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人HSP75基因重组腺病毒载体构建及在C17.2神经干细胞的表达
目的：构建HSP75基因重组腺病毒载体，观察HSP75蛋白在C17.2神经干细胞中的表达。方法采用PCR方法从含人HSP75基因质粒中扩增HSP75基因，连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点区域，构建重组穿梭质粒pHBAd-MCM-HSP75-GFP，在LipofiterTM转染试剂的介导下与腺病毒辅助骨架质粒pHBAd-BHGloxΔE1,3 Cre共转染HEK293细胞，整合包装成重组腺病毒， TCID50法测定病毒滴度。使用荧光显微镜、流式细胞仪和Western blotting观察重组腺病毒在C17.2细胞中的感染情况及HSP75蛋白的表达水平。结果通过酶切鉴定、测序、PCR鉴定，HSP75基因已正确插入穿梭质粒中，并与病毒骨架质粒整合包装成重组腺病毒；重组腺病毒滴度为1.0×1010 PFU/ml；Western blotting检测，转染后的神经干细胞表达HSP75蛋白。结论 HSP75重组腺病毒载体成功构建，对C17.2神经干细胞具有较高的表达效力。
关键词： 热休克蛋白75 重组腺病毒载体 C17.2神经干细胞 -
NURR1基因修饰C17.2神经干细胞移植治疗脑梗死
目的:比较C17.2神经干细胞和NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗对脑梗死模型鼠神经功能缺损的改善效果,观察细胞移植后与宿主脑组织的整合、存活、移行及分化情况.方法:实验于2005-06/12在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.①实验材料:选取清洁级健康SD雄性大鼠78只,随机数字表法分为模型对照组、神经干细胞组、转基因神经干细胞组,26只/组.条件永生化神经干细胞系C17.2由哈佛大学儿童医院Even Synder教授惠赠.pAdeasy-NURR1重组复制缺陷性腺病毒由本实验室成功构建.Dil18荧光染料(Chemicon公司产品).②实验方法:收集C17.2神经干细胞和pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞,各分为两管,一管加入Dil18荧光示踪剂.各组大鼠均采用线栓法建立局灶性脑缺血/再灌注损伤模型,3 d后进行细胞移植,以江湾Ⅱ型脑立体定向仪进行立体定位,选择缺血半暗区3个位点为移植区:前囟头侧1 mm,旁开2 mm,深度1.2 mm;前囟尾侧3 mm,旁开1.5 mm,深度1.2 mm;前囟尾侧6 mm,旁开2 mm,深度1.2 mm.模型对照组每位点注射单纯培养液2 μL;神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的C17.2神经干细胞悬液2 μL,剩余20只每位点移植C17.2神经干细胞悬液2 μL;转基因神经干细胞组取6只每位点移植Dil18标记的pAdeasy-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2 μL,余20只每位点移植pAdeas-NURR1+C17.2神经干细胞悬液2 μL.③实验评估:各组大鼠分别在移植前1 d及移植后1周、2周、1个月进行神经功能缺损评分.移植后1周、2周、1个月进行荧光示踪检查及神经元特异烯醇化酶免疫组化检测.移植后6个月行组织学检查.结果:移植后1周,模型对照组死亡1只,神经干细胞组死亡2组,转基因神经干细胞组死亡2只,均淘汰并予以补充.①神经功能缺损评分:移植前1 d各组大鼠神经功能缺损评分基本相似(P＞0.05).移植后1周、2周、1个月神经干细胞组、转基因神经干细胞组神经功能缺损评分均明显低于模型对照组(P＜0.05);转基因神经干细胞组下降趋势较神经干细胞组更为显著(P＜0.05).②Dil18荧光细胞示踪结果:移植后1周荧光示踪细胞主要在针道内,少数细胞开始移行至周围神经组织.移植后2周,细胞移行至更远距离,并明显向梗死灶方向移行,细胞有突触样结构与周围细胞形成联系.移植后1个月细胞向周围扩散,甚至在远隔部位也可见荧光细胞.③神经元特异烯醇化酶免疫组化检测结果:移植后2周、1个月,转基因神经干细胞组神经元特异烯醇化酶阳性细胞数均明显高于神经干细胞组(P均＜0.05).④细胞组织学检查:移植后6个月,各组大鼠注射针道周围脑组织仍呈正常的层次和结构,未见有明显异型细胞增生.结论:①NURR1基因修饰的C17.2神经干细胞移植治疗局灶性脑梗死能显著改善神经功能缺损,效果优于C17.2神经干细胞.②移植后供体细胞存活并向注射针道周围神经组织移行,促进神经干细胞向神经元方向的分化.
关键词： Nurr1基因 移植 脑梗死 C17.2神经干细胞 -
Nurr1基因的克隆及其在C17.2神经干细胞中的表达
目的:通过克隆Nurr1基因并在神经干细胞中表达,探讨其对多巴胺能神经元生长、发育的影响,为治疗神经系统变性疾病,特别是帕金森病提供基因工程细胞.方法:采用RT-PCR(reverse transcription-polymerasechain reaction)方法获取Nurr1 cDNA,并克隆至pcDNA3.1-hygro载体中,经酶切及测序鉴定正确;再将Nurr1基因经Lipofectamine2000转染,在C17.2神经干细胞中稳定表达.结果:经反转录多聚酶链反应(RT-PCR)及WesternBlot印迹分析、鉴定Nurr1基因mRNA及蛋白表达正确.结论:Nurr1基因成功导入神经干细胞并表达,为实施基因工程细胞移植治疗PD奠定了基础.
关键词： Nurr1 C17.2神经干细胞 帕金森病 -
左旋多巴对c17.2神经干细胞的毒性作用及培高利特的保护作用
目的 探讨左旋多巴对c17.2神经干细胞的毒性作用和培高利特的保护作用.方法 c17.2神经干细胞加左旋多巴和培高利特培养不同时间,观察各组细胞的存活率、凋亡率和p53、Bax、Bcl-2、核因子(NF)-κB p65、细胞色素C、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)和caspase-3活性片段的表达.结果 左旋多巴可使c17.2神经干细胞活性降低,与剂量相关(均P＜0.05),Brdu标记显示200 μmol/L左旋多巴可使细胞增殖活力下降,与时间相关(P＜0.05),作用12h、24h后的Annexin-V染色荧光显微镜和流式细胞仪可检测到凋亡细胞,Western Blot显示p53、Bax、细胞色素C、caspase-3和caspase-3活性片段表达量增加.培高利特能部分保护神经干细胞免受左旋多巴的影响(均P＜0.05),并能部分抑制左旋多巴引起的细胞凋亡(均P＜0.05).结论 大剂量左旋多巴对c17.2神经干细胞具有毒性作用,呈剂量和时间依赖性.左旋多巴通过抑制DNA合成影响细胞增殖,并通过活化p53、Bax、细胞色素C、caspases-3途径促进细胞凋亡,培高利特可部分拮抗左旋多巴的毒性作用.
关键词： 左旋多巴 培高利特 C17.2神经干细胞 细胞凋亡 神经保护 -
神经干细胞过表达Hsp75降低Aβ介导的神经毒性
目的：应用腺病毒为载体在体外过表达热休克蛋白75（Hsp75），研究Hsp75蛋白过表达对神经干细胞在Aβ诱导神经毒性中的作用，并初步探讨其作用机制。方法：体外培养小鼠神经干细胞C17.2，实验分为对照组、Aβ处理组、腺病毒阴性感染组和腺病毒Hsp75过表达感染组。使用荧光显微镜观察腺病毒的感染情况并进行细胞免疫鉴定；倒置相差显微镜观察各组神经干细胞的形态；MTT法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡率；Western blot检测Hsp75和活化型caspase-3蛋白水平。结果：荧光显微镜观察和Western blot检测表明腺病毒成功感染神经干细胞并高效表达Hsp75蛋白。此外，腺病毒感染不会导致细胞形态改变及细胞分化，同时也不会影响细胞活力。与对照组比较，Aβ处理组及腺病毒阴性感染组细胞存活率显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率及活化型caspase-3蛋白水平显著增高（ P＜0.05）；然而，Hsp75过表达能显著提高神经干细胞的存活率，减少细胞凋亡和降低活化型caspase-3蛋白水平（P＜0.05）。结论：Hsp75过表达对Aβ诱导损伤的C17.2细胞具有明显保护作用，其机制可能是与抑制caspase-3途径依赖的细胞凋亡有关。
关键词： 热休克蛋白75 C17.2神经干细胞 细胞凋亡 -
AADC和NURR1基因联合c17.2神经干细胞移植治疗帕金森病的实验研究
目的研究芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因和NURR1基因联合c17.2神经干细胞脑内移植后对帕金森病模型大鼠的治疗效果.方法人类神经元性AADC基因和NURR1基因真核表达载体分别转染至c17.2神经干细胞内.将帕金森病(PD)模型大鼠随机分为4组,分别予以脑内毁损侧纹状区移植含空质粒的c17.2神经干细胞(A组),pCDNA3-AADC转染后的c17.2神经干细胞(B组),pCDNA3-NURR1转染后的c17.2神经干细胞(C组)以及含有pCDNA3-AADC和pCDNA3-NURR1转染后的c17.2神经干细胞(D组).观察其病理性旋转行为的改善,采用酪氨酸羟化酶(TH)的免疫组化方法研究脑内多巴胺含量的变化,并用荧光示踪方法观察C17.2细胞在PD模型脑内的移行.结果各组动物脑内移植后动物旋转行为较前均有改善(P＜0.05),尤以D组改善为明显,其行为学大改善达73.7%,且同A、B、C组间差异具有显著性(P＜0.05).免疫组化可见各组移植TH阳性细胞明显增多,TH染色的神经元树突或轴突密集,体内TH阳性区域明显较PD模型组扩大,其中尤以D组病理学改善为明显.荧光示踪观察c17.2神经干细胞有突触形成,并与临近的细胞建立突触联系.结论 AADC基因联合NURR1基因共转染c17.2神经干细胞脑内移植后改善了动物的旋转行为,增加了脑内多巴胺的表达,且植入的神经干细胞可同宿主神经元形成突触联接,为研究多基因联合神经干细胞移植治疗帕金森病提供了新方法.
关键词： 芳香族氨基酸脱羧酶基因 Nurr1基因 C17.2神经干细胞 帕金森病 基因治疗 -
GCaMP基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像研究
目的 研究GCaMP(属于基因编码钙指示剂/蛋白钙指示剂)基因工程化的C17.2神经干细胞的钙离子成像.方法 用慢病毒转染C17.2细胞,获得稳定表达GCaMP基因的C17.2-GCaMP细胞.Real-time PCR定量检测C17.2细胞及C17.2-GCaMP细胞中神经干细胞标志物巢蛋白(nestin)的表达情况.将C17.2细胞(Fluo-4 AM染色后)和C17.2-GCaMP细胞置于定制数字荧光显微镜下进行钙离子荧光检测.结果 Real-time PCR检测结果提示C17.2细胞及C17.2-GCaMP细胞中nestin表达差异无统计学意义(P＞0.05).C17.2-GCaMP细胞较Fluo-4 AM染色C17.2细胞钙离子荧光锐波(spike)波形持续时间长且相对荧光强度强(P＜0.05),在Fluo-4 AM染色C17.2细胞中能观察到钙离子荧光慢波(wave)波形,而C17.2-GCaMP wave波形不典型.结论 C17.2-GCaMP细胞在保持神经干细胞干性的同时能够监测细胞内钙离子变化,能够运用于神经干细胞移植治疗视网膜色素变性功能整合的研究.
关键词： C17.2神经干细胞 GCaMP GECI Fluo-4 AM -
三维微小凹图式的制备及其与C17.2神经干细胞的复合
以紫外光光刻及氢氟酸湿法蚀刻加工硅阳模,采用基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的软光刻技术制备9种不同结构尺寸的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和PMDS三维微小凹图式.PLGA及PDMS三维微小凹图式经等离子氧蚀刻和多聚赖氨酸裱衬处理后进行C17.2神经干细胞培养.随着在图式上培养时细胞的增殖,C17.2神经干细胞逐渐在微小凹中聚集,表现出明显的三维生长行为;通过羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)染色后进行激光共聚焦显微扫描与三维重构,显示大部分细胞生长于微小凹中离底面30～90μm的区间内;免疫荧光结果显示C17.2神经干细胞在三维微结构中复合培养2d后呈现均一的巢蛋白(Nestin)阳性.结论:本文设计的微小凹图式适用于C17.2神经干细胞的三维培养及后续的分化研究,细胞于微小凹图式培养过程中可以保持均一的干细胞特性.
关键词： 三维 微小凹 微加工 C17.2神经干细胞 -
碱性成纤维细胞生长因子对放射性诱导小鼠C17.2神经干细胞凋亡的影响
目的:研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抑制放射性诱导小鼠C17.2神经干细胞凋亡的作用.方法:用直线加速器进行总剂量为8 Gy外照射C17.2神经干细胞建立放射损伤细胞模型,将处理后的C17.2神经干细胞悬液以1×108/L的浓度接种于96孔板中,每孔加细胞悬液200μl,然后分别加入bFGF 0(对照),25,50和100 μg/L干预24 h处理.用4-甲基偶氮唑盐法检测细胞活性并拟合生存曲线,用流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随bFGF浓度增加,放射诱导后的C17.2神经干细胞增殖比明显增加(P＜0.01),呈现明显剂量-效应关系(r =0.628,P＜0.01).在一定放射剂量下,随着bFGF浓度增加C17.2神经干细胞生存曲线右移,表明bFGF能够提高神经干细胞的放射耐受性(r =0.569,P＜0.01).bFGF为100 μg/L时,C17.2神经干细胞活性强,且无细胞毒性作用.流式细胞仪测定的对照组C17.2神经干细胞凋亡率明显高于bFGF 25和50 μg/L(P ＜0.01)处理组,并且凋亡率在bFGF 25,50和100μg/L组间也存在显著差异(P＜0.01).结论:bFGF能显著抑制放射诱导的小鼠C17.2神经于细胞凋亡,其机制有待进一步研究.
关键词： 放射诱导 C17.2神经干细胞 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 凋亡 小鼠
