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槐定碱体外抗乙肝病毒的实验研究
目的 观察槐定碱对HepG 2.2.15细胞分泌HbsAg、HBeAg和Pre-S1的影响,探讨槐定碱的体外抗乙型肝炎病毒作用.方法 采用HepG 2.2.15细胞模型进行体外培养,给予不同浓度槐定碱,作用9天后收集上清液,用MTT法观察槐定碱对HepG 2.2.15细胞的抑制作用,用ELISA法检测上清液中HBsAg、HBeAg和Pre-S1的分泌,观察药物对HepG 2.2.15细胞分泌HBV病毒抗原的影响,从而评价药物的抗HBV作用.结果 槐定碱对HepG 2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)为6.86E-3M.在该浓度下对HBsAg和HBeAg的50%抑制浓度(IC50)分别为0.339 mmol和0.356 mmol,治疗指数分别为20.21和19.26;浓度为0.001 mmol时对Pre-S1的抑制率为62.20%.结论 :槐定碱具有一定的抗HBV作用,属低毒有效药物.
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氧化苦参碱体外抗乙型肝炎病毒作用
目的:体外观察氧化苦参碱(OM)抗乙型肝炎病毒(HBV)作用,并初步探讨其作用机制.方法:用125,250,500,1000,2000 mg·L-1OM连续作用于90％汇合度的HepG2.2.15细胞9d,以MTT比色法观察药物细胞毒性；用酶联免疫法测定细胞上清液中乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg),乙型肝炎病毒s抗原(HBsAg)；采用荧光定量PCR法(FQ-PCR)测定细胞上清液中HBV DNA,细胞中HBV DNA和共价闭合环状DNA(cccDNA).结果:OM对细胞内HBV DNA和cccDNA,以及细胞外HBV DNA均有抑制作用,随着浓度升高抑制作用加强,2000 mg·L-1OM对细胞内HBV DNA,cccDNA和细胞外HBV DNA的抑制率分别为64.56％,52.12％,54.25％；对HBsAg和HBeAg的分泌也有抑制作用,且浓度越高、处理时间越长,抑制作用越明显；在相同条件下对HBsAg的抑制作用强于HBeAg,OM浓度为2000 mg·L-1时对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为51.59％,17.88％.结论:OM能有效抑制HepG2.2.15细胞中HBV复制,该作用是抑制病毒核酸复制和基因表达的结果.
关键词： 氧化苦参碱 乙型肝炎病毒 HepG2.2.15细胞 -
毛鸡骨草醇提液对HepG2.2.15细胞乙型肝炎表面抗原及乙型肝炎E抗原的影响
目的:观察毛鸡骨草体外抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法:采用MTT法检测毛鸡骨草对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度(TC50)和大无毒浓度(TC0),采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定＜TC0的5个不同浓度的毛鸡骨草醇提液对HepG2.2.15细胞株表达的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎E抗原(HBeAg)的影响.结果:毛鸡骨草醇提取液可有效地抑制细胞HBsAg和HBeAg的分泌；在质量浓度为4 g·L-1作用144 h对HBsAg,HBeAg抑制作用为明显,抑制率分别为33.1％,40.1％.结论:毛鸡骨草在体外有一定的抗HBV作用.
关键词： 毛鸡骨草 HepG2.2.15细胞 乙型肝炎表面抗原 乙型肝炎E抗原 -
蜗牛多糖体外抗乙型肝炎病毒作用研究
目的:探讨蜗牛多糖抗乙肝病毒活性.方法:将不同浓度蜗牛多糖与HepG2.2.15细胞株共培养,以拉米夫定为阳性对照药,用ELISA法检测HBsAg和HBeAg分泌水平,实时荧光定量PCR检测HBV DNA含量,计算抑制率.结果:蜗牛多糖在体外能有效抑制HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg分泌,大抑制率分别为42.8%和52.1%;对HBV DNA的复制有一定抑制作用(P<0.05).结论:蜗牛多糖在体外具有显著的抗乙型肝炎病毒作用,且毒性较小,具有良好应用前景.
关键词： 蜗牛多糖 HepG2.2.15细胞 乙型肝炎病毒 -
HepG2.2.15细胞对同时包载丁香苦苷和羟基酪醇纳米粒的摄取机制研究
目的 考察HepG2.2.15细胞对同时包载丁香苦苷和羟基酪醇纳米粒(nanoparticles co-loaded with syringopicroside and hydroxytyrosol,SH-NPs)的摄取机制.方法 采用沉淀法制备SH-NPs,以异硫氰酸荧光素为荧光标记物,采用流式细胞仪研究HepG2.2.15细胞对SH-NPs的摄取机制.结果 秋水仙素为抑制剂,孵育时间在0.5~24 h范围内,阳性细胞百分数由1.9%增加到56.4%;药物浓度为125、250、500 μg/mL时,阳性细胞百分数分别为4.9%、3.4%、3.9%.氯喹为抑制剂,孵育时间在0.5~24 h范围内,阳性细胞百分数由7.4%增加到55.4%;药物浓度为125、250、500 μg/mL时,阳性细胞百分数分别为19.5%、22.5%、27.6%.结论 秋水仙素与氯喹对HepG2.2.15细胞摄取有抑制作用,且HepG2.2.15细胞对SH-NPs的摄取与药物浓度、孵育时间呈正相关,推断HepG2.2.15细胞对SH-NPs细胞的摄取机制为非特异性吸附内吞.
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松果菊苷对乙肝病毒复制和抗原表达的影响
以HBV基因转染的HepG2.2.15细胞为体外模型,研究松果菊苷对乙肝病毒(HBV)复制和抗原表达的影响,采用ELISA法测定细胞上清乙肝表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)水平;采用荧光定量PCR法检测HBV DNA水平.以HBV转基因小鼠为体内模型,研究松果菊苷对HBV复制的影响,首先采用荧光定量PCR法检测转基因小鼠肝组织HBV DNA水平,采用ELISA法检测小鼠血清HBsAg和HBeAg水平;同时检测血清转氨酶水平和肝组织病理变化;然后将HBV表达阳性的转基因小鼠随机分为5组:对照组、拉米夫定(50 mg·kg-1)组和松果菊苷高、中、低剂量(50,25,12.5 mg·kg-1)组.每天灌胃给药1次,连续给药30 d.第31天分离小鼠血清检测HBV DNA,HBsAg和HBeAg水平;提取肝组织DNA测定其HBV DNA水平,同时作肝组织病理检查.结果表明:松果菊苷在50,100 mg·L-1作用HepG2.2.15细胞6d后能显著抑制HBsAg和HBeAg表达,其高抑制率分别为42.68％,46.29％;同时在100 mg·L-1对HBV DNA具有抑制作用.此外,松果菊苷在50mg· kg-1剂量时能显著抑制HBV转基因小鼠HBsAg与HBeAg表达,其抑制率分别为42.82％,29.12％,同时对转基因小鼠血清HBV DNA水平有显著抑制作用.提示松果菊苷对HBV复制和抗原表达具有较强抑制作用.
关键词： 松果菊苷 乙肝病毒 HepG2.2.15细胞 转基因小鼠 -
丹参素靶向乙肝病毒逆转录酶抗乙肝及抗原表达影响机制研究
该文采用MTT法测定丹参素对转染人肝癌细胞株(HepG2)的2.2.15细胞活性的抑制作用,通过间接荧光标记法测定细胞内活性氧水平的变化;采用ELISA法测定细胞上清乙肝表面抗原(HBsAg)和E抗原(HBeAg)水平,采用荧光定量PCR法检测HBV DNA水平;利用酶抑制动力学方法,研究了丹参素对HBV RT的抑制作用;后利用圆二色谱法监测丹参素对HBV逆转录酶二级结构的影响.结果显示丹参素能够对HepG2.2.15细胞的生长起到良好的抑制作用,半抑制浓度IC50为(15.35±2.43)μmol·L-1;丹参素能显著抑制HBsAg和HBeAg表达,同时对HBV DNA复制具有抑制作用;此外,丹参素是一种有效的HBV逆转录酶抑制剂[半抑制浓度IC50为(21.32±2.43)μmol·L-1],荧光标记法检测,细胞内活性氧水平随着丹参素呈浓度依赖性升高;圆二色谱分析表明丹参素诱导HBV逆转录酶的构象发生部分改变,α-螺旋含量逐渐增加.结果表明丹参素能够通过结合HBV逆转录酶,诱导酶的结构变得紧密,而不利于活性中心的形成,终使HBV逆转录酶活性降低.而这种诱导酶的活性降低直接影响到乙肝病毒DNA的复制,加之抗原水平的降低,增加了丹参素抗乙肝病毒的药效.
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HepG2.2.15用于中药复方治疗乙型肝炎研究的相关问题探讨
本课题组前期完成了经方小柴胡汤含药血清对HepG2.2.15细胞干预作用的相关研究,在HepG2.2.15用于中药复方治疗乙型肝炎研究过程中摸索出一些经验,现就此细胞培养及相关血清药理学运用等方面内容与心得进行回顾与总结,以期为同仁提供参考与借鉴.
关键词： HepG2.2.15细胞 中药复方 含药血清 乙型肝炎 -
HepG2.2.15细胞模型功能的重新评价:分泌HBV DNA、cccDNA及血清学标志物的动态变化研究
目的 研究HepG2.2.15细胞分泌特点及动态变化,建立稳定的抗HBV药物筛选平台.方法 采用微量细胞培养法培养HepG2.2.15细胞株,于第3、6、9、12、15d收集培养上清液,采用ELISA方法检测preS1、HBsAg和HbeAg,采用Abbot试剂盒定量检测HBV DNA,采用Roche荧光定量PCR试剂盒检测HBV cccDNA.结果 HepG2.2.15细胞分泌preS1、HBsAg、HBeAg、HBV DNA的量随着细胞培养时间的延长逐渐增加,其中HBsAg在第9d达到分泌高峰,其余均在第12d达到分泌高峰.HBV cccDNA在第9d检测值仍为0,第12d时检测值达24×103copies/ml.结论 HepG2.2.15细胞具有稳定的分泌HBV病毒及相关抗原的生物学功能,是比较理想的病毒复制及抗HBV DNA药物筛选的细胞模型.本研究所用细胞株及实验方法可靠、稳定且重复性好,适用于抗HBV药物筛选等研究.
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重组腺相关病毒介导的RNA干扰对乙型肝炎病毒复制和表达的影响
目的:观察以重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对HepG2.2.15细胞中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)复制和表达的影响.方法:将hu6驱动的shRNA表达框置于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)的2个ITR(inverted terminal repeat,ITR)之间,之后接有HBV的基本核心启动子(bacic core promoter,BCP)及其驱动的AAV的Rep基因,构成rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的质粒载体,转染HepG2.2.15细胞(肝细胞性肝癌细胞插入乙型肝炎病毒基因),测定上清液中第1天、第2天、第3天及第10天HBsAg、HBeAg 表达及HBV DNA拷贝数,并对细胞基因组AAVS1区域进行测序.结果:成功构建了含目的序列的rAAV质粒载体PLRBR322-324、PLRBR522-324、PLRBR322-2424、PLRBR522-2424.体外质粒转染细胞实验显示4个载体对HBsA g、HBeAg表达及HBV DNA复制均有抑制效应,且前两者对HBsAg高一些、后两者对HBeAg高一些,第3个对HBV DNA拷贝数高一些.转染后第3天后抑制效应明显,第10天抑制率仍较高.针对细胞基因组AAVSl区域测序结果显示,目的序列定点整合于该区域.结论:利用AAV和HBV各种元件构建的rAAV,作为抗HBV的shRNA表达框的载体,借助Rep蛋白介导的定点整合作用,为解决RNAi抗HBV作用时间短暂的问题做了一些技术上的探索.
关键词： RNA干扰 短发夹RNA rAAV HepG2.2.15细胞 定点整合 -
人肝癌细胞系HepG2与HepG2.2.15差异HLA结合肽的分离与鉴定
目的:分离并鉴定整合表达HBV的人肝癌细胞系HepG2.2.15及其母细胞系HepG2的差异HLA Ⅰ类分子结合肽,寻找与HBV感染相关的HLA结合肽.方法:洗涤法得到HepG2和HepG2.2.15细胞表面的HLA Ⅰ类分子及与其结合的肽段.效液相色谱(HPLC)对两种细胞的洗脱肽段进行分离和图谱比较,挑选出HepG2.2.15特有的峰段进行纳升电喷雾串联质谱(nanoESI-MS/MS)分析,结合MASCOT数据库检索和从头测序,分析多肽的序列和来源.后采用RT-PCR法进行mRNA表达检测.结果:HPLC对比显示HepG2和HepG2.2.15的HLA结合肽存在显著差异.利用nanoESI-MS/MS技术从HPLC差异峰段中分离鉴定出一条来源于已知蛋白人烯醇酶-1(enolasel,ENO1)的多肽SPDDPSRYISPDQ.RT-PCR结果显示,ENO1在HepG2和HepG2.2.15细胞中均有表达,且在HepG2.2.15细胞中表达明显高于HepG2细胞.结论:来自ENO1的多肽SPDDPSRYISPDQ能够被HLA Ⅰ类分子提呈到HepG2.2.15细胞表面,且ENO1 mRNA在HepG2.2.15细胞中的表达显著高于HepG2细胞.提示HBV感染可能引起ENO1表达上调.
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苦参碱与氧化苦参碱体外抗乙肝病毒的比较
目的:观察苦参碱与氧化苦参碱对HepG2.2.1 5细胞分泌HBsAg,HBeAg和Pre-S1的影响,探讨其体外抗乙型肝炎病毒作用.方法:采用HepG2.2.1 5细胞模型进行体外培养,给予不同浓度苦参碱与氧化苦参碱,作用9 d后收集上清液,用MTT法观察药物对HepG2.2.15细胞的抑制作用,用ELISA法检测上清夜中HBsAg,HBeAg和Pre-S1的分泌.结果:苦参碱与氧化苦参碱在浓度为0.001mol/L以下时对HepG2.2.1 5的生长抑制作用较小(低于25%).在浓度为1000 μmol/L到0.1 μmol/L之间,苦参碱和氧化苦参碱对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg的抑制率均高于50%,而对HBeAg的抑制率均低于50%;浓度为0.001 mol/L时对Pre-Sl的抑制率分别为53.58%、59.33%.结论:苦参碱与氧化苦参碱均具有一定的抗HBV作用,两者无显著差别,且对HBsAg和Pre-S1的抑制效果优于拉米夫定.
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靶向ASGPR1的外源性microRNA对HBV表达和复制的抑制作用
目的:设计并构建ASGPR1靶向的mieroRNA表达载体,观察其对ASGPR1基因的抑制作用及其在HBV感染基因治疗中的应用价值.方法:以ASGPR1为靶基因.设计并构建3个针对ASGPR1不同位点的microRNA表达栽体.通过脂质体方法转染HepG2.2.15细胞,RTPCR和Western blot检测其对ASGPR1 mRNA和蛋白的抑制作用,乙肝五项定量和HBVDNA检测其对HBV的抑制作用.结果:ASGPR1 mRNA和蛋白的平均水平分别下降了57.3%和49.8%(P＜0.01);在病毒水平3种amiRNA均能明显抑制相应细胞株中HBsAg和HBeAg的分泌,其中以amiRNAASGPR1-610抑制作用强,对培养72 h的细胞上清中的HBsAg和HBeAg抑制率分别为31.3%和33.6%(P＜0.01),HBV DNA的抑制率为29.7%(P＜0.01).结论:靶向ASGPR1的外源性microRNA能显著抑制靶基因的表达,进而抑制HBV的复制和表达.ASGPR1可以作为慢性HBV感染基因治疗的候选靶点.
关键词： 乙型肝炎病毒 RNA干扰 microRNA HepG2.2.15细胞 -
中药提取物人衔草对乙型肝炎病毒的抑制作用
目的:观察复方制剂祛毒增宁胶囊(ZL-1)药物有效组分人衔草(JH)与HB sAg蛋白的结合情况,及其体内外抗乙型肝炎病毒的作用.方法:HepG2.2.15与不同浓度JH共培养,采用ELISA法HBsAg和HBeAg的分泌情况.建立鸭乙型肝炎病毒感染模型,以不同剂量JH进行治疗,观察鸭血清乙型肝炎病毒DNA(DHBVDNA)的变化.结果:JH作用于HepG2.2.15细胞8 d后,对细胞的半数毒性浓度(TC50)为1126.01 mg/L,对HBsAg和HBeAg分泌量的的半数抑制浓度(IC50)分别为17.52 mg/L和754.26 mg/L,对HBsAg和HBeAg的治疗指数(TC50/IC50)分别为64.27和1.49.JH 0.8 g/kg能降低感染鸭血清DHBV-DNA水平,给药后5、10 d和停药后3 dDHBV-DNA吸光度(A)值分别为0.660±0.07,0.632±0.03,0.663±0.05,与盐水组0.872±0.08比较,有显著性差异(P＜0.05).结论:JH有抑制乙肝病毒的作用.
关键词： 乙型肝炎病毒 HepG2.2.15细胞 人衔草 拉米夫定 -
阿德福韦酯持续干预对HepG2.2.15细胞经典耐药突变的诱导作用
目的 观察HepG2.2.15细胞在不同浓度阿德福韦酯(ADV)持续诱导下发生经典耐药突变的情况,并探讨其产生耐药的机制.方法 用不含或含0.01、0.1、1.0μmol/L ADV的培养基于12孔板中培养HepG2.2.15细胞,每3d传代,共培养至110代,分别抽提细胞和上清中的HBV DNA,每10代取样1次.以不降解质粒的ATP依赖性DNA酶消化+滚环扩增+跨缺口PCR方法和单管巢式PCR方法分别扩增细胞内HBV cccDNA和上清中HBV DNA的反转录酶(RT)区.以PCR产物直接测序结合克隆测序法(20个克隆/样本)分析细胞内HBV cccDNA和上清HBV DNA的RT区是否产生经典ADV耐药突变.结果 未经药物处理的对照组持续稳定表达HBV DNA.0.01 μmol/L ADV组和0.1 μmol/L ADV组随着ADV干预时间的延长,细胞内总HBV DNA、cccDNA及上清中HBV DNA的载量持续下降.0.01 μmol/L ADV组细胞内和上清中至110代仍未检测出耐药变异,0.1μmol/L ADV组细胞内和上清中在110代时检测到RT区发生rtA181V+N236T变异.1.0 μmol/L ADV组由于细胞生长受到抑制于第15代时停止培养.结论 HepG2.2.15细胞内存在HBV cccDNA循环池,用含适量浓度ADV的培养基持续培养可以诱导HepG2.2.15细胞发生经典耐药突变.
关键词： 阿德福韦酯 HepG2.2.15细胞 共价闭合环状DNA 耐药变异 -
关键词：
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空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞HBsAg和HBeAg表达的影响
目的 研究空心莲子草总黄酮对乙肝病毒的体外抑制作用.方法 将HepG2.2.15细胞接种于细胞培养板,然后随机分为阴性对照组、实验组和阳性对照组.阴性对照组用100 mL/L DMSO处理;各实验组分别加入800、400、200、100 mg/L的空心莲子草总黄酮,阳性对照组用800、400、200、100 mg/L的拉米夫定共培养;应用细胞培养技术和光密度测定法研究空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞系HBsAg与HBeAg表达的影响.结果 各实验组对HepG2.2.15细胞中HBsAg的抑制率均有明显的升高,实验组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.01),实验组与阳性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组中HBsAg的抑制率跟药物剂量呈正相关;实验组各剂量对HepG2.2.15细胞中HBeAg的抑制率均有明显的升高,实验组与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜ 0.01),实验组与阳性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),实验组中HBeAg抑制率跟药物剂量呈正相关.结论 空心莲子草总黄酮对HepG2.2.15细胞中HBsAg和HBeAg表达均有明显的抑制作用.体外细胞培养证实空心莲子草总黄酮有较强的抗乙肝病毒作用.
关键词： 空心莲子草 总黄酮 HepG2.2.15细胞 HBsAg HBeAg -
茵兰益肝颗粒剂体外抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究
[目的]验证含有茵兰益肝颗粒剂药效成分的药物血清对转染乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系2.2.15(HepG2.2.15)细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原的(HBeAg)抑制作用.[方法]组织培养及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测.[结果]药物血清第8天对HepG2.2.15细胞半数毒性浓度(TC50)为11.48%,大药物血清无毒浓度(TC0)为6.0%.6.0%、3.0%、1.50%、0.75%4种药物血清浓度在HepG2.2.15细胞中第8天对HBsAg的抑制率分别为7.89%、5.8%、1.6%、1.6%,对HBeAg抑制率均为负值.[结论]茵兰益肝颗粒剂对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg有较低的抑制率,对HBeAg无抑制作用.
关键词： 乙型肝炎病毒 HepG2.2.15细胞 细胞培养 ELISA检测 -
干扰素对HepG2.2.15细胞表达HBVM及p53蛋白影响的实验研究
目的:观察α-2b干扰素对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg、HBV-DNA水平和对p53蛋白的影响作用.方法:分别用酶联免疫吸附实验和荧光定量PCR法测定培养HepG2.2.15细胞悬浮液中HBV-DNA ,HBsAg和HBeAg含量变化;免疫组化法观察p53蛋白在培养细胞中的含量和分布;计算α-2b干扰素对HBV及相关抗原的抑制率.结果:α-2b干扰素在1000IU/mL-5000IU/mL浓度范围内呈剂量相关性抑制.当浓度达3000IU/mL,作用至第5d时,对HBsAg和HBeAg的抑制率分别达89.32%、87.23%和82.66%,并趋于稳定.免疫组化染色,治疗组p53蛋白颗粒增多,与细胞核相联,胞浆颗粒稀少.结论:α-2b干扰素可抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg、HBV-DNA,并能影响p53蛋白的表达和分布,提示α-2b干扰素在治疗慢性乙型肝炎和防治慢性HBV感染诱发原发性肝癌的价值.
关键词： 乙型肝炎病毒 HepG2.2.15细胞 α-2b干扰素 P53蛋白 -
siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究
目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响.方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出佳转染效率的剂量配比.于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg.结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL:2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P＜0.05).结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg.
关键词： siRNA 转染 阳离子脂质体 HepG2.2.15细胞
