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SGSM家族功能及其与帕金森氏疾病的关系
小G蛋白信号调节基因(SGSM),这种新型基因家族结合小G蛋白及其所介导的信号转导系统.Nurr1基因在中枢系统有广泛的表达,与中脑多巴胺能神经元的发生发育和存活相关.Nurr1长的基因产物Nurr1作用蛋白(NuIP)被认为是小G蛋白信号调节基因.本文介绍了SGSM基因家族与Nurr1基因的关系,及Nurr1基因对帕金森病(PD)的影响.
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α-突触核蛋白与Nurr1相互作用增强致小鼠小胶质细胞系肿瘤坏死因子α表达增多
目的 在BV2细胞中,探讨α-突触核蛋白(α-sy)与Nurr1之间是否存在相互作用及其对肿瘤坏死因子(TNF-α)分泌的影响.方法 用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)和免疫组织化学染色观察α-syn和Nurr1之间是否存在相互作用,用免疫组织化学和蛋白印迹观察Nurr1核转位,用酶联免疫技术(Elisa)检测TNF-α的释放量.结果 α-syn和Nurr1存在共定位,α-syn和Nurr1可能存在相互作用.过表达α-syn时Nurr1的核转位减少,单独过表达α-syn使得TNF-α分泌增加；而同时过表达Nurr1可以明显抑制TNF-α产生.结论 α-syn可能通过与Nurr1相互作用从而减少其核转位,导致TNF-α产生增多,这可能是α-syn介导胶质细胞活化引起炎症的机制之一.
关键词： α-syuclein Nurr1 TNF-α BV2 -
Purmorphamine 对 BV2细胞帕金森病相关基因 Nurr1表达的影响
目的：探讨Purmorphamine（PM）激活小胶质细胞瘤BV2细胞中Sonic hedgehog（SHH）信号通路对帕金森病（PD）相关基因Nurr1表达的影响。方法体外培养BV2小胶质细胞并分为对照组、脂多糖（LPS）处理组、PM＋LPS处理组以及PM处理组，运用荧光定量 PCR（Q‐PCR）检测经LPS处理后BV2细胞中SHH信号通路Smoothened（Smo）、Gli1及Nurr1基因mRNA 表达情况；PM 激活SHH信号通路后，Q‐PCR检测Nurr1 mRNA含量以及炎性反应因子白细胞介素‐1β（IL‐1β）、肿瘤坏死因子‐α（TNF‐α）的mRNA 表达情况。结果（1）与对照组相比，LPS处理后4 h和24 h时Smo和Gli1 mRNA表达均升高（P＜0.01，P＜0.05）；（2）与对照组相比，PM处理组细胞Smo和Gli1 mRNA表达升高（P＜0.01），LPS组Nurr1、IL‐1β、TNF‐αmRNA表达亦均升高（均 P＜0.01）；而PM＋LPS组Nurr1、IL‐1β、TNF‐αmRNA表达均较LPS处理组下降（均 P＜0.01）。结论PM激活SHH信号通路能够抑制BV2细胞中Nurr1的表达，并能发挥抑制炎性反应作用。
关键词： Purmorphamine BV2细胞 帕金森病 Nurr1 炎症 -
真核表达载体GV394-Nurr1的构建及鉴定
目的：构建含人源性Nurr1基因真核表达载体GV394?Nurr1，检测其瞬时表达对细胞内活性氧类物质（ ROS）水平的影响。方法 PCR扩增人Nurr1基因，克隆至 T载体，测序正确后与真核载体 GV394一起，经BamHI和XhoI双酶切，T4 DNA连接酶连接，构建GV394?Nurr1；采用脂质体将GV394?Nurr1瞬时转染神经母细胞瘤SH?SY5Y细胞，RT?PCR检测Nurr1基因mRNA水平，通过DCFH?DA染色检测Nurr1对细胞内ROS水平的影响。结果 PCR及测序证实人Nurr1基因正确克隆至真核表达载体GV394； RT?PCR显示Nurr1基因mRNA水平在瞬时转染的细胞中明显增高；DCFH?DA染色显示瞬时转染Nurr1的神经母细胞瘤细胞的细胞内的ROS水平峰值较对照组明显左移。结论成功构建人源性Nurr1真核载体，可在SH?SY5Y细胞中表达并减少细胞内ROS水平，为进一步在体外研究Nurr1的功能及其与多巴胺能神经元的保护作用的关系提供了基础。
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内源性Nurr1对胚胎中脑及前脑前体细胞体外分化的诱导作用
目的:多巴胺神经元的发育是人们较为关注的问题,目前发现的蛋白可能在其发育机制中起着重要作用,研究内源性Nurr1基因表达变化对体外培养大鼠胚胎神经前体细胞分化的诱导作用.方法:实验于2003-05/2004-08在首都医科大学北京神经科学研究所完成.分离13.5 d大鼠胚胎中脑及前脑神经前体细胞并进行体外培养,培养基中加入视黄酸及毛喉素诱导3 d,采用RT-PCR,estern Blot及免疫荧光染色的方法观察Nurr1表达的变化及细胞分化;同时,用反义寡核苷酸转染技术阻断细胞Nurr1表达后再进行诱导,并进行同样观察.结果:视黄酸及毛喉素可诱导前体细胞的Nurr1表达,增加约60%,中脑来源神经前体细胞中(tyrosine hydroxylase,H)阳性细胞占β-tublin-Ⅲ阳性细胞的比例由原来的(5.32±1.20)%增至(9.01±3.20)%.前脑来源神经前体细胞中TH阳性细胞占β-tublin-Ⅲ阳性细胞的比例由原来的(1.27±1.20)%增至(5.01±1.50)%.Nurr1反义寡核苷酸作用12 h后前体细胞的Nurr1表达被阻断,至72 h后重新表达.Nurr1被阻断后,只有少量的前体细胞被诱导为TH阳性细胞.结论:内源性Nurr1的过表达可促进胚胎神经前体细胞向多巴元分化.
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外源性Nurr1基因过表达促进6-羟基多巴胺诱导的SK-N-SH细胞凋亡
目的研究Nurr1 基因过表达在6-羟基多巴胺(6-OHDA)选择性诱导多巴胺(DA)能神经元特异性损伤中的作用. 方法①不同浓度6-OHDA作用不同时间,比较细胞形态;②细胞经6-OHDA作用后,经流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布比例;③不同浓度6-OHDA作用不同时间,经AnnexinV/PI 双染后,运用共聚焦显微镜观察细胞凋亡情况,获得毒素诱导凋亡的适剂量(75μmol/L)和时间(12 h),运用FCM检测两株细胞早期凋亡比例. 结果①经6-OHDA处理后,倒置相差显微镜观察,结果显示SK-N-SH/Nurr1细胞形态损伤早于SK-N-SH细胞,且损伤程度明显;②细胞周期结果显示,6-OHDA诱导SK-N-SH细胞G2/M期细胞比例下降,而SK-N-SH/Nurr1细胞S期细胞比例下降;③经AnnexinV/PI双染联合FCM检测早期凋亡比例结果显示,SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡比例明显高于SK-N-SH细胞(P＜0.05).结论外源性Nurr1基因过表达促进了6-OHDA 诱导的SK-N-SH/Nurr1细胞凋亡,Nurr1可能与SK-N-SH/Nurr1细胞对6-OHDA损伤敏感性增强有关.
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GFP-Nurr1基因修饰神经干细胞的建立及过表达Nurr1对神经干细胞向多巴胺神经元分化的影响
目的 利用慢病毒载体建立GFP-Nurr1基因修饰的原代神经干细胞(NSCs)模型并观察Nurr1过表达后NSCs向多巴胺神经元的分化影响.方法 利用基因重组构建pLenO-DCE-Nurr1慢病毒载体,用慢病毒转染第三代NSCs,转染72 h后荧光检测转染效果;设置空白对照组、空载体组及DCE-Nurr1组,分别用Western blot及PCR检测Nurr1的表达差异;并将转染后的NSCs分化培养7d后分别用免疫细胞化学检测、Western blot及PCR检测酪氨酸羟化酶(TH)的表达.结果 慢病毒转染NSCs72h后,转染率可达90%,与对照组相比DCE-Nurr1组高表达Nurr1.经慢病毒载体感染后的NSCs仍具备分化潜能,分化培养后发现DCE-Nurr1组分化的神经细胞中TH阳性细胞分化率90.60%,对照组为21.2%.结论 慢病毒载体可高效转染NSCs过表达Nurr1;Nurr1基因过表达可以促进中脑腹侧来源NSCs向TH阳性多巴胺能神经元方向分化.
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Nurr1基因的克隆及其在C17.2神经干细胞中的表达
目的:通过克隆Nurr1基因并在神经干细胞中表达,探讨其对多巴胺能神经元生长、发育的影响,为治疗神经系统变性疾病,特别是帕金森病提供基因工程细胞.方法:采用RT-PCR(reverse transcription-polymerasechain reaction)方法获取Nurr1 cDNA,并克隆至pcDNA3.1-hygro载体中,经酶切及测序鉴定正确;再将Nurr1基因经Lipofectamine2000转染,在C17.2神经干细胞中稳定表达.结果:经反转录多聚酶链反应(RT-PCR)及WesternBlot印迹分析、鉴定Nurr1基因mRNA及蛋白表达正确.结论:Nurr1基因成功导入神经干细胞并表达,为实施基因工程细胞移植治疗PD奠定了基础.
关键词： Nurr1 C17.2神经干细胞 帕金森病 -
Nurr1在MN9D细胞中的过表达及其对酪氨酸羟化酶的影响
目的:观察MN9D细胞中Nurr1的表达和分布及Nurr1过表达对酪氨酸羟化酶的影响.方法:应用高压液相色谱、免疫细胞化学、转基因、Western blot和Northern blot等方法检测了MN9D细胞中多巴胺及其代谢物的水平和Nurr1蛋白在细胞中的分布,建立了过表达Nurr1的细胞株并观察了Nurr1过表达对TH基因的影响.结果:MN9D细胞裂解液中含有大量多巴胺及其代谢物;Nurr1蛋白主要分布在MN9D细胞的胞质中,尤以核周多;MN9D细胞中有Nurr1的mRNA存在和蛋白质的表达;过表达Nurr1的MN9D细胞A1株酪氨酸羟化酶表达增高.结论:Nurr1与多巴胺能神经元发育有关,有可能用于帕金森病的基因治疗.
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IL-1α对神经前体细胞Nurr1基因的诱导表达
目的:了解中脑和纹状体神经前体细胞Nurr1基因的表达以及IL-1α对中脑神经前体细胞和纹状体神经前体细胞Nurr1基因的诱导表达作用.方法:采用RT-PCR,Westem Blot和免疫荧光染色方法观察中脑和纹状体神经前体细胞内Nurr1 mRNA和蛋白质的表达,采用半定量RT-PCR方法观察IL-1α对中脑和纹状体神经前体细胞Nurr1 mRNA的诱导表达作用.结果:中脑和纹状体神经前体细胞均表达Nurr1mRNA和蛋白质,中脑神经前体细胞的Nurr1表达量多于纹状体神经前体细胞.IL-1 α可诱导中脑神经前体细胞Nurr1 mRNA的快速表达,IL-1α(100pg/mL)作用1 h后,Nurr 1mRNA表达增加,3 h后Nurr1 mRNA表达达到高峰,24 h后恢复至基线水平.而纹状体神经前体细胞的Nurr1mRNA在IL-1α诱导后无明显变化.结论:IL-1α可能通过Nurr1的过度表达促进中脑神经前体细胞向多巴胺能神经元方向分化.
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NR4A2基因及其选择性剪接异构体与胃癌发生及转移的关系
目的:检测胃癌中NR4A2(又称Nurr1)基因的表达,从NR4A2调控机制出发寻找相关选择性剪接异构体,探讨其与胃癌发生和转移的关系.方法:通过选择性剪接数据库(ASD)预测NR4A2基因可能存在的选择性剪接异构体,半定量PCR检测NR4A2及异构体的表达,基因测序技术鉴定新的剪接异构体;实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及剪接异构体的表达水平;免疫组织化学方法检测28例样本中NR4A2蛋白表达.结果:NR4A2基因在胃癌原位、癌旁、转移组织中均有表达,确定了2种剪接异构体NR4A2-Ⅰ和NR4A2-Ⅱ.实时定量PCR检测41例样本中NR4A2及2种异构体在癌旁组织表达水平高于原位癌(P=0.017,P=0.007,P=0.004);在肝转移灶中表达水平低于原位癌(P=0.001,P=0.018,P=0.016),差异有统计学意义.免疫组化检测发现癌旁组织中NR4A2表达阳性率高于原位癌及转移灶,但差异无统计学意义(P=0.672).结论:胃癌原位、癌旁和转移组织中至少存在NR4A2基因的2种剪接模式;NR4A2及异构体的表达变化与胃癌发生和转移相关.
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Forskolin激活MN9D细胞内源性Nurr1表达的信号机制研究
目的利用具有未成熟多巴胺神经前体细胞特性的杂交瘤细胞系MN9D,探讨Forskolin激活Nurrl表达的分子信号机制.Nurr1是未知配体的核转录因子,对中脑多巴胺神经元的发育至关重要.方法①用Forskolin作用MN9D细胞1～6 h,提取细胞蛋白,Western blot方法检测MN9D细胞内源性Nurr1表达的变化,并利用磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)抗体检测Forskolin作用后MN9D细胞内ERK信号转导通路是否被激活.②应用ERK信号转导通路的特异性抑制剂U0126预孵育MN9D细胞,再用Forskolin作用,检测MN9D细胞Nurr1表达的变化.结果①从Forskolin作用1h起,直至6 h,MN9D细胞核内Nurr1表达均比未加Forskolin作用组明显增加.同时,MN9D细胞内p-ERK1/2蛋白含量迅速增加,在1h起即达到差异有显著性(P＜0.05),并持续保持在较高水平,直至Forskolin作用6h.而Forskolin作用前后MN9D细胞内ERK1/2总蛋白的表达量基本保持不变.②用MEK1/2的特异性抑制剂U0126预处理,可有效抑制MN9D细胞内ERK信号转导通路的激活,并明显阻断Forskolin引起的MN9D细胞内源性Nurr1表达增加.结论ERK信号通路在Forskolin引起的MN9D细胞内源性Nurr1表达及核转位增加中发挥重要作用.
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李氏5号方对D-半乳糖老化小鼠行为学、海马神经元超微结构和Nurr1表达的影响
D-半乳糖老化小鼠是研究脑老化的常用模型,表现在皮层神经元转录水平降低,RNA及蛋白质含量下降,神经细胞数目减少,小鼠水迷宫成绩下降等,与老龄动物的表现一致[1,2].我们以往的研究发现D-半乳糖老化小鼠表现学习、记忆功能减退,海马神经元存在明显的超微结构改变,NGF和NT-3的免疫反应阳性细胞数减少,并出现神经元凋亡.但这些改变可被APP(β-Amyloid Precursor Protein)17肽明显改善[2～5],提示D-半乳糖老化小鼠的脑神经元损伤可被药物干预.现本文报告李氏5号方水提液(广东高明脑病医疗医药研究院提供,粉剂,由龟甲、枸杞子、石菖蒲、核桃仁、当归、远志、红花等组成)对D-半乳糖老化小鼠的学习记忆功能、海马神经元超微结构和Nurr1的影响.
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含NURR1基因重组腺病毒旁分泌对神经干细胞分化的影响
目的:探讨含NURRI基因的腺病毒(Ad-NURR1)旁分泌效应对C17. 2神经干细胞分化的影响.方法:用Western blot检测Ad-NURR1 nurrl蛋白分泌,以旁分泌试验检测nurr1蛋白对神经干细胞分化的影响.结果:Western blot证实Ad-NURR1表达的nurr1蛋白可分泌到细胞外上清内,并可明显促进神经于细胞向神经元方向分化.结论:nurr1蛋白可分泌到细胞外并能促进神经干细胞分化.
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Cyclopamine对LN229细胞Nurr1基因表达的影响
目的 探讨环巴胺(Cyclopamine)对恶性胶质瘤细胞株LN229帕金森相关基因Nurr1表达的影响.方法 在脂多糖(LPS)刺激LN229细胞的条件下,运用实时定量PCR检测SHH通路基因PTCH、Gli1及Nurr1基因mRNA含量,Western Blotting检测LPS对LN229细胞Nurr1蛋白表达的影响.进一步在Cyclopamine阻断Sonic Hedgehog (SHH)信号通路的条件下,实时定量PCR及Western Blotting 检测Nurr1的mRNA含量及其蛋白的表达及下游炎症因子IL-1β mRNA的含量.结果 LPS刺激下LN229细胞SHH通路相关基因mRNA,及Nurr1 mRNA升高,Western Blot结果进一步证明LPS可以促进Nurr1蛋白表达.Cyclopamine阻断组与对照组比较,在转录水平和翻译水平明显促进了Nurr1基因表达升高,及下游炎症因子IL-1βmRNA的含量.结论 Cyclopamine对LN229细胞Nurr1表达的影响可能与帕金森发病过程中胶质细胞的活化有关.
关键词： Cyclopamine LN229细胞 Nurr1 -
过表达Nurr1基因的骨髓间充质干细胞的诱导及移植治疗帕金森病的研究
目的:探讨Nurr1基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,rMSCs)脑内移植对帕金森病(parkinson disease PD)大鼠的治疗作用.方法:用脂质体转染法转染PcDNA3.1(+)-Nurr1入rMSCs并稳定表达然后移植大鼠PD模型纹状体内;观察行为学变化并用免疫组化、RT-PCR等方法检测移植细胞的Nurr1、DAT和TH表达;利用高效液相色谱检测多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)含量.结果:Nurr1-rMSCs组和rMSCs组移植治疗8周内PD大鼠旋转行为均得到一定的改善(P＜0.05);移植后2～4周Nurr1-rMSCs组较rMSCs组改善程度更为显著(P＜0.05),但第8周时二组行为学差异无统计学意义(P＞0.05).免疫组化显示Nurr1-rMSCs能够稳定表达Nurr1且少量细胞表达DAT,但未发现TH阳性细胞.而rMSCs组和对照组则均未发现有Nurr1、DAT、TH表达;RT-PCR检测显示移植后2～8周,Nurr1-rMSCs组移植区有Nurr1和DAT mRNA表达,但未发现TH mRNA表达;两治疗组DA、DOPAC和HVA含量均较对照组增高(P＜0.05).结论:Nurr1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞移植大鼠纹状体可以在一定时期内存活并有效表达,同时可提高纹状体DA含量,改善模型鼠症状,为治疗PD的研究提供了实验依据.
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Nurr1的研究进展
Nur相关因子1(Nurr1)属于孤儿核受体的超家族,人类Nurr1基因位于2号染色体,有8个外显子,在中枢神经系统内有广泛表达,与中脑多巴胺能神经元的发生、发育和存活有密切关系.本文对Nurr1的分子结构、分布、生理功能以及与多巴胺能神经元显型的关系作一综述.
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含有NURR1基因的重组复制缺陷性腺病毒的构建和鉴定
[目的]构建并鉴定携带NURR1基因的重组复制缺陷腺病毒高效表达载体,为基因调控神经干细胞分化后治疗帕金森病奠定基础.[方法]将测序鉴定正确的NURR1基因插入穿梭质粒pTrack-CMV后,与Adeasy整合,重组Adeasy质粒在肾293A细胞内包装成病毒,PCR鉴定并测定病毒滴度,电镜鉴定病毒颗粒.[结果]成功构建的穿梭质粒pTrack-CMV-NURR1与pAdeasy整合后,重组Adeasy质粒在肾293A细胞内包装和复制时,细胞病变效应(cytopathogeniceffect,CPE)明显,PCR鉴定病毒DNA中有NURR1基因,病毒滴度测试表明病毒含量高,电镜显示病毒为多面体.[结论]成功构建出含有NURR1基因的重组复制缺陷性腺病毒表达载体.
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龟羚帕安丸对帕金森病大鼠行为学及中脑黑质Nurr1、TH、Nurr1mRNA、THmRNA的影响
目的:观察龟羚帕安丸对帕金森病(PD)大鼠行为学及中脑黑质细胞孤儿核受体相关因子1(Nurr1)、酪氨酸羟化酶(TH)以及其mRNA表达的影响.方法:采用6-OHDA注射法建立PD大鼠模型,造模成功大鼠随机分为模型组,美多芭组(10mg/kg),龟羚帕安丸4g/kg、2g/kg、1 g/kg组,假手术组、模型组给予等容积生理盐水,连续灌胃给药30天.观察各组大鼠旋转圈数变化,免疫组织化学法检测中脑黑质Nurr1、TH蛋白表达,原位杂交法检测中脑黑质Nurr1mRNA、THmRNA表达.结果:与假手术组比较,模型组Nurr1、TH蛋白及其mRNA表达均显著降低;与模型组比较,各治疗组Nur1、TH蛋白及其mRNA表达均明显升高,旋转圈数显著降低;起效剂量为1g/kg,剂量范围为1g/kg～ 4g/kg.结论:龟羚帕安丸通过提高Nurr1表达,进而上调下游靶基因TH的表达,从而诱导神经干细胞分化为成熟多巴胺能神经元,并终转化为神经递质DA,可能是龟羚帕安丸治疗PD的作用机制之一.
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孤儿核受体NURR1在前列腺癌中的表达以及功能研究
目的 探讨孤儿核受体NURR1在前列腺癌中的表达水平及其对前列腺癌恶性进展的影响.方法 通过Oncomine分析NURR1在前列腺癌临床样本中的表达水平,并进一步通过Real-time检测NURR1在前列腺癌多细胞球以及VCaP-CRPC动物模型中的表达.另外,通过pLenti-puro慢病毒载体构建NURR1的过表达载体,上调前列腺癌细胞DU145以及LNCaP中NURR1的表达水平,检测其细胞表面干性标记物的表达以及多细胞球形成能力.结果 NURR1基因在前列腺癌临床样本中呈上调表达,而且在前列腺癌多细胞球以及VCaP-CRPC动物模型中进一步升高.过表达NURR1可以显著上调前列腺癌细胞表面干性标记物的表达并增强其多细胞球形成能力.结论 孤儿核受体NURR1基因的上调表达促进了前列腺癌细胞的的恶性进展,其有可能作为一个潜在的标记物和治疗靶点.
