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化学合成小干扰RNA体外转染大鼠支持细胞的实验研究
目的:观察化学合成siRNA阻断大鼠支持细胞内源性基因表达的可行性,并优化转染条件.方法:体外取SD大鼠睾丸,分离、培养支持细胞,应用化学合成的不同浓度siRNA在阳离子脂质体Lipofectamice TM 2000介导下转染原代支持细胞.RT-PCR检测大鼠支持细胞中GAPDH mRNA水平的变化,MTT法检测支持细胞的活性.结果:转染终浓度为150nmol/L的siRNA能特异性有效的阻断GAPDH基因的表达,细胞毒性随浓度提高而增强,终浓度为200nmoL/L的siRNA对细胞有明显毒性.结论:siRNA能在大鼠支持细胞内启动RNA干扰,150nmol/L的siRNA能特异有效地阻断内源基因表达并保持较高的细胞活性.
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Z-综合评分法优化丹皮酚阳离子脂质体凝胶剂制备工艺
目的:优化丹皮酚阳离子脂质体凝胶剂的制备工艺.方法:采用薄膜分散-探头超声法结合研磨法制备丹皮酚阳离子脂质体凝胶,以包封率、粒径大小及ξ电位为考察指标,以中性脂材/带电脂材摩尔比、药脂比、水化时间和超声条件因素,每因素采取3个水平,利用正交试验优化制备工艺.结果:佳制备工艺为DC-Chol 160 mg,Chol 300 mg,HSPC 500 mg,溶于40 mg丹皮酚三氯甲烷液(15 mL)中,40 ℃水浴减压蒸发除去有机溶剂,形成均匀薄膜,加入pH 6.5磷酸盐缓冲液(PBS,0.05 mol· L-1)10 mL水化2h,探头式超声3 min,再依次过0.8,0.45 μm的微孔滤膜,得脂质体溶液.另取卡波姆1.0g,加入脂质体溶液中,溶胀完全后,加入甘油0.3g,研磨均匀,即得.结论:薄膜分散-探头超声法结合研磨法制备脂质体凝胶,脂质体包封率较高、粒径分布均匀、ξ电位适宜,制剂黏度佳,刺激性小.
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HBV S基因反义锁核酸抑制病毒体外复制
目的 探讨乙型肝炎病毒S基因反义锁核酸(LNA)片段在HepG_22.2.15细胞内的抗病毒效果及有效LNA片段筛选.方法 设计合成互补于HBV S基因mRNA翻译起始区同一位点的4条不同序列长度LNA片段,以阳离子脂质体介导,作用于HepG_22.2.15细胞株,采用ELISA法和实时荧光定量聚合酶链技术(FQ-PCR)分别监测24、48和72 h细胞培养上清液中HBsAg和HBV DNA的含量;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法监测细胞代谢.结果 4条不同序列长度反义LNA均显著抑制HBsAg表达和HBV DNA复制,72 h后高抑制率分别达72.43%和34.73%.HBsAg分泌量和HBV DNA的拷贝数均明显低于对照组(P<0.01).LNA对细胞代谢无明显影响.结论 针对HBV S基因mRNA翻译起始区的反义LNA片段体外能显著抑制HBV表达,且抑制作用强序列长度在15～25个碱基之间.
关键词： 乙型肝炎病毒 锁核酸 HepG_22.2.15细胞 基因治疗 阳离子脂质体 -
反义MCP-1转染兔平滑肌细胞及对其生长的影响
构建逆转录病毒载体反义单核细胞趋化蛋白1(LUCX-Anti-MCP-1)表达质粒,利用阳离子脂质体(Lipofectamine)将反义MCP-1导入体外培养的平滑肌细胞,通过PCR、Northern杂交检测外源基因的转染及其mRNA表达情况.应用3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法了解反义MCP-1基因对细胞生长的影响.结果显示:Lipofectamine可以成功的将反义MCP-1基因导入体外培养的主动脉平滑肌细胞中,并实现外源基因的转录表达.且反义MCP-1基因对体外培养的平滑肌细胞生长没有影响.
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负载HPV16E6基因树突状细胞疫苗的构建
目的 以阳离子脂质体为载体,构建载入人乳头瘤病毒16型E6蛋白(HPV16E6)基因树突状细胞(DC)疫苗,研究其安全性及转染效率.方法 将pcDNA3.1-HPV16E6质粒与阳离子脂质体混合形成复合物后转染树突状细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪及免疫细胞化学检测基因表达效率.结果 转染后的DC可见胞浆内颗粒增多,胞质突起增加,细胞生长良好.免疫细胞化学、流式细胞仪结果DC转染率49.8%.结论 阳离子脂质体可用于DC疫苗构建,具有高效性及安全性.
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超声联合载基因阳离子脂质体-微泡体外增强基因转染实验
目的 探讨超声介导载基因阳离子脂质体-微泡增强CTGF-miRNA基因对大鼠肝星状细胞的转染情况.方法 实验分为6组:空白对照组、单纯质粒组、载基因阳离子脂质体-微泡组、质粒+超声组、质粒+普通微泡+超声组和载基因阳离子脂质体-微泡+超声组.荧光显微镜观察质粒中增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测基因转染率,MTT法分析细胞存活率.结果 超声联合载基因阳离子脂质体-微泡组细胞基因转染效率高,与其余组相比差异有统计学意义,P＜0.05,同时并不影响细胞存活率.结论 超声介导载基因阳离子脂质体-微泡能安全有效提高CTGF-miRNA基因在大鼠肝星状细胞中的转染.
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阳离子脂质体介导重组人骨形态发生蛋白-2基因转染的兔骨骼肌干细胞体外成骨分化的实验研究
目的初步探讨阳离子脂质体介导的重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)基因对兔骨骼肌干细胞(SMSCs)体外成骨活性的影响.方法 pEGFP-rhBMP-2的扩增、浓度及纯度鉴定.脂质体包裹质粒DNA,转染SMSCs后测定转染率.检测rhBMP-2、碱性磷酸酶(ALP)和Ⅰ型胶原的表达.结果脂质体介导pEGFP-rhBMP-2 SMSCs转染后大转染率为14.18%,rhBMP-2、ALP和Ⅰ型胶原的表达呈阳性,而pEGFP转染的细胞和未染细胞rhBMP-2、ALP和Ⅰ型胶原的表达弱阳性.结论 SMSCs是一种较理想的骨组织工程种子细胞.脂质体介导质粒rhBMP-2的基因转移安全性好,但转染率相对较低.
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重组腺相关病毒-阳离子脂质体载体的构建及评价
目的 探讨重组腺病毒相关病毒(rAAV)-阳离子脂质体(LyoVec)复合载体的构建方法及其转染率评价.方法 构建rAAV-GFP,rAAV-LyoVec复合载体及rAAV-GFP-LyoVec.倒置荧光显微镜观察,测定rAAV-GFP,LyoVec-GFP及rAAV-GFP-LyoVec对定量C6细胞的转染率,筛选出高转染率载体.结果 rAAV-GFP组24、48、72和96 h转染率分别为16%、23%、21%和9%;LyoVec-GFP组为28.5%、33%、32%和11%;rAAV-GFP-LyoVec组为49%、59%、64%和20%.rAAV-GFP-LyoVec组分别在24、48、72和96 h的转染率显著高于rAAV-GFP组(P＜0.01)及LyoVec-GFP组(P＜0.01).结论 新构建rAAV-LyoVec复合载体基因的转染效率远远高于rAAV或LyoVec独立转染.
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构建靶向性高尔基体膜蛋白高尔基体蛋白73修饰脂质体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶诱导肝癌细胞凋亡
目的 构建一种具有靶向性的非病毒基因治疗载体高尔基体蛋白73(GP73)-脂质体lipoplexes,并检测其对肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL-7702的转染效率和凋亡的影响.方法 以水溶性碳二亚胺为交联剂将GP73与lipoplexes偶联.用GP73-lipoplexes运载标记有绿色荧光蛋白(green lfuorescent protein,GFP)荧光报告基因的PGenesil-l质粒转染肝癌细胞组HepG2和肝正常细胞组HL-7702,通过荧光显微镜观察被转染细胞GFP的表达情况,流式细胞术检测转染效率.并用GP73-lipoplexes运载含治疗基因HSVtk的质粒PBI-SUR-TK转染肝癌细胞和肝细胞,经RT-PCR和Western blot检测细胞中HSVtk表达情况,流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡情况.结果 经GP73修饰的lipoplexes转染的肝癌细胞组[(26.37±0.76)％]比肝细胞组[(9.68±0.57)％]有更高的转染效率和更多的HSVtk基因的表达,肝癌细胞增殖能力明显减弱,凋亡显著.结论 GP73修饰的lipoplexes介导的HSVtk自杀基因系统对肝癌细胞有治疗作用,可以尝试作为一种靶向性杀伤肝癌细胞的非病毒基因转运载体.
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体内直接人胰岛素原基因转移对糖尿病小鼠治疗作用的研究
目的研究人胰岛素原基因表达质粒直接转移至糖尿病小鼠体内后对其血糖和血浆胰岛素水平的影响.方法将人胰岛素原基因和大鼠磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)启动子的重组质粒pN-PEPCK-INS经脂质体介导,直接转入糖尿病小鼠体内,监测空腹血糖并测定血浆胰岛素水平,PCR法鉴定基因转入.结果人胰岛素原基因转移组小鼠血浆胰岛素为(49.29±14.56)mlU/L,显著高于生理盐水对照组(37.56±8.4)mlU/L(P＜0.05)和质粒PLNC对照组(33.54±13.35)mlU/L(P＜0.05),生理盐水组与质粒PLNCX组差别无显著性(P＞0.05),人胰岛素原基因转移组空腹血糖显著低于基因转入前(P＜0.05).生理盐水组和质粒PLNCX组空腹血糖基因转入前后差异无显著性.结论人胰岛素原基因可通过脂质体介导直接转移入糖尿病小鼠体内并发挥治疗作用.
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阳离子脂质体介导GDNF体内转基因对脊髓损伤后运动神经元的保护作用
目的:观察阳离子脂质体介导的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)体内转基因对大鼠脊髓损伤(SCI)后伤区脊髓前角运动神经元的影响.方法:采用改良Nystrm法制备大鼠胸段脊髓后路压迫损伤模型,将阳离子脂质体DC-Chol和重组质粒pEGFP-GDNFcDNA混合后直接注入大鼠损伤脊髓.利用RT-PCR技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因的表达.应用尼氏染色、酶组织化学染色方法观察前角运动神经元死亡的数目和胆碱酯酶(CHE)及酸性磷酸酶(ACP)的变化.结果:1周后在注射局部GDNFmRNA 和GDNF有较高表达.GDNF体内转基因早期(1～4周)SCI区前角运动神经元死亡的数目减少,CHE和ACP变化的幅度降低.结论:GDNF体内转基因能减少脊髓不完全性损伤后引起的神经元坏死,阳离子脂质体介导GDNF体内转基因治疗创伤性SCI的方法是可行的.
关键词： 胶质细胞源性神经营养因子 脊髓损伤 神经元 阳离子脂质体 基因治疗 -
阳离子脂质体介导AADC基因重组体脑内直接注射治疗帕金森病的实验研究
目的探讨芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)基因脑内移植对帕金森病的治疗作用及其在左旋多巴(L-dopa)治疗过程中的地位,并探讨阳离子脂质体介导的基因治疗方法的有效性.方法实验组与对照组分别以pCDNA3-AADC重组体和pCDNA3空载体进行阳离子脂质体包裹后,注射于帕金森病SD大鼠纹状体内,观察两组大鼠旋转行为的改善;并在该基础上对两组大鼠分别采用一定浓度的L-dopa进行治疗,观察脑内移植AADC基因后对大鼠旋转行为的进一步改善.采用免疫组化方法确定AADC的表达.结果 (1) 阳离子脂质体包裹的pCDNA3-AADC重组体脑内注射后,在3、7、14、21、28 d时大鼠的旋转行为获得了一定的改善(P<0.05),分别改善56.0%,62.6%,49.4%,36.3%,27.4%,以第1周时为明显,在第5周时,其旋转行为则与移植前差异无显著意义(P>0.05);(2) 使用同等浓度的左旋多巴(L-dopa,10 mg·kg-1·d-1)治疗后,在上述相同的时间点时,实验组较对照组明显改善模型大鼠的旋转行为(P<0.05),以第1周时为明显,其旋转行为改善达93.4%,在第5周时,两组间差异无显著意义(P>0.05);(3) 免疫组化方法确定AADC在纹状体区的稳定表达.结论增加脑内AADC基因的表达可有效改善帕金森病大鼠的旋转行为,并可增加L-dopa治疗效果,有助于在低剂量上长期维持L-dopa的疗效;阳离子脂质体介导的裸基因脑内移植技术为基因治疗帕金森病提供一种手段.
关键词： 帕金森病 芳香-L-氨基酸脱羧酶类 阳离子脂质体 基因疗法 -
GDNF、TGF-β1联合治疗帕金森病的实验研究
目的采用阳离子脂质体介导的方法,探讨胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)基因联合治疗对帕金森病(PD)的疗效和两者的相互影响.方法用6-羟基多巴(6-OHDA)破坏SD大鼠一侧黑质,建立帕金森病模型,并分为对照组、GDNF治疗组、GDNF+TGF-β1治疗组.通过立体定向仪将DOTAP脂质体包裹的GDNF cDNA、TGF-β 1 cDNA注入大鼠的纹状体,观察阿朴吗啡(APO)诱导的旋转行为,应用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测GDNF在脑内表达的变化.结果治疗2周后,PD大鼠旋转行为明显减轻(P《0.01).治疗后4周,GDNF+TGF-β 1组症状进一步减轻,而GDNF组没有继续改善.RT-PCR、Western blot显示,与GDNF组相比,联合治疗组GDNF在mRNA、蛋白水平均有较高的表达.结论阳离子脂质体介导GDNF、TGF-β 1能改善帕金森病症状,TGF-β 1是GDNF重要的联合因子.
关键词： 胶质细胞源性神经生长因子 转化生长因子-β1 阳离子脂质体 帕金森病 联合因子 -
经大鼠圆窗膜bFGF基因转导防治爆震性聋的实验研究
目的：以阳离子脂质体介导bFGF（basic fibroblast growth factor，碱性成纤维细胞生长因子）基因，经完整圆窗膜途径转染爆震后的大鼠耳蜗，观察bFGF的表达及其对爆震性聋的防治作用。方法 SD大鼠30只，随机分为四组：空白对照组（n=6），仅接受155dB SPL脉冲噪声暴露20次；EGFP（enhanced green fluorescent protein，增强型绿色荧光蛋白）对照组（n=8），噪声暴露后即刻导入EGFP/阳离子脂质体复合物；bFGF治疗组（n=8），噪声暴露后即刻导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物；bFGF保护组（n=8），噪声暴露前3天导入EGFP-bFGF/阳离子脂质体复合物。各组动物分别于噪声暴露前及噪声暴露后1天、3天、7天、14天行ABR阈值测试。噪声暴露后14天耳蜗取材做基底膜铺片，荧光显微镜观察，并做bFGF免疫荧光染色验证bFGF的表达。结果爆震后1天，bFGF保护组ABR阈值低于空白对照组及EGFP对照组，且差异均有显著性意义（P<0.05）。爆震后3天、7天和14天，bFGF治疗组及bFGF保护组ABR阈值均低于两个对照组，且差异有显著性意义（P<0.05）。而爆震前及爆震后bFGF治疗组和bFGF保护组间的ABR阈值差异均无显著性意义（P>0.05）。术后14天，荧光显微镜直接观察及bFGF免疫荧光染色均检测到毛细胞内有bFGF的定位表达。结论将阳离子脂质体介导的bFGF基因经圆窗膜导入大鼠耳蜗能够表达，表达产生的bFGF对爆震所致的耳蜗损害有一定的保护作用，它能够减轻爆震后听。
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多聚胺胆固醇阳离子脂质体介导CpGODN雾化吸入对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞的影响
目的 探讨雾化吸入多聚胺胆固醇阳离子脂质体(PCL)与CpGODN复合物(CpGODN/PCL复合物)对哮喘小鼠肺组织嗜酸性粒细胞(EOS)的影响.方法 采用卵蛋白激发法建立哮喘小鼠模型,并设置正常对照组、哮喘对照组、CpGODN/PCL干预组、CpGODN干预组,每组6只.在雾化PCL介导转染CpGODN 48h后,分离小鼠左肺组织,切片HE染色,显微镜下检测EOS浸润情况,同时检测小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞浸润情况.结果 用卵蛋白激发法成功地制备了哮喘小鼠模型.哮喘对照组肺组织肺泡腔黏液分泌增加,支气管及血管周围大量炎性细胞浸润,以EOS,淋巴细胞为主,与正常对照组比较,BALF中细胞总数、EOS数目和百分率均明显增加(P<0.01).而与哮喘对照组比较,CpGODN干预组细胞总数,ECB数目和百分率显著下降(P<0.01).CpGODN/PCL干预组与CpGODN干预组比较,细胞总数无统计学差异,EOS数目、百分率的差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01).结论 哮喘小鼠肺组织EOS浸润和气道黏液分泌,雾化介导CpGODN干预哮喘小鼠模型可减轻以EOS为特征的炎症反应,利用PCL为转染载体包裹CpGODN,可提高转染效率.
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癌基因治疗传递系统研究的新进展
基因治疗的主要目的是开发和利用高效无毒的基因载体,包裹和传递外源性基因材料到靶细胞.病毒型基因载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒相关病毒和痘病毒,基因传递效率高,但安全性差和基因载量低.非病毒载体包括阳离子聚合物、阳离子多肽和阳离子脂质体,基因传递效率比病毒载体低,但更安全、制备简单、基因包裹率高.
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阳离子脂质材料和聚乙二醇对脂质体细胞转染率及膜流动性的影响
目的制备包封荧光素钠(FS)的脂质体,考察阳离子脂质材料(DC-chol)和聚乙二醇(PEG)对脂质体包封率、细胞转染率及膜流动性的影响.方法以FS作为模型物质,制备并分离脂质体,测定脂质体包封率;通过观察荧光光谱的变化考察FS与脂质体膜之间的相互作用;以HepG2 2.2.15为细胞模型观察脂质体对FS细胞转染率的影响;通过荧光偏振技术考察阳离子脂质材料和PEG对脂质体膜流动性的影响.结果阳离子脂质材料和PEG能提高脂质体包封率(0.64%～86.57%)、细胞转染率(2.18%～48.46%)及脂质体膜流动性,PEG分子质量的增大有利于包封率、转染率的提高,并增加脂质体膜的流动性.结论在脂质体处方中加入阳离子脂质材料和高分子量的PEG有利于提高包封率、细胞转染率及增加脂质体膜的流动性.
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凝胶电泳法及荧光光度法测定siRNA阳离子脂质体的含量和包封率
建立siRNA含量测定方法,用于阳离子脂质体中siRNA的含量和包封率测定.利用荧光染料SYBRGold和Ribogreen与siRNA结合后能发出强烈荧光的原理,分别采用电泳法和荧光分光光度法测定脂质体中的siRNA含量,计算阳离子脂质体的包封率.SYBR Gold电泳法的检测线性范围为0.2～2.0μmol·L-1(R=0.9930),高、中、低3个浓度的回收率分别为96.35%、96.92%和100.74%(n=3);日内日间精密度的RSD均小于5%(n=5).Ribogreen荧光分光光度法的检测线性范围为10～50 nmol·L-1(R=0.9971),高、中、低3个浓度的回收率分别为98.22%、99.88%和99.64%(n=3);日内日间精密度的RSD均小于5%(n=5).利用这两种方法所测得3批阳离子脂质体中siRNA平均含量分别为98.52%和97.85%,平均包封率分别为99.20%和96.45%,经方差分析,两种方法无显著性差异.两种方法准确可靠、稳定性高和方便实用,均可用于阳离子脂质体中siRNA的含量和包封率测定.
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载反义寡核苷酸阳离子脂质体的制备及体内外研究
制备载端粒酶反义寡核苷酸的阳离子脂质体并考察其体外癌细胞的抑制作用及转染效率和小鼠体内分布情况.以磷脂-DOPE(二油酰磷脂酰乙醇胺)-十八胺-胆固醇为类脂成分,薄膜超声-吸附-冷冻干燥法制备稳定的载反义寡核苷酸阳离子脂质体.激光粒度仪测定冷冻干燥前后脂质体zeta电位及粒径,透射电镜观察其形态,葡聚糖凝胶柱分离未包封的反义寡核苷酸,紫外法测定冻干前后的载药率.MTT法检测反义寡核苷酸对乳腺癌细胞MCF-7的抑制.荧光显微镜观察不同时间细胞摄取荧光标记反义寡核苷酸(antisenseoligodeoxynucleotides,asODN)的状况,计算转染效率和不同时间在小鼠心、肝、肺、肾、瘤体组织中的分布.海藻糖与甘露醇及甘氨酸为较好的冻干保护剂,制得的阳离子脂质体带正电荷,规则球形,大小较均匀,海藻糖作为保护剂复溶前后平均粒径为175 nm和320 nm,zeta电位在+32 mY,脂质体的载药率复溶后为83.2%.脂质体介导的5'-FITC荧光标记的asODN在乳腺癌MCF-7细胞中的平均转染率在2、4、8 h时分别为18%、26%、44%,并且细胞生长明显被抑制,与对照组比较,具有显著性差异(P<0.05).阳离子脂质体-asODN复合物体内主要分布在肝、肾、肺和瘤体组织,与对照组比较差异显著.采用该处方和工艺可成功制备稳定性大有改善的反义寡核苷酸阳离子脂质体.该脂质体介导的端粒酶asODN能够有效抑制乳腺癌MCF-7细胞生长,体外转染效率较高.该给药系统可明显增加组织特别是瘤体对asODN的摄入量.
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阳离子脂质体共载基因与化疗药物用于癌症治疗的研究进展
尽管传统癌症化疗方法已取得明显的进展,但由于化疗药物的多药耐药性及毒副作用限制其应用.为了克服多药耐药性,需要增加药物剂量及用药次数,反而导致更强的毒副作用,终限制了化疗药物的临床使用.阳离子脂质体作为新型基因与药物传递系统,近年来备受众多研究学者的青睐.重要的是阳离子脂质体共载基因与化疗药物进行联合治疗具有良好的协同增效作用,主要是外源基因可以沉默相关基因的表达,且提高胞内化疗药物浓度.该方法可以减少药物的使用剂量以达到相同治疗效果.从某种程度上克服了传统化疗的主要限制.因此在未来癌症治疗中,共载基因与药物联合治疗递送体系将发挥更大作用,特别有望用于多药耐药肿瘤中的临床治疗.
