蛋白在重组细胞中获得表达,并被切割成HA1和HA2蛋白;连续培养10代后,PCR与IFA方法分别检测到重组细胞HA基因和蛋白的表达.结论 已成功建立了稳定表达甲型流感病毒HA蛋白的哺乳动物细胞系,为针对HA蛋白和流感病毒的免疫学检测以及HA蛋白的功能研究提供了靶细胞.
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单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D胞外区片段在哺乳动物细胞中的表达及其免疫活性
目的 在哺乳动物细胞中表达单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type-2,HSV-2)糖蛋白D(Glycoprotein D,gD)胞外区片段,并分析其免疫活性.方法 化学合成HSV-2G株gD蛋白胞外区片断的基因序列gDt,以pCEP4作为表达载体,构建N-末端带His标签的重组表达质粒pCEP4-gDt,转染至HEK293细胞进行表达.表达的蛋白采用镍离子柱亲和层析纯化,ELISA法检测目的 蛋白的抗原性.以纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多抗血清,间接ELISA法检测效价.结果 重组表达质粒经PCR、双酶切和DNA测序证实构建正确;表达产物经Western blot分析,在相对分子质量约46 000处可见目的 蛋白条带;纯化的重组蛋白浓度约为45μg/ml,经ELISA检测证实具有良好的抗原性,免疫小鼠5周后,血清中特异性抗体效价达5×103.结论 已在哺乳动物细胞中表达了HSV-2gD胞外区片段,其具有良好的抗原性和免疫原性,为HSV基因重组亚单位疫苗的研制奠定了基础.