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体外合成修饰mRNA可转染hUC-MSCs
目的 探讨体外合成修饰的mRNA能否稳定高效的转入人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)中,为利用mRNA诱导分化hUC-MSC进行细胞治疗奠定基础.方法 体外构建合成mRNA的模板并合成eGFP的修饰mRNA,将其转入hUC-MSCs,流式检测转染效率、佳转染剂量及mRNA在细胞中的半衰期.相同方法合成hPdx1修饰mRNA转染hUC-MSCs,免疫荧光检测转染效果.结果 体外合成的eGFP修饰mRNA可高效转入hUC-MSCs,佳转染剂量为1.5 μg/mL,转染后翻译的蛋白在细胞中可稳定存在3d.hPdx1的修饰mRNA也可稳定地导入hUC-MSCs.结论 体外合成的修饰mRNA稳定性好,可进入细胞并翻译成蛋白.
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两种非病毒载体介导microRNA转染的对比
microRNA作为核酸类药物,在细胞和生物体内存在稳定性差,半衰期短,转染效率低,靶向性差[1],故转染过程需要高效、高安全性的载体.Lipofectamine是常用的转染脂质体,可与 DNA形成复合物,有较强的转染能力.聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)属阳离子聚合物,在体内外均有较高的转染效率,不良反应较低[2].选择适合的小分子RNA基因载体对其后续研究至关重要.本研究分别选择了脂质体lipofectamin2000和阳离子聚合物PEI作为microRNA的转染载体,在体外检测其在悬浮细胞THP-1中的转染效率和细胞死亡率,比较两种转染载体的转染特性及作为microRNA基因载体的可行性.
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纳米羟基磷灰石可介导转染人肺癌A549细胞
目的 探讨纳米羟基磷灰石(nHAP)介导带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pGenesil-1质粒转染人肺癌A549细胞的可行性.方法 用均相沉淀法制备nHAP;透射电镜观察纳米粒结构;经超声分散及碳酸钠预处理后,在pH值7.4环境下应用多聚赖氨酸(PLL)修饰nHAP;实验分为nHAP-PLL组、脂质体组及对照组,分别配制转染复合物并转染A549细胞;荧光显微镜观察EGFP的表达;流式细胞仪检测pGenesil-1的转染率.结果 透射电镜下nHAP呈针状颗粒,粒径较均匀,约(15～20)mm×(60～80)nm,分散程度良好;nHAP-PLL组和脂质体组均见EGFP表达阳性的A549细胞,对照组未见EGFP表达阳性的A549细胞;nHAP-PLL组pGenesil-1转染A549细胞的转染率为(31.8±1.9)%,与脂质体组的转染率(33.4±3.7)%无差异,对照组未见转染阳性的A549细胞.结论 nHAP经PLL表面修饰后可介导人肺癌A549细胞基因转染.
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Ad5F11p-GFP对CIK和NK-92细胞的转染效率及生物学特性的影响
目的:研究Ad5F11p载体对CIK和NK-92细胞的转染效率及生物学特性的影响,预测Ad5F11p载体在免疫治疗中的应用.方法:用Ad5F11 p-GFP以不同的MOI(转染复数)转染原代免疫细胞CIK和免疫细胞系NK-92,并以未转染病毒的两种免疫细胞作为阴性对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,用显微镜观察形态学变化,用台盼蓝染色计数分析细胞的增殖,并用LDH法检测NK-92对白血病细胞系K562和HL-60的杀伤作用.结果:25MOI的Ad5F11 p-GFP对NK-92的转染效率可以达到大约90％,200 MOI的Ad5 F11 p-GFP对CIK转染效率不到40％,同一MOI在48 h和96 h时转染效率基本不变;转染Ad5 F11 p-GFP的免疫细胞容易聚团,增殖减慢,IFN-γ的释放增加并且对肿瘤的杀伤活性增强.结论:Ad5F11p载体修饰的NK-92在过继性免疫治疗中有较好的应用前景.
关键词： Ad5F11p-GFP CIK细胞 NK-92细胞 过继性免疫治疗 转染效率 -
蜂毒疏水性短肽增强聚乙烯亚胺的基因转染效率
本研究探讨使用蜂毒短肽疏水性尾部增加支链聚乙烯亚胺(BPEI)在HeLa细胞中的转染效率的可能性.合成蜂毒多肽melittin的疏水性尾部,使用红细胞溶血实验检测其穿透细胞膜的能力.将该片段与阳离子聚合物BPEI按一定比例混合,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,检测其在HeLa细胞的转染效率;以MTT法检测基因转染后的细胞毒性.结果表明:在中性和酸性条件下,melittin的疏水性尾部均可穿透细胞膜导致红细胞溶血并显著增加BPEI在HeLa细胞系的基因转染效率,使用本方法转染后细胞毒性较单独使用PEI时为低.结论:melittin疏水性尾部是一种良好的增强剂,有可能在难以转染的细胞系的基因转染实验中起重要作用.
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光化学基因转染技术
肿瘤基因转染技术虽然发展很快,仍有许多限制因素制约着它的临床应用,特别是缺乏有效而特异的体内基因转递技术,难以保证基因转染效率.大量研究表明,尽管目前基因治疗载体种类很多,但无论病毒载体或是合成载体都存在着生物安全性、体内转染效率等方面的限制.特别是多数基因载体被靶细胞胞吞后大部分只能滞留在内吞泡中终被溶酶体降解,只有少数能从内吞泡中逸出进入胞浆,转运入核内发挥转录作用,大大影响了转染效率,难以达到预期目的[1].
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纳米基因载体在生物医学领域中的研究进展
近年来，随着人类基因组计划的进展及对功能基因的不断探索，基因治疗的研究受到越来越多人的关注，由于其展现出良好的应用前景，纳米生物医学技术在多数发达国家已经被列入优先科研计划[1]。在基因治疗的过程中，如何将所需的功能基因更为有效、安全的导入受体细胞尤为重要。目前常用的基因转染载体有病毒型和非病毒型两种。病毒型载体的转运能力较强，但其携带基因的大小及数量有限、靶向特异性差，且可诱发机体产生免疫反应[2]，甚至存在较为严重的生物安全隐患[3]，因此应用受到了较多的限制；非病毒型载体虽然无免疫原性，较为安全，但是其在体内存在不稳定性、转染效率低的缺点尤为突出。由此可见，目前安全、低毒、靶向及转染效率等问题迫切需要解决。
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几种脂质体对Li-7肝癌细胞株的转染效率研究
目的：比较Lipofectamine2000、lipoplexes和apoE-lipoplexes三种脂质体对Li-7肝癌细胞的转染效率。方法构建普通阳离子脂质体 lipoplexes 和载脂蛋白 apoE 修饰脂质体apoE-lipoplexes；使用Lipofectamine2000，lipoplexes和apoE-lipoplexes三种脂质体运载以EGFP为报告基因的pGenesil-1质粒转染Li-7肝癌细胞，通过荧光显微镜观察EGFP蛋白的表达，流式细胞术检测三种脂质体的转染效率。结果 Lipofectamine2000、lipoplexes和apoE-lipoplexes三种脂质体转染效率分别为（18.63±0.57）%，（24.07±0.91）%，（28.93±0.50）%，3组间两两比较均有显著性差异（P＜0.01）。结论 Li-7肝癌细胞的转染效率与脂质体的结构有关，提示脂质体结构改造可能成为提高转染效率的新策略。
关键词： 脂质体 pGenesil-1质粒 肝癌细胞 转染效率 -
构建靶向性高尔基体膜蛋白高尔基体蛋白73修饰脂质体介导单纯疱疹病毒胸苷激酶诱导肝癌细胞凋亡
目的 构建一种具有靶向性的非病毒基因治疗载体高尔基体蛋白73(GP73)-脂质体lipoplexes,并检测其对肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL-7702的转染效率和凋亡的影响.方法 以水溶性碳二亚胺为交联剂将GP73与lipoplexes偶联.用GP73-lipoplexes运载标记有绿色荧光蛋白(green lfuorescent protein,GFP)荧光报告基因的PGenesil-l质粒转染肝癌细胞组HepG2和肝正常细胞组HL-7702,通过荧光显微镜观察被转染细胞GFP的表达情况,流式细胞术检测转染效率.并用GP73-lipoplexes运载含治疗基因HSVtk的质粒PBI-SUR-TK转染肝癌细胞和肝细胞,经RT-PCR和Western blot检测细胞中HSVtk表达情况,流式细胞术和CCK-8检测细胞凋亡情况.结果 经GP73修饰的lipoplexes转染的肝癌细胞组[(26.37±0.76)％]比肝细胞组[(9.68±0.57)％]有更高的转染效率和更多的HSVtk基因的表达,肝癌细胞增殖能力明显减弱,凋亡显著.结论 GP73修饰的lipoplexes介导的HSVtk自杀基因系统对肝癌细胞有治疗作用,可以尝试作为一种靶向性杀伤肝癌细胞的非病毒基因转运载体.
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内毒素相关受体基因共转染肠上皮细胞的研究
基因转染可将目的基因导入靶细胞进行基因功能和基因表达调控的研究 [1].但转染效率的高低受诸多因素的影响,尤其是多种功能相关基因的共转染,更加困难.既往研究发现,人肠上皮细胞株(HIC)不表达内毒素(LPS)相关受体CD14(cluster of differentiation 14)、Toll样受体4(Toll-like receptor4,TLR4)和MD-2 (myeloid differentiation protein-2).为进一步证实这3种LPS相关受体的不表达是否是肠上皮细胞耐受LPS的关键机制,我们用FuGENE 6转染试剂进行CD14、TLR4和MD-2基因共转染人肠上皮细胞的探索.
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乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
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肝靶向基因给药系统AsOR-PL+PEG-PEl的研究
目的:研制含有靶向配基、DNA聚合亚基、溶酶体活性成分及聚乙二醇等多种组分的肝靶向的DNA给药系统.方法:分别制备As0R-PL偶合物及PEG-PEI偶合物.然后按照不同的比例先后与报告基因DNA形成复合物,再进行Huh-7细胞的体外转染试验和静脉给药后小鼠体内的表达试验.结果:AsOR-Pt/PFG,-PEt/DNA复合物对受体阳性的Huh-7细胞具有较高的转染效率;小鼠尾静脉给药后能够在肝脏特异性表达.结论:含有靶向配基、DNA聚合亚基、溶酶体活性成分及聚乙二醇等多种组分的载体系统能将DNA选择性的投放于小鼠肝脏,显示了较好的应用前景.
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TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响
目的:TGIF(TGinteractingfactor)是TGF-β和视黄醛信号传导通路的抑制分子,且MAPK通路的活化能延长其半衰期,但他在肿瘤发生中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨TGIF反义寡核苷酸对胃癌细胞增生和凋亡的影响.方法:将TGIF反义寡核酸瞬时转染胃癌细胞株SGC-7901,RT-PCR检测转染效率,MTT法检测胃癌细胞的增生速度,流式细胞术分析转染细胞的细胞周期和凋亡率的变化.结果:SGC-7901细胞转染TGIF反义寡核苷酸后,细胞增生受到部分抑制,72h后,他的抑制率达20.4%,但细胞的凋亡和细胞周期分布无明显改变.TGF-β1处理后,与突变寡核苷酸转染组细胞和未转染组细胞相比,TGIF反义寡核苷酸转染的SGC-7901细胞的增生受到明显抑制(30%),G1期细胞含量增加更明显.结论:TGIF能抑制TGF-β1对细胞生长和细胞周期的负调控作用,多数肿瘤细胞和间质细胞能分泌TGF-β1,这些肿瘤细胞有可能利用TGIF甚至少量TGIF,抑制TGF-β对自身的生长抑制作用,从而促进肿瘤的发生、发展与转移.
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优化超声辐照条件促进EGFP在293 T细胞内转染的实验研究
目的：探讨超声辐照促进EGFP转染至293T细胞的佳条件。
方法：将293T细胞种植于24孔板内，细胞密度1.5×105/孔，24 h后更换为转染液进行超声辐照。根据辐照条件分别优化输出功率、辐照时间、微泡浓度。质粒浓度固定选择15μg/ml；输出功率选择1.5 w/cm2、2.0 w/cm2、2.5 w/cm2；辐照时间选择30s、45s、60s；微泡浓度选用20%、30%、40%。转染液为EGFP、微泡、Opti-MEM的混合液，总体积为1 ml，微泡选用sonovue，EGFP质粒浓度为1μg/μl。辐照仪器为超声基因转染仪，辐照后4 h更换为不含抗生素含血清的DMEM培养基。每个条件相互组合，重复4次。转染后72 h荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白的绿色荧光，流式细胞仪检测荧光细胞比例，CCK-8检测细胞存活率，计算转染效率=荧光细胞比例×细胞存活率。统计方法采用多因素方差分析。 -
Rad基因重组腺病毒在培养乳鼠心肌细胞中的表达
目的：研究外源性Rad基因重组腺病毒在体外转染乳鼠心肌细胞后的转染效率及Rad基因的表达情况。
方法：构建Rad腺病毒载体，以不同的MOI值转染体外培养的原代乳鼠心肌细胞，通过荧光显微镜观察转染后荧光强度及转染效果，流式细胞仪检测转染率，采用RT-PCR、Western blot检测Rad基因表达情况。 -
人血管生成素-1和血管内皮生长因子165基因克隆及复制缺陷型腺病毒载体构建
本研究克隆人血管生成素-1(Angiopoietin-1, Ang1)和血管内皮生长因子(VEGF)165的全长编码基因,构建高转染效率和表达水平的复制缺陷型腺病毒重组体.研究结果显示,Ang1和VEGF联合应用具有抗细胞凋亡的作用.
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基因治疗在骨科中的应用
基因治疗(gene therapy)是将某种形式的核酸转入患者体细胞内以减轻疾病的过程[1].就是把由一个或几个基因及其调控序列转移(gene transfer)到靶细胞并发挥遗传物质的作用以治疗疾病.在基因治疗中,具体实施的步骤包括:目的基因的选择、载体的选择、基因转移方法的选择及靶细胞基因位点的选择等.目前常用的基因载体包括病毒和非病毒两大类,病毒载体由于对导入基因的大小有限制,其转基因的效率虽较高,但有免疫原性,运用于人体治疗有较大的危险性;常用的病毒基因载体有RNA逆转录病毒和DNA腺病毒.非病毒转基因不存在类似病毒载体的安全性问题,尤其是目前发现的多价阳离子脂质体转染效率较高,几乎无免疫排斥、毒性低和方法简单;主要的不足是基因不能长期表达;非病毒基因载体包括脂质体-DNA复合体,DNA质粒,裸DNA和基因枪.
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慢病毒载体VP22-EGFP的构建及其对大鼠神经干细胞转染及表达的研究
目的 研究VP22穿梭蛋白对神经干细胞(neural stem cell,NSC)转染效率的影响.方法 通过酶切质粒pUL49ep获得VP22片段后克隆到含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced greenfluorescent protein,EGFP)的慢病毒(Lentivirus)pHIV-EGFP质粒载体上,并采用PCR及基因测序技术对VP22基因进行鉴定.病毒包装采用三质粒系统共转染293T细胞后感染经体外原代培养、扩增的SD大鼠胎脑NSC,荧光显微镜下观察EGFP在NSC中的表达,流式细胞仪检测EGFP的表达,PCR检测基因组中VP22-EGFP基因的表达,MTT法测定转染前后单纯NSC、含有EGFP及含有VP22-EGFP的NSC的增殖活性.结果 PCR和DNA测序证实,外源基因VP22成功插入到质粒载体pHIV-EGFP的骨架结构中的启动子CMV和EGFP序列之间;荧光显微镜下均见有绿色荧光蛋白的表达;流式细胞仪测定结果:Lentivirus-EGFP及Lentivirus-VP22-EGFP转染的NSC的EGFP的表达率分别为(23.1±1.8)%及(34.9±2.9)%(P<0.01);PCR结果显示VP22整合入NSC的基因组DNA中;MTT结果显示转染前后单纯NSC、含有EGFP及含有VP22-EGFP的NSC的细胞生长曲线无明显改变.结论 VP22能够提高慢病毒对NSC的转染效率,且不影响其生长特性.表明VP22作为一种短链蛋白可以与编码的治疗基因形成融合蛋白增强基因治疗的疗效,在基因修饰的工程化干细胞中具有良好应用前景.
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聚酰胺-胺型纳米载体在基因治疗中的应用
高效、安全和靶向的载体系统是基因治疗成功的关键.病毒载体系统因毒性、免疫原性等安全隐患,其临床应用受到很大限制;而非病毒载体系统转染效率一直不如前者.近年来出现的纳米微粒基因转移技术有可能突破这一窘境,使基因治疗成为临床常规治疗手段.
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穿膜肽增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率的机制研究
目的 研究穿膜肽增强支链聚乙烯亚胺(BPEI)在CHO-K1细胞中的基因转染效率的机制.方法 分别合成蜂毒肽(melittin)及其疏水核心区MT20,利用圆二色光谱(CD)分析其二级结构;通过溶血试验比较二者穿透细胞膜的能力;加入蜂毒肽和MT20前后,观察钙黄绿素(calcein)在HeLa细胞内的分布情况.分别将蜂毒肽或MT20与BPEI按一定比例混合,以荧光素酶(luciferase)为报告基因,检测荧光素酶在CHO-K1细胞中的转染效率;以MTT法检测基因转染后的细胞毒性.结果 在模拟膜环境的甲醇溶液中,蜂毒肽和MT20都呈现一定的α-螺旋结构,比例分别为59.63%和35.67%,说明其二级结构与之穿膜功能相关;蜂毒肽只能在中性条件下穿透细胞膜导致红细胞溶血,而MT20在中性和酸性条件下都具有穿膜能力;加入蜂毒肽和MT20后能够促进钙黄绿素在MT20组中呈弥散分布,在蜂毒肽组中呈颗粒状分布并且在核仁内蓄积;MT20和蜂毒肽都能够增强BPEI在CHO-K1细胞中的基因转染效率,其中MT20的增强作用更强且细胞毒性较蜂毒肽以及单独使用BPEI和Lipofectamine 2000时要低.结论 蜂毒肽的疏水核心区MT20通过增加PEI/DNA复合物颗粒从内含体逃逸并促进其进入细胞核而增加其基因转染效率,是一种低毒的基因转染增强剂,有可能在难以转染的细胞系中发挥重要作用.
