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shRNA抑制人肺癌细胞A549 SURVIVIN基因表达
目的 构建存活素(SURVIVIN)基因的短发夹RNA(shRNA)表达质粒,为肺癌RNA干扰(RNAi)途径的基因治疗打下基础.方法 设计并合成SURVIVIN短发夹结构模板序列,与穿梭载体重组质粒后转染人肺癌细胞A549,通过RT-PCR法筛选出抑制效果强的质粒;MTT和Western blot法检测该质粒对细胞增殖和SURVIVOIN表达的影响.结果 构建和筛选出抑制作用强的质粒;该质粒能明显抑制A549细胞的增殖和SURVIVIN的表达.结论 在RNAi的介导下,SURVIVIN的表达被下调,为肺癌的基因治疗提供实验依据.
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人MCHR2基因shRNA真核表达载体体外转染
目的 构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率.方法 根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率.结果 与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上.
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食管癌ECA109细胞中Survivin shRNA干扰对核因子κB表达的影响及调控机制
目的 探讨Survivin作为基因表达调控因子,对核因子κB(NF-κB)基因的转录及蛋白水平活性的影响及与NF-κB的调控关系.方法 采用Survivin短发夹RNA(shRNA)干扰技术,脂质体转染食管癌ECA109细胞,检测Survivin沉默效果,选择佳转染浓度;半定量RT-PCR检测Survivin shRNA干扰后食管癌ECA 109细胞中NF-κB及其通路的上游调控因子核因子κB抑制蛋白α(IKKα)、IKKβ表达变化;Western blotting方法检测NF-κB蛋白的表达变化;流式细胞术检测干扰之后食管痛ECA109细胞增殖、凋亡指数的变化.结果 Survivin shRNA干扰食管癌ECA109细胞后,Survivin mRNA和蛋白表达明显下调;NF-κB mRNA表达变化无明显差异,但其蛋白磷酸化水平降低,NF-κB上游因子IKKα、IKKβ mRNA表达下调;食管癌ECA109细胞凋亡明显增加,G2期细胞比例增加,S期细胞减少,细胞周期受阻.结论 Survivin通过在转录水平影响IKKα、IKKβ mRNA表达,调控NF-κB蛋白活化水平,提示Survivin在肿瘤信号调控网络中可作为一个新的基因表达调控因子.
关键词： 食管癌 survivin 短发夹RNA 反转录-聚合酶链反应 -
靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选
目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1(TREM-1)基因短发夹RNA(shRNA)真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组(A组)、转染空质粒载体pGCsi对照组(B组)、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组(C组)、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组(D组)和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组(E组),48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达([(1.945±0.252)×105比(1.010±0.194)×105,(1.933±0.216)×105比(1.202±0.171)×105,均P＜0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.
关键词： 髓样细胞表达的激发受体1 短发夹RNA 质粒 RNA干扰 基因表达 -
靶向AATF基因shRNA表达载体的构建及其稳定表达的白血病U937细胞系的建立
本研究旨在构建靶向AATF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的人白血病U937细胞系.根据GenBank数据库提供的AATF mRNA序列,以228～249、303 ～ 324、443 ～ 464位序列作为RNA干扰位点,排除同源可能,合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆至经BamHⅠ、HindⅢ双酶切线性化的pSilencer 3.1人H1启动子干扰载体中,利用测序鉴定所构建的重组载体是否正确,经电穿孔将3个重组载体(pSA-1、pSA-2、pSA-3)转染人白血病U937细胞系,G418(500 mg/L)有限稀释法持续筛选8周后,扩增获得稳定表达的细胞系；RT-PCR、Western blot分别检测稳定转染细胞系的AATF mRNA和AATF蛋白表达.结果表明,AATF干扰序列及读码框完全正确.稳定转染细胞AATF mRNA表达下调,AATF蛋白表达量下降(P＜0.05).结论:成功地构建AATF shRNA真核表达载体及AATF表达稳定抑制的白血病U937细胞系,为以AATF基因为靶点的人白血病进一步研究奠定了实验基础.
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Bmi-1沉默对K562细胞功能的影响
Bmi-1是一种转录抑制子,属于Polycomb家族成员之一.Bmi-1基因在调控正常或白血病干细胞的自我更新中起着至关重要的作用.缺乏Bmi-1表达的急性髓系白血病细胞遭遇了增殖阻止和表现了分化和凋亡的征兆,这些发现导致有人提议和认为Bmi-1在白血病治疗中可作为潜在靶点.本研究探讨靶向针对Bmi-1的短发夹RNA(shRNA)对人慢性髓系白血病K562细胞功能的影响.采用RNA干扰技术,构建靶向针对Bmi-1的shRNA真核表达载体,利用脂质体lipofactamine 2000将shRNA真核表达载体转染入K562细胞中,经G418(400 μg/ml)筛选得到抗性克隆.用PCR和Western blot分别检测转染shRNA后K562细胞中Bmi-1的mRNA和蛋白水平的变化;以MTT法检测干扰组、对照组和未转染组细胞间的增殖情况;以集落形成实验测定3组间集落形成能力.结果表明:在设计的4个shRNA片段中,有1个片段显示显著的抑制效果.该shRNA转染K562细胞后,在mRNA水平上Bmi-1的表达明显下调,Western blot在蛋白水平上也证实了Bmi-1表达显著下调.MTT法和集落形成实验显示了干扰组、时照组和未转染组细胞3者间的增殖能力没有显著差异.结论:抑制Bmi-1的表达并不能减少K562细胞的增殖,这提示了可能存在其它一些平行的信号通路在细胞转化中起重要作用,而且可能独立于Bmi-1的过表达.Bmi-1在慢性髓系白血病的转化中起着次要的作用.
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腺病毒递送BMI-1shRNA
近年来发展了一些质粒载体介导shRNA的转录,然后在细胞酶的作用下加工成功能性的siRNAs.虽然这些载体较化学合成的siRNA有更多的优点.但仍存在相当多的缺点,如转染效率低和不能在体内使用.本研究建立一种没有上述缺点的腺病毒递送BmihRNAs系统,设计靶向人Bmi-1的载体.以pAdTrack CMV质粒为模板扩增CMV-GFP表达盒,从pGEIBMIhRNA质粒上酶切下U6-BMI-1 shRNA表达盒,克隆它们入穿梭质粒pShuttle中,然后与pAdEasy-1质粒基因重组产生腺病毒质粒pAd-BMIhRNA-CVM-GFP,转染293A包装细胞,收获病毒.病毒感染K562细胞后,在mRNA和蛋白水平上分别用Real Time-PCR和Westem blot检测BMI的表达水平.结果表明:成功构建了pGEIBMIhRNA腺病毒质粒并有效包装出病毒.感染BmihRNA腺病毒的K562细胞在mRNA和蛋白水平上均显著下调了Bmi-1的表达,而时照病毒没有明显的效果.结论:腺病毒是一种有效递送siRNA入哺乳动物细胞的载体.腺病毒递送siRNA载体可能成为siRNA药物的基因治疗载体.
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靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体的构建与鉴定
本研究构建并鉴定靶向mdr-1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体.根据Genbank数据库提供的mRNA序列,选择设计3个能转录短发夹RNA(shRNA)的DNA序列,体外分别合成3对互补并编码mRNA基因的特异性shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BamHI和HindⅢ双酶切线性化的pGCsilencer人U6启动子质粒载体中;为了确定利用酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,采用脂质体转染的方法将构建好的3个重组载体(pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3)导入慢性髓系白血病耐药细胞株K562/A02,采用实时PCR方法检测转染细胞的mdr-1基因表达,Western-blot检测P-gp表达量的变化.结果表明:应用PCR电泳图谱和测序证实了克隆RNAi打靶序列完全正确,而且该载体又同时表达GFP标记基因,用于测定转染效率.分别转染pGY1-1,pGY1-2,pGY1-3后K562/A02细胞的mdr-1基因表达和P-gp表达水平下降,证明shRNA可以特异性沉默mdr-1基因.结论:靶向mdr-1基因shRNA真核表达载体构建成功,为进一步研究mdr-1基因在K562/A02细胞中的作用奠定了实验基础.
关键词： mdr-1基因 短发夹RNA K562/A02细胞 载体构建 -
PAMAM纳米载体介导pCTGF-shRNA抑制小鼠腹膜间皮细胞CTGF的表达
目的 研究G9 PAMAM纳米载体介导的结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA(shRNA)质粒(pCTGF-shRNA)对小鼠腹膜间皮细胞CTGF表达的影响.方法 设计并构建质粒pCTGFl-shRNA、pCTGF2-shRNA和阴性对照pHK-shRNA;应用G9 PAMAM将质粒分别转染4.25%葡萄糖刺激下的第3代小鼠腹膜间皮细胞;采用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测细胞CTGF mRNA水平,采用Western Blot检测CTGF蛋白含量.结果 4.25%葡萄糖可刺激小鼠腹膜间皮细胞CTGF的mRNA和蛋白表达明显上调.pCTGFl-shRNA转染组和pCTGF2-shRNA转染组的CTGF表达较高糖组明显下调(P＜0.05),尤其以pCTGF2-shRNA组显著.pHK-shRNA转染组与高糖组比较,差异无显著性(P＞0.05).结论 G9 PAMAM纳米载体可介导pCTGF-shRNA转染原代小鼠腹膜间皮细胞,并能抑制高糖诱导的CTGF表达上调,提示PAMAM介导的pCTGF-shRNA可有效地用于腹膜纤维化的基因治疗.
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短发夹RNA靶向抑制环氧化酶-2基因表达对肺癌细胞A549增殖的影响
目的 评价短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)靶向肺癌细胞A549环氧化酶-2(COX-2)基因表达的抑制作用,并观察对肺癌细胞A549生长和细胞周期的影响.方法 将抑制COX-2基因的shRNA DNA模板插入到真核表达载体pGenesil-1的U6启动子下游,构建靶向抑制COX-2基因的重组表达载体pshRNA-COX-2.将试验分为3组:未转染肺癌细胞A549组、阴性对照HK组和pshRNA-COX-2转染组.用脂质体LipofectamineTM2000转染肺癌细胞A549,逆转录(RT)-PCR和免疫印迹法(Wb)分别检测COX-2基因mRNA和蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞周期,细胞计数检测细胞生长变化.结果 与阴性对照组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体抑制COX-2 mRNA及蛋白表达的抑制率分别为72.2%和48.6%;Go-G1期细胞由63.7%上升为71.0%,S期细胞由26.5%下降为20.0%;细胞生长明显减慢.结论 pshRNA-COX-2重组表达载体能显著抑制肺癌细胞COX-2表达,引起G0-G1期细胞增多,S期细胞减少,从而抑制肺癌细胞生长.
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重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响
目的:观察以重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制和表达的影响.方法:将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的2个ITR(inverted terminal repeat,ITR)之间,之后接有HBV的基本核心启动子(bacic core promoter,BCP)及其驱动的AAV的Rep基因,构成rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体,转染HepG2.2.15细胞(肝细胞性肝癌细胞插入乙型肝炎病毒基因),测定上清液中第1天、第2天、第3天及第10天HBsAg、HBeAg 表达及HBV DNA拷贝数,并对细胞基因组AAVS1区域进行测序.结果:成功构建了含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322-324、PLRBR522-324、PLRBR322-2424、PLRBR522-2424.体外质粒转染细胞实验显示4个载体对HBsA g、HBeAg表达及HBV DNA复制均有抑制效应,且前两者对HBsAg高一些、后两者对HBeAg高一些,第3个对HBV DNA拷贝数高一些.转染后第3天后抑制效应明显,第10天抑制率仍较高.针对细胞基因组AAVSl区域测序结果显示,目的序列定点整合于该区域.结论:利用AAV和HBV各种元件构建的rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,借助Rep蛋白介导的定点整合作用,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题做了一些技术上的探索.
关键词： RNA干扰 短发夹RNA rAAV HepG2.2.15细胞 定点整合 -
shRNA干扰SMYD3对肝癌细胞c-Myc表达及凋亡的影响
目的:观察SMYD3(SET and MYND-domain containing 3)基因沉默后c-Myc的表达及对HepG2细胞凋亡的影响.方法:构建针对SMYD3的shRNA干扰质粒Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2和阴性对照质粒Pgenesil-1-hk,同时设空白对照组,采用Lipofectamine2000脂质体介导转染法转染质粒.转染后24、48、72 h,RT-PCR检测HepG2细胞SMYD3和c-Myc的表达情况.流式细胞术法检测各组细胞的凋亡.结果:SMYD3、c-Myc基因在HepG2细胞中强表达.RT-PCR显示Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2转染组与阴性对照质粒转染组Pgenesil-1-hk转染24、48、72 h后相比,SMYD3基因表达均明显受到抑制 (F=67.46,P<0.01:F=176.79,P<0.01;F=175.28,P<0.01),同时c-Myc表达下调(三组之间:F=11.58,P=0.009; F=126.41,P<0.01;F=261.25,P<0.01).Pgenesil-1-s1、Pgenesil-1-s2转染组细胞早期凋亡率与Pgenesil-1-hk转染组 (LSD-t=-13.58,-12.62,均P<0.01)、空白组(LSD-t=-18.62,-17.67,均P<0.01)相比有显著性差异.结论:RNA干扰技术特异性沉默HepG2细胞SMYD3基因后,抑制了c-Myc的表达,促进了HepG2细胞的凋亡.
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shRNA沉默干扰HMGA2基因对胃癌细胞株MKN-45的增殖与凋亡的影响
目的:观察小分子RNA(shRNA)沉默后HMG-A2基因在胃癌细胞株MKN-45的表达,并探讨HMGA2基因对胃癌细胞的增殖与凋亡的影响.方法:构建针对人HMGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45.用细胞免疫组化的方法观察转染72 h后HMGA2的蛋白表达水平,以MTT比色法、流式细胞术检测转染后MKN-45细胞的生长增殖、凋亡的情况.结果:转染HMGA2-shRNA组的蛋白表达强度(171.34±19.61)明显弱于scrambled组(143.48±19.04)和空白对照组(141.79±18.09,P＜0.05),较之scrambled组(5.66％±0.63％)和空白对照组,HMGA2-shRNA组(39.32％±2.37％)能明显抑制细胞的增殖(P＜0.05),HMGA2-shRNA组的凋亡率(39.67％±2.35％)与scrambled组(4.29％±1.33％)和空白对照组(5.05％±1.84％)相比明显增加(P＜0.05).结论:靶向HMGA2基因的shRNA可以有效抑制人胃癌MKN-45细胞的生长,并促进细胞的凋亡,HMGA2可能是胃癌治疗的一个潜在靶点.
关键词： 高迁移率蛋白A2 短发夹RNA 胃癌细胞株MKN-45 细胞增殖 细胞凋亡 -
沉默干扰HMGA2对胃癌细胞Wnt/β-Catenin信号转导通路的影响
目的:观察小分子RNA沉默HMGA2在胃癌细胞株MKN-45的表达,研究HMGA2对Wnt/β-Catenin通路中主要分子β-Catenin以及下游靶分子c-myc、Cyclin D1的表达量及转录活性的影响,探讨HMGA2对Wnt/β-Catenin信号转导通路的影响.方法:构建针对人MGA2基因的shRNA真核表达载体,瞬时转染人胃癌细胞株MKN-45,用RT-PCR、Western blot分别检测转染后shHMGA2组、scrambled组和空白对照组细胞中HMGA2 mRNA和蛋白的表达情况,评估抑制效应；分别检测转染后3组细胞中的β-Catenin、c-myc、Cyclin D1 mRNA和蛋白的表达水平.结果:转染48 h后shHMGA2-1组的HMGA2mRNA相对表达量(0.58±0.07),与shHMGA2-2组(0.92±0.13)、shHMGA2-3组(0.90±0.16)、scrambled组(1.07±0.14)及空白对照组(1.19±0.09)相比有统计学意义(P＜0.05),其他4组相比无统计学意义(P＞0.05)；转染48 h后shHMGA2-1组的HMGA2沉默效果好,HMGA2 mRNA表达明显下降,抑制率51.3％；故选用质粒shHMGA2-1继续后续实验；Western blot结果显示转染72 h后shHMGA2-1组HMGA2蛋白相对表达量为(0.11±0.03),与scrambled组(0.48±0.12)及空白对照组(0.55±0.08)相比有统计学意义(P＜0.05),HMGA2蛋白表达明显下降,抑制率80％；沉默干扰HMGA248 h和72 h后,β-Catenin mRNA和蛋白表达水平在空白对照组(1.07±0.02,0.69±0.04)与scrambled组(0.91±0.02,0.67±0.10)中无明显差异(P＞0.05),而shHMGA2-1组(0.53±0.04,0.44±0.05)较之两组有明显的下降(P＜0.05)；shHMGA2-1组中c-myc mRNA和蛋白相对表达量为(0.39±0.04,0.25±0.07)较之空白对照组(0.88±0.05,0.75±0.09)、scrambled组(0.84±0.03,0.66±0.l0)有明显下降(P＜0.05),后两组相比较无统计学意义(P＞0.05)；shHMGA2-1组中Cyclin D1 mRNA和蛋白相对表达量为(0.31±0.02,0.12±0.01)较之空白对照组(0.52±0.03,0.73±0.12)、scrambled组(0.51±0.01,0.63±0.07)有明显下降(P＜0.05),后两组相比较无统计学意义(P＞0.05).结论:RNAi载体能有效地抑制HMGA2在胃癌细胞株MKN-45中的表达,沉默干扰HMGA2抑制了Wnt/β-Catenin通路中的主要分子β-Catenin以及下游靶分子c-myc、Cyclin D1的表达,HMGA2基因可能是通过调控Wnt/β-Catenin通路对胃癌细胞生长和凋亡发挥作用的.
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短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响
目的:研究短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人胰腺癌细胞PANC-1中突变型K-ras基因表达的抑制作用.方法:构建特异性针对胰腺癌PANC-1细胞突变型K-ras基因的重组质粒pGensil-1-P1,阴性对照质粒pGensil-1-HK并采用脂质体介导的方法转染胰腺癌细胞.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测K-ras基因mRNA和蛋白的表达,CCK-8方法测量细胞生长曲线.并建立人胰腺癌细胞PANC-1裸鼠皮下移植瘤模型,分别注射Pgenesil-1-P1、Pgenesil-1-HK质粒,动态观察并处死裸鼠计算肿瘤体积.结果:测序证实质粒表达载体构建成功,短发夹RNA(shRNA)使胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因的mRNA较未治疗组、阴性对照组相比明显减少(P=0.01);未治疗组、阴性对照组及治疗组的K-ras蛋白表达率分别为100%,99.0%±0.73%,39.9%±2.1%,前两组K-ras蛋白表达差异无统计学意义,治疗组较未治疗组K-ras蛋白表达下调了约60.1%;细胞生长受到明显抑制(P=0.02);经重组质粒治疗14 d后,裸鼠皮下移植瘤生长缓慢,相较于对照组瘤体明显缩小(P=0.03).结论:shRNA对特异性转染组的胰腺癌细胞的突变K-ras基因表达有抑制作用,使细胞以及裸鼠移植瘤的生长受到抑制.
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3T3-L1细胞中FoxO1基因沉默对高分子量脂联素表达的影响
目的 观察其受抑制后对二硫键A氧化还原酶样蛋白(disulfide-bond A oxidoreductase-like protein,DsbA-L)和高分子量(high molecular weight,HMW)脂联素表达的影响.方法 利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)构建慢病毒载体,沉默3T3-L1细胞的叉头状转录因子Ol(fork head box transcription factor O1,FoxO1)基因,建立携带shRNAFoxO1的慢病毒载体,用qPCR和Western blot 法从基因和蛋白水平筛选出佳干扰效果的shRNA-FoxO1慢病毒载体.在后续实验中利用此FoxOl-shRNA慢病毒载体沉默3T3-L1 FoxO1基因,通过Western blot检测DsbA-L、HMW脂联素的表达.结果 在3T3-L1细胞中筛选出shRNA-1组对oxO1基因的表达的沉默效果佳,抑制率达到60％以上(与对照组相比,基因相对表达量1.04±0.04 vs 0.37±0.05,P＜0.001);在后续实验选用shRNA-1干预3T3-L1细胞,用Western blot检测,并与对照组比较,结果FoxO1蛋白表达显著减少(与GAPDH光密度比值分别是1.02±0.08和0.38±0.08,P＜0.001),而DsbA-L和HMW表达明显增加(DsbA-L与GAPDH光密度比值分别是0.28±0.06和0.53±0.07,P=0.009;HMW脂联素与GAPDH光密度比值分别是0.05±0.02和0.11±0.03,P=0.043).结论 在3T3-L1细胞中,沉默FoxO1基因后可促进DsbA-L和HMW脂联素的表达.
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HER-2基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析
目的:利用RNA干扰(RNAi)技术,以HER-2为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定.方法:设计具有短发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定.再转染人大肠癌HT29细胞,进行荧光摄像和G418抗性筛选.结果:将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列.结论:HER-2靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,并可以进行稳定筛选.
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CTGF靶向RNA干扰重组体的构建及序列分析
目的:利用pEGFP质粒载体构建介导结缔组织生长因子(CTGF)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的质粒.方法:分别设计3对有小发夹结构的两条DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子的质粒载体pEGFP中,构建重组体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果:CTGF的sRNA片段被成功克隆到pEGFP质粒载体中,3个重组质粒shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切与测序证实构建成功.结论:成功构建了能表达CTGF shRNA的重组体,为下一步探索肝纤维化基因治疗的新途径打好基础.
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腺病毒介导的靶向P85和Akt1短发夹RNA对人胃腺癌细胞生长抑制作用的研究
目的 构建靶向P85和蛋白激酶B1(PKB1/Akt1)的短发夹RNA(shRNA)腺病毒载体,研究其对人胃腺癌细胞SGC-7901生长的抑制效果.方法 构建腺病毒载体rAd5-P+A,体外转染SGC-7901细胞后,以实时定量PCR和Western blot分别检测P85和Akt1的mRNA和蛋白质的表达.以噻唑蓝比色分析法(MTT法)和流式细胞法评价转染后胃癌细胞的增殖活性.构建裸鼠皮下荷瘤模型进一步观察rAd5-P+A对SGC-7901细胞生长的抑制效果,并应用原位末端标记技术(TUNEL法)检测肿瘤细胞的凋亡情况.结果 成功构建的rAd5-P+A重组腺病毒载体转染SGC-7901细胞后可显著抑制p85和Akt1的mRNA表达,而P85和Aktl蛋白表达量在转染48 h、72 h后分别下调57.5%、63.7%和67.8%、75.6%,与空白对照组和通用腺病毒对照(rAd5-HK)组相比,差异具有统计学意义(P=0.005,P=0.003).与空白对照组和rAd5-HK组相比,SGC-7901细胞的增殖活性在rAd5-P+A转染后第2天明显下降(P<0.001),且rAd5-P+A转染组进入S期的细胞数减少了5.9%～7.1%,而进入G0/G1期的细胞增加了12.1%～13.7%.裸鼠皮下荷瘤模型治疗实验也显示,rAd5-P+A可抑制胃癌细胞的生长,诱导细胞的凋亡.结论 腺病毒介导的靶向P85和Akt1的shRNA可抑制人胃腺癌细胞的生长,这可能为胃腺癌靶向性联合基因治疗提供新的策略.
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沉默Cdc42对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响
目的 探讨Cdc42-shRNA重组质粒对肝癌细胞SMMC-7721增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响.方法 Cdc42-shRNA重组质粒及空载体转染人肝癌细胞株SMMC-7721,建立Cdc42-shRNA组和对照组U6-control.采用MTT法检测细胞增殖情况,划痕愈合实验测定细胞迁移能力,Transwell法观察细胞的侵袭能力,免疫印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)和甲胎蛋白(AFP)表达水平.建立裸鼠皮下人肝癌移植瘤模型,观察裸鼠成瘤情况,免疫组化法检测裸鼠瘤块中Cdc42的表达情况.组间数据两两比较采用t检验.结果 MTT尿实验结果显示,Cdc42-shRNA2组、U6-contol组和SMMC7721组细胞倍增时间分别为42.7、34.9、35.1h;划痕实验结果显示,转染Cdc42-shRNA2组和U6-control组细胞36 h相对迁移距离分别为(47.1±4.1)％和(86.6±5.3)％,差异有统计学意义(t=-10.21,P＜0.05);Transwell法检测结果显示,Cdc42-shRNA2组24 h穿膜细胞数为(18.2±2.1)个,低于U6-control组的(41.0±3.5)个(t=-9.67,P＜0.05);与对照组相比,Cdc42-shRNA组细胞的AFP和PCNA的蛋白表达水平降低;裸鼠成瘤实验结果显示,接种28 d后Cdc42-shRNA2组平均肿瘤重量分别为(335.1±178.2) mg,低于SMMC-7721组的(925.3±241.4)mg和U6-contol组的(910.5±225.6)mg(t=-4.47、-4.39,P＜0.05).免疫组化结果显示Cdc42蛋白在肝癌细胞质内广泛表达.其中SMMC7721组及U6-control组呈强阳性表达;SMMC7721/Cdc42-shRNA2组呈弱阳性表达.结论 沉默Cdc42表达,可以降低人肝癌细胞种植瘤的增殖、迁移及侵袭能力,抑制肿瘤细胞生长.
