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TCRVβ7.1重组腺病毒载体的构建
将TCRV β7.1基因克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中,再穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺病毒.然后用PCR,RT-PCR对其进行鉴定.
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共表达TCRα 12-2和TCRVβ 7.1重组腺病毒载体的构建及其杀伤肝癌细胞作用的研究
目的:构建共表达TCRα12-2和TCRVβ7.1重组腺病毒载体Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1,并研究其杀伤肝癌细胞的作用.方法:提取外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,用RT-PCR的方法得到TCRα12-2基因.TCRVβ7.1基因由pCDN3.1-Vβ7.1扩增获得,将这两个基因以IRES相连克隆入腺病毒穿梭质粒pDC315中.穿梭质粒和腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞,包装出可同时表达TCRα12-2和TCRVβ7.1的重组腺病毒.然后提取病毒基因组DNA,对外源目的基因进行PCR鉴定;病毒感染宫颈癌细胞(HELA),48小时后提取细胞总RNA,通过RT-PCR鉴定目的基因表达;后病毒感染PBMC,用流式细胞仪检测目的蛋白的表达.对鉴定正确的病毒进行大量扩增并测定滴度.用MTT比色法检测Ad.TCRα 12-2-IRES-Vβ7.1感染的PBMC对肝癌细胞HEPG2和BEL-7402的杀伤作用.结果:从重组病毒基因组中扩增出目的基因TCRα12-2和TCRVβ7.1,RT-PCR和流式细胞仅检测表明目的基因可以有效的表达.Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1感染PBMC组对肿瘤细胞的杀伤率明显高于PBMC组和Ad-GFP感染组.结论:成功构建了双表达TCRα12-2和TCRVβ7.1基因的重组腺病毒载体Ad.TCRα12-2-IRES-Vβ7.1,且其感染后的PBMC可有效的杀伤肝癌细胞.
