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siRNA干扰人BMP9重组腺病毒载体的构建及其促进乳腺癌SK-BR-3细胞增殖
目的 筛选特异性干扰人BMP9基因的siRNA序列并制备重组腺病毒AdsiBMP9,探讨RNAi人BMP9基因后对乳腺癌SK-BR-3细胞增殖能力的影响.方法 设计制备3对干扰人BMP9的双链DNA序列,亚克隆至Pses-Hus质粒中获得Pses-Hus-siBMP9质粒,脂质体转染乳腺上皮细胞HBL-100筛选有效干扰质粒,构建重组腺病毒并感染SK-BR-3细胞,RT-PCR,Western blot检测BMP9表达,MTT检测细胞增殖能力.结果 成功构建并筛选出针对人BMP9基因的有效干扰质粒并包装成腺病毒,病毒滴度为1×1010IU/mL,感染SK-BR-3细胞显示BMP9在转录水平和翻译水平表达量显著低于对照组和空白组(P＜0.05),第5天AdsiBMP9组细胞的增殖率显著高于AdsiNC组(P＜0.05).结论 成功构建特异性沉默人BMP9基因的siRNA腺病毒载体,可有效抑制SK-BR-3细胞中BMP9基因的表达从而促进该细胞增殖.
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NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究
目的 探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能.方法 将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率.结果 移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性).联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率.结论 NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞.
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klf4反义基因腺病毒载体的构建和鉴定
本研究针对klf4基因,利用AdEasy腺病毒载体系统构建人klf4反义基因重组腺病毒载体.klf4基因片段反向克隆到穿梭质粒pShuttle-CMV,利用同源重组技术在大肠杆菌BJ5183内构建重组腺病毒Ad-反义klf4,酶切线性化重组载体,并在293细胞中扩增、制备重组病毒.经限制性酶切、PCR扩增和测序检测鉴定,证明Ad-反义klf4重组腺病毒基因正确插入后,将Ad-反义klf4转染人原代脐静脉内皮细胞,采用real-time PCR、Western b1ot方法观察其对内皮细胞中KLF4表达的抑制效果.结果表明:成功构建了重组klf4反义基因腺病毒载体,重组腺病毒可明显降低细胞内klf4 mRNA和KLF4蛋白表达.结论:成功构建了Ad-反义klf4重组腺病毒载体,这为进一步研究klf4的生物学功能及应用提供物质基础.
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KGF和EGFP双基因共表达的重组腺病毒转染小鼠骨髓间充质干细胞的研究
为了将角质生长因子(KGF)基因通过腺病毒载体转染到间充质干细胞(MSC)中,增强MSC胸腺修复功能,利用DNA重组技术,将目的基因KGF克隆到含有报告基因EGFP的穿梭质粒中,然后再将构建的重组穿梭质粒转移至pAdxsi载体中,构建重组腺病毒载体质粒,继而在H293细胞中包装、扩增,并测定病毒滴度.转染至小鼠骨髓MSC中,为胸腺组织修复免疫功能恢复提供前期实验基础.结果表明:重组穿梭质粒pShuttle-GFP-mKGF重组穿梭质粒经酶切鉴定得到0.6kh和5.1 kb 2个条带；重组腺病毒载体质粒pAdxsi-mKGF病毒质拉经酶切鉴定得到阳性克隆；测定重组腺病毒Ad-EGFP-mKGF半数组织培养感染量的滴度为1.6×1010 pfu/ml.转染后10 hMSC开始表达荧光,6-8 d达高峰,转染率可达92.3％,28d仍有表达.结论:pAdxsi-mKGF病毒质粒构建成功并能高效、安全地转染MSC.
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Ad-vcam-1-gfP重组腺病毒转染人脐血源基质细胞的实验研究
本研究探讨血管细胞黏附分子(vcam-1)修饰的人脐血源基质细胞(human umbilical cord blood derived strom cells,CBDSC)在造血调控中的作用.采用DNA重组技术,将目的基因vcam-1克隆至含有报告基因gfp的穿梭质粒;在BJ5183细胞中与pAdeasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体转染人脐血源基质细胞并进行鉴定.结果表明:vcam-1基因与pAdTrack-CMV载体成功连接,经Not Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后电泳可见2个大小约为9kb和2 kb左右条带,经PCR法扩增后电泳可见1个600 bp左右条带,证明pAdTrack-CMV-vcam-1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-vcam-1质粒与pAdeasy-1质粒同源重组后,产物经PAC Ⅰ酶切后电泳可观察到2个大小约为31 kb、4 kb左右条带,与预期结果相符.腺病毒载体转染人脐血源基质细胞后免疫化学、RT-PCR、荧光显微镜等方法均检测到目的基因vcam-1的表达.结论:构建ad-vcam-1-gfp重组腺病毒载体可成功转染人脐血源基质细胞并使其vcam-1表达增高.
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人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达
目的：构建HSP75基因重组腺病毒载体，观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因，连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域，构建重组穿梭质粒pHBAd-MCM-HSP75-GFP，在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞，整合包装成重组腺病毒， TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定，HSP75基因已正确插入穿梭质粒中，并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒；重组腺病毒滴度为1.0×1010 PFU/ml；Western blotting检测，转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建，对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。
关键词： 热休克蛋白75 重组腺病毒载体 C17.2神经干细胞 -
含人组织激肽释放酶1和基质金属蛋白酶组织抑制物1基因共表达载体对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
背景和目的 前期研究表明人组织激肽释放酶1(hTK1)基因过表达具有部分抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和改善血管再狭窄的作用,但联合基质金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP1)对VSMC增殖是否具有协同效应,目前尚不明了.本研究构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组腺病毒载体,并观察其在大鼠VSMC中的表达,以及对VSMC生长增殖影响.方法 采用限制性内切酶BglⅡ和SalⅠ,酶切含启动子CMV和hTIMP1基因片段的重组穿梭质粒,经PCR、连接、热激、转化等亚克隆至pDC316-hTK1质粒中,构建含双基因hTK1和hTIMP1的重组穿梭质粒.将骨架质粒和穿梭质粒于293A细胞包装重组腺病毒载体.感染大鼠VSMC后,采用Realtime-PCR法、Western blot法检测目的基因转录、蛋白表达.细胞计数法和四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞增殖.结果 经PCR、酶切和测序法证实,含双基因(hTK1和hTIMP1)的重组病毒穿梭质构建正确.在293A细胞中成功包装出重组腺病毒载体Ad-hTK1-hTIMP1.感染VSMC后,双基因(hTK1和hTIMP1)的转录水平表达呈现随感染复数(50～150 MOI)和时间(1～3 d)依赖性地增加,目的蛋白(hTK1和hTIMP1)亦呈现浓度依赖性地高表达.与单基因载体(Ad-hTK1或Ad-hTIMP1)相比较,双基因载体可明显抑制血小板源性生长因子(PDGF)诱导的大鼠VSMC增殖(P＜0.01),其峰值抑制率为45.7％.结论 首次成功构建并包装重组腺病毒双基因载体Ad-hTK1-hTIMP1.感染细胞后,其目的基因和蛋白均呈现独立高表达,并具有协同抑制VSMC增殖的效应,为血管增殖性疾病的多基因干预治疗实验提供一个新工具.
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抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达
目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasv-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd-ScFv,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒Ad-ScFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达.结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.
关键词： 抗HBc ScFv基因 复制缺陷型 重组腺病毒载体 -
重组腺病毒rAD-mTERT-m4-1BBL与T淋巴细胞混合培养对小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的免疫杀伤作用
目的 研究在T淋巴细胞混合培养条件下,腺病毒rAD-mTERT-m4-1BBL(简称rAD-mTERT)对小鼠肝癌细胞株Hepa1-6的免疫杀伤作用.方法 分别以rAD、rAD-CMV-m4-1BBL(简称rAD-CMV)和rAD-mTERT转染Hepa1-6和1929细胞,检测其生长和凋亡变化.将转基因细胞与小鼠脾T淋巴细胞混合培养,观察T淋巴细胞表型变化及转基因细胞的生长和凋亡变化.细胞生长的检测采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法,细胞凋亡的检测采用Annexin V-碘化丙啶(PI)双染色法.结果 rAD、rAD-CMV和rAD-mTERT病毒对Hepa1-6和L929细胞均有明显的生长抑制作用和轻度的促凋亡作用.与活化T淋巴细胞混合培养后,各组转基因Hepa1-6和L929细胞的生长均受到抑制,以rAD-CMV+T淋巴细胞组为明显;rAD-CMV对Hepa1-6和L929细胞的促凋亡作用均十分明显,rAD-mTERT仅对Hepa1-6细胞有明显的促凋亡作用.混合培养后,CD4~+和CD8~+T淋巴细胞均出现一定程度的增殖,但CD8~+T淋巴细胞增殖明显强于CD4~+T淋巴细胞,CD4/CD8比值从混合培养前的1.27下降为混合培养后的1.08.结论 单纯腺病毒可以抑制靶细胞的生长,但不促进其凋亡.在与T淋巴细胞混合培养下,重组腺病毒载体rAD-mTERT可靶向抑制Hepa1-6细胞的生长并促进其凋亡,其促凋亡作用是通过T淋巴细胞的免疫杀伤作用实现的.
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TβR-Ⅱ-RANTES融合基因重组腺病毒的抗肿瘤作用
目的 构建表达融合基因TGF-βⅡ型受体(TβR-Ⅱ)胞外区及活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)重组腺病毒载体,并观察其抗肿瘤作用.方法 RT-PCR扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES.采用adMax adenovirus vector creation试剂盒构建表达融合基因重组腺病毒.体外感染小鼠肺腺癌LA795细胞系,绘制细胞生长曲线.采用Western blot法检测感染后细胞融合基因的表达;酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测其培养上清的蛋白含量;Annexin V-FITC法检测感染后细胞的凋亡;并观察感染后细胞培养上清对小鼠脾细胞的趋化作用.将感染后的细胞(1×105个)接种于T739小鼠,观察成瘤时间和生存时间;1×1010 pfu的重组腺病毒局部注射荷瘤小鼠,观察肿瘤的大小变化,并统计肿瘤的重量和计算抑瘤率.结果 经测序证实,RT-PCR正确扩增小鼠TβR-Ⅱ胞外区和RANTES基因,重叠PCR正确扩增融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES.重组质粒pDC316-融合基因经酶切鉴定正确,与pJM17双质粒共转染获得表达融合基因重组腺病毒,病毒滴度为8×1010 pfu/ml.Western blot结果 表明,感染后的LA795细胞有融合蛋白的特异性条带出现;培养上清中,游离TGF-β1的水平显著减低,而RANTES的水平显著升高.感染融合基因重组腺病毒的细胞生长速度明显减低,凋亡率为16.9%;培养上清可趋化小鼠脾细胞,与对照组之间差异均有统计学意义.感染融合基因重组腺病毒组与对照组相比,体内成瘤时间和生存时间明显延长;局部注射融合基因重组腺病毒可显著抑制肿瘤的生长,抑瘤率为37.6%.结论 成功构建表达融合基因TβR-Ⅱ胞外区-RANTES重组腺病毒可有效结合TGF-β1,显著逆转TGF-β介导的免疫抑制状态,高水平表达RANTES强化肿瘤局部的免疫功能,具有显著的抗肿瘤作用.
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人凝血因子Ⅶ重组腺病毒载体的构建及鉴定
目的：构建表达人凝血因子Ⅶ（FⅦ）的重组腺病毒载体，利用腺病毒载体介导哺乳动物细胞表达重组人凝血因子Ⅶ（rhFⅦ）。方法利用BamHⅠ和EcoR Ⅴ双酶切pcDNA 3．1－FⅦ载体得到FⅦ基因片段，补平后，插入经SalⅠ单酶切、补平并去磷酸化处理的加强型绿色荧光蛋白（ GFP）表达盒的pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体，构建pAdTrack－CMV－FⅦ，继而进行酶切和测序鉴定；经PmeⅠ单酶切线性化后，pAdTrack－CMV－FⅦ在BJ5183感受态菌内与pAdEasy－1腺病毒骨架发生同源重组，构建重组表达FⅦ的腺病毒质粒pAd－FⅦ；经PacⅠ酶切后的pAd－FⅦ，使用PEI试剂转染293 A细胞，包装表达FⅦ的重组腺病毒Ad－FⅦ；利用Western 印迹检测重组腺病毒Ad－FⅦ介导293 A细胞表达FⅦ的蛋白水平；通过观察EGFP的表达来判断质粒转染及病毒感染细胞的效率。结果经酶切和测序鉴定，FⅦ克隆到pAdTrack－CMV腺病毒穿梭载体中，获得重组质粒pAdTrack－CMV－FⅦ；将其与pAdEasy－1在细菌内发生同源重组，成功获得FⅦ重组腺病毒质粒pAd－FⅦ；在293A细胞内包装重组腺病毒，Western印迹检测到FⅦ蛋白的表达。结论成功构建重组腺病毒Ad－FⅦ，并实现了rhFⅦ在哺乳动物细胞中的表达，为利用哺乳动物细胞表达rhFⅦ的研究奠定了基础。
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CXCR4-shRNA对人胃癌细胞SGC7901裸鼠腹腔转移瘤生长转移影响的实验研究
目的 探讨CXCR4-shRNA腺病毒载体对人胃癌细胞裸鼠腹腔转移瘤的抑制作用.方法 构建裸鼠腹腔转移瘤模型,分为SGC7901组、空病毒组、CXCR4-shRNA组,比较3组裸鼠肿瘤体积、重量,转移灶肿瘤数,裸鼠生存时间、生存延长率、抑瘤率.Western blot检测肿瘤组织VEGF-C、MPP-2蛋白的表达情况.结果 接种8～15 d后裸鼠均有肿瘤长出,术区可触及大小2～3 cm的结节,质硬且活动不良.shRNA组肿瘤体积平均(0.78±0.14)mm3、重量平均(1.20±0.16)g、数目平均(5.75±1.39)个,与SGC7901组[(5.61±0.44)mm3、(3.93±0.19)g、(28.86±1.83)个]及空病毒组[(4.65±0.42)mm3、(3.82±0.14)g、(27.75±1.39)个]比较差异有统计学意义(P＜ 0.01)；SGC7901组及空病毒组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).SGC7901组生存时间平均(25.50±1.28)d,空病毒组(29.00±1.60)d,CXCR4-shRNA组(40.62±2.06)d；CXCR4-shRNA组生存延长率及抑瘤率分别为59.3％及69.5％,空病毒组分别为13.7％及2.8％.Western blot检测结果显示,CXCR4-shRNA组VEGF-C 、MMP-2蛋白表达水平明显弱于SGC7901组及空病毒组.结论 CXCR4-shRNA腺病毒载体可抑制人胃癌细胞裸鼠腹腔转移瘤的生长及转移.
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Raf-1基因重组腺病毒 siRNA 载体构建及其对大鼠心肌细胞肥大的影响
目的：构建特异性抑制大鼠Raf-1基因的重组腺病毒载体，并将其体外转导大鼠心肌细胞中进行功能鉴定。方法合成针对大鼠Raf-1的靶序列及阴性对照序列，经退火形成的DNA双链定向克隆到穿梭质粒pAdTrackCMV中获得pAdTrack-siRaf-1质粒，PmeI线性化后在BJ5183细菌中与pAdEasy-1骨架质粒进行同源重组获得pAd-siRaf-1质粒，后转染HEK293细胞，包装获得pAd-siRaf-1腺病毒颗粒，继而感染原代培养的心肌细胞，通过Western blot方法检测siRNA对Raf-1、NF-κB基因的抑制效率，液体闪烁计数仪测定3 H-亮氨酸（[3 H]-leu）掺入率，用HJ2000图像分析系统测定细胞表面积。结果重组腺病毒载体经酶切、鉴定正确，制备的病毒感染效率高，携带Raf-1的病毒颗粒能够在蛋白水平有效抑制Ang II诱导心肌细胞Raf-1的表达、细胞表面积及[3 H]-leu的增加并下调Raf-1、NF-κB表达。结论成功构建了pAd-siRaf-1重组腺病毒载体，并在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，转染心肌细胞后能有效抑制Raf-1、NF-κB表达，抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。
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蛋白激酶Nemo样激酶基因重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的 构建含有蛋白激酶Nemo样激酶(NLK)的重组腺病毒载体.方法 采用RT-PCR方法在人胚肾细胞系HEK293T细胞中扩增NLK基因及其突变体K155M、T286V和C425Y,同时在目的基因的C端添加便于蛋白表达检测的FLAG tag,经与载体pAdTrack-CMV连接、转化、筛选、鉴定后,将Western blot检测表达正确的重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体再经酶切、电转入BJ5183感受态细胞(已包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1)同源重组,并筛选、鉴定、扩增.通过Pacl酶切后,以快速简便的乙醇沉淀法替代传统的酚-氯仿-异戊醇法回收酶切产物,用高效低毒高稳定性的FuGENE HD转染试剂替代传统的lipofectamin 2000转染低代数的HEK293A包装细胞,进行病毒包装.包装后的重组腺病毒感染结直肠癌细胞HCT 116,Western blot检测以确认NLK及其突变体蛋白的表达.结果 经PCR、测序及Western blot检测证实,成功构建了携带NLK基因及其突变体的腺病毒载体,PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组过渡质粒pAdTrack-CMV-NLK及其突变体与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组成功,重组表达克隆转染HEK293A细胞获得病毒原液,扩增后感染结直肠癌细胞HCT 116能正确表达NLK蛋白及其突变体蛋白.结论 成功制备NLK基因及其突变体重组腺病毒,可进一步用于NLK生理功能的研究.
关键词： 蛋白激酶Nemo样激酶 重组腺病毒载体 同源重组 -
反义c-myc重组腺病毒对人肝细胞癌细胞的实验性治疗
目的研究携带反义c-myc的重组腺病毒(Ad-Asmyc)对人肝细胞癌细胞体外、体内的治疗作用及其机制.方法用Ad-Asmyc感染人肝细胞癌细胞系BEL-7402和QSG-7701,绘制细胞生长曲线,进行克隆形成实验,研究Ad-Asmyc在体外的抗瘤作用,在瘤内注射Ad-Asmyc,观察裸鼠皮下移植瘤的生长情况.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot检测相关基因表达,应用流式细胞术、梯形DNA、DNA原位末端标记研究细胞周期及细胞凋亡情况.结果感染Ad-Asmyc后,BEL-7402及QSG-7701细胞内c-myc基因表达降低,肿瘤细胞的生长受到明显抑制,而且出现了G1期阻滞及凋亡,体内注射Ad-Asmyc后裸鼠皮下移植瘤的生长也得到明显抑制.结论 Ad-Asmyc在体外及体内可使肝细胞癌出现细胞生长抑制,发生凋亡,具有明显的抗癌作用,是有应用前景的抗癌药物.
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TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建
将TCRV β7.1基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中,再穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒.然后用PCR,RT-PCR对其进行鉴定.
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AT1R shRNA重组腺病毒载体对SHR主动脉AT1R蛋白分布的影响
目的 利用靶向大鼠血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因mRNA的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究对在体自发性高血压大鼠(SHR)主动脉AT1R蛋白分布的影响.方法 重组腺病毒载体通过尾静脉注射法转染SHR,免疫组织化学法测定SHR主动脉AT1R表达.结果 AT1R的shRNA的重组腺病毒载体转染SHR,通过免疫组织化学法证实,大鼠主动脉的AT1R表达明显降低.结论 利用靶向大鼠AT1R 基因mRNA腺病毒载体,在体内环境下可以高效特异性抑制主动脉AT1R表达.
关键词： 基因干扰 自发性高血压大鼠 血管紧张素Ⅱ1型受体 重组腺病毒载体 短发夹RNA -
重组腺病毒TGF-β的扩增及病毒滴度检测
目的:探讨高效扩增腺病毒载体的方法.方法:用人胚胎肾细胞株扩增重组腺病毒,并测定病毒滴度.结果:扩增病毒滴度约为5×108pfu/mL.结论:用人胚胎肾293细胞株扩增重组腺病毒,在不进行任何浓缩时可达到较高病毒滴度,为腺病毒介导的基因转载提供了有效途径.
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重组CRT/MAGE-A3腺病毒转染SGC-7901细胞及对其抑制作用的研究
目的 探讨同时携带CRT基因及MAGE-A3基因的重组腺病毒载体转染人胃癌细胞SGC-7901的表达及对其体外侵袭、凋亡及血管形成能力的影响.方法 Ad-CRT/MAGE-A3转染SGC-7901,转染48h后以Western blotting法检测CRT及MAGE-A3蛋白的表达,Transwell方法检测Ad-CRT/MAGE-A3对SGC-7901细胞侵袭的影响,Annexin V -FITC/PI双染法检测Ad-CRT/MAGE-A3对SGC-7901细胞凋亡的影响,小管形成实验检测AdCRT/MAGE-A3对血管形成的影响.结果 转染48h,Westem blotting结果显示转染Ad-CRT/MAGE-A3的SGC7901细胞能够表达CRT及MAGE-A3蛋白,Transwell检测结果显示Ad-CRT/MAGE-A3能够明显抑制SCC-7901的侵袭能力,Annexin V -FITC/PI双染法检测结果证实Ad-CRT/MAGE-A3在实验的转染条件下对SGC-7901并无诱导凋亡的作用,小管形成实验结果显示Ad-CRT/MACE-A3能够明显抑制血管形成.结论 Ad-CRT/MAGE-A3明显抑制SGC-7901的侵袭能力和血管生成,提示Ad-CRT/MAGE-A3可以作为潜在的胃癌基因治疗的新方法.
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常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白报告分子腺病毒真核表达载体的构建
背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导生理功能完整的新血管生成.目的:构建能够同时表达突变型低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)报告分子的新型腺病毒真核细胞表达载体.方法:对目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人低氧诱导因子1α基因进行测序和对其序列内部限制性内酶识别位点进行分析,利用PCR(poly-merase chain reaction,PCR)技术定点突变低氧诱导因子1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸,酶切、测序检测突变情况,将正确突变后的低氧诱导因子1α基因(突变mutagenesis,突变后的HIF-1α基因写作HIF-1αmu)定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中.携带HIF-1αmu基因的重组腺病毒穿梭载体经测序鉴定、Pme I酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,利用细菌内同源重组机制将HIF-1αmu和人源化绿色荧光蛋白基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒,通过Pac I酶切及测序鉴定获得重组体.结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸.经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功.结果表明,成功构建了新型重组腺病毒突变型真核细胞表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1.
