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血中检测SARS冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用
为明确严重急性呼吸综合症(SARS)冠状病毒N蛋白在SARS实验室早期诊断中的作用,通过微量中和试验及酶联免疫方法、间接免疫荧光法检测疑似病人恢复期血清(大于28天)中SARS-IgG抗体,确诊SARS患者.同时收集发病不同时期SARS及普通发热病人血清,利用酶联免疫方法检测SARS-CoV N蛋白,并与荧光定量PCR早期诊断方法相比较.共检测:广州地区2003年12月~2004年1月新发4例确诊SARS患者不同时期的血液和咽漱液标本;恢复期血清SARS-CoV中和抗体阳性病人不同时期的血清46份;广州地区2003年1月~4月临床确诊SARS患者159例的血清和56例疑似患者血清;非SARS普通发热病人血清97份;正常人体检血清100份.结果:4例新发SARS患者的不同时期标本中,3例患者急性期血均检出N蛋白,优于常用的荧光定量PCR检测方法.46份SARS-CoV中和抗体阳性的血清标本,N蛋白检出率为100%.159例临床确诊病例中,发病早期5天以内SARS-CoVN蛋白的检出率为92.3%,随后呈现逐步下降的趋势,在发病第18天仍可检出.56例临床疑似患者发病早期也有23.2%检出率.而97例普通发热病人及100份正常人血清中均未能检测出SARS-CoV N蛋白.表明在血清中检测SARS冠状病毒N蛋白的方法敏感性和特异性都好,对SARS实验室早期诊断具有重要作用.
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Vero 细胞流感疫苗应用前景
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,其病毒基因组为单股负链分节段的RNA,外有包膜.根据病毒核壳蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性的不同,分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,甲型根据其表面(HA、NA)结构及其基因特性的不同又分为许多亚型,乙和丙型没有亚型,其中甲型和乙型流感病毒与人类有密切关联[1],如1918~1919年暴发的西班牙流感(H1N1)、1957年的亚洲流感(H2N2)、1968年的香港流感(H3N2)和1977年俄国流感(H1N1),每次大流行都造成了巨大的人力资源和物力资源的损失,在美国,每年平均20,000人死于流感.自1968年起大多数流感病毒的新变种都首发于中国,并且近来的研究表明,历史上的4次流感暴发,后3次出现的新亚型流感病毒均首发于中国.
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SARS冠状病毒核壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的制备严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(CoV)核壳(N)蛋白单克隆抗体,为寻求SARS早期诊断的方法及深入研究SARS疾病提供有力的工具.方法以重组SARS-CoV N蛋白免疫小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法制备单克隆抗体.通过间接酶联免疫分析、间接免疫荧光、免疫双向扩散等方法鉴定抗体的特异性、亲和力、类型及亚类、配对效果等.结果共获得15个阳性克隆,其中10个与天然SARS-CoV呈阳性反应.10株单抗的相对亲和常数在108~109mo1/L-1之间;10株中有1株为IgG2b、1株为IgG3,其余均为IgG1;10株单抗中有8株与12种肺炎相关的病原体无交叉反应,1株与流感病毒A、B,副流感病毒有交叉反应,l株与流感病毒A、B有交叉反应;10株单抗中的5株可形成5种配对,其中两种配对用于检测重组SARS病毒N蛋白,灵敏度可达1 μg/L.结论获得了特异性针对SARS冠状病毒N蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测SARS-CoV N蛋白的酶联双抗体夹心法,为SARS的早期诊断、蛋白质组学的研究奠定了基础.
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SARS-CoV N基因重组腺病毒对树突状细胞前炎症细胞因子mRNA表达和分泌的影响
目的 探讨严重急性呼吸综合征相关的冠状病毒(SARS-CoV)感染后炎症细胞因子的mRNA表达和分泌水平的动态变化,在蛋白质水平上阐明SARS-CoV的致病机理.方法 本研究在建立树突状细胞(dendritic cells,DC)培养方法的前提下,利用SARS-CoV的N基因重组腺病毒(rAd-N)和对照的腺病毒(rAd-LacZ)来感染成熟的DC,用RT-PCR和ELISA法检测DC对IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-a的mRNA表达和分泌水平的变化.结果 IL-6和TNF-a mRNA的表达和分泌水平在前24 h之内是逐渐升高的,与对照组(rAd-LacZ感染)相比,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 SARS-CoY的N蛋白与SARS的急性期DC分泌过量的前炎症细胞因子有关.
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内源性TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的诱导作用
HLAⅠ分子组成性表达于各种有核细胞表面,细胞因子可通过旁分泌或自分泌效应诱导其表达增强.Zhou等[1]实验表明HBV能增强HepG2细胞的HLAⅠ表面表达,排除细胞内IFN-β的产生和介导作用.为进一步研究其它内源性细胞因子的介导作用,我们构建HBV基因组野生株(WT)及核壳蛋白变异株L97稳定表达载体,探讨TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的调节作用.
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利用新型表达载体一步获得HIV-1核壳蛋白p24纯品
目的利用新型原核表达载体获得人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核壳蛋白p24纯品. 方法采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出HIV-1 HXB2株gag开放阅读框架的内壳蛋白p24的基因片段,将目的基因片段插入到新型表达载体pTXB中构建成重组表达质粒pTXB-p24.表达产物的纯品通过几丁质珠(chitin beads)的亲和与柱上DTT的剪切而得到.用SDS-PAGE和HPLC分析所得纯品的大小和纯度,用Western blot和胶体金实验检测其抗原性. 结果构建的重组表达质粒pTXB-p24经IPTG诱导得到C端融合Intein-CBD的p24蛋白,该蛋白通过几丁质珠(chitin beads)的亲和与柱上DTT的剪切得到纯化的非融合的p24重组蛋白.HPLC分析表明其纯度可达96%,胶体金结果显示纯化的p24可与HIV-1阳性患者的血清反应,具良好的抗原性. 结论利用新型原核表达载体可一步获得纯度为96%的非融合p24抗原纯品,为大规模生产该蛋白提供了可靠的保证.
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呼吸道合胞病毒疫苗研究动态
呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是引起婴幼儿严重下呼吸道感染的重要病毒性病原体,广泛分布于世界各地.其发病率高,多数儿童在两岁前都感染过RSV.老年人和免疫力低下的人群中也会暴发流行.RSV感染的临床表现在不同年龄组往往不同,一般可致鼻炎、中耳炎、哮喘、支气管炎、细支气管炎和肺炎,尤其以后两种疾病为严重,甚至可导致死亡.RSV属副黏病毒科,肺炎病毒属, 病毒粒子直径约150~300 nm.基因组为一条约由15 000个核苷酸组成的单股、负链RNA,主要编码10个蛋白质:3种核衣壳蛋白[核壳蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、大聚合酶蛋白(L)]、3种跨膜蛋白[融合蛋白(F)、附着蛋白(G)、小疏水蛋白(SH)];2种基质蛋白(M1、M2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2).F蛋白和G蛋白是两种主要的结构蛋白,可诱导机体产生抗体和细胞免疫,因此常被作为RSV疫苗研制的靶抗原.世界卫生组织(WHO)已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展项目之一.但迄今为止,尚无安全、有效的RSV疫苗获准上市.
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汉坦病毒疫苗株84FLi的全基因序列测定
汉坦病毒(Hantavirus, HV)属于布尼亚病毒科,其基因组是一个单链含大(L)、中(M)和小(S)3个基因片段的负链RNA.编码的结构蛋白分别为L蛋白(即依赖RNA的RNA多聚酶)、外膜糖蛋白G1和G2以及核壳蛋白.
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一例HBV/HDV重叠感染患者血清中HDAg的基因克隆、表达及细胞内定位
丁型肝炎病毒( hepatitis Dvirus,HDV)属于缺陷病毒,其借助乙型肝炎病毒(H BV)的核壳蛋白完成自身生命周期.研究已证实,HDV感染可抑制机体内HBV的复制,但临床上却加剧病情迅速恶化.HDV的基因组仅含1个开放读码框架,分别编码S-HDAg和LHDAg两种功能蛋白.尽管两者在蛋白结构上基本相似,但功能截然相反,因此探讨HDAg某些特殊或重要功能结构域仍是该领域研究热点.基于此,我们从1例HBV/HDV重叠感染患者血清中成功克隆出了HDAg基因,并对其蛋白的生物学特点进行了初步分析.
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HBcAg生物学特性研究进展
HBcAg存在于Dane颗粒的核心,是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白,具有重要的生物学特性和临床病理意义.HBcAg由HBV基因组的C开放读码区(ORF)编码,具有高度免疫原性,对HBcAg的免疫应答在病毒清除中有重要作用.血清HBcAg阳性可提供肝内HBV合成的信息,是病毒存在的直接标志.HBcAg感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞,肝细胞溶解后HBcAg可直接释放入血,故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度.检测肝组织HBcAg有助于确定乙型肝炎病原学诊断和评估肝细胞坏死炎性活动的程度及病变发展的趋向,推测慢性乙型肝炎的预后.血清和肝组织HBcAg检测具有多种实用价值,值得推荐.
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乙型肝炎病毒核壳蛋白变异株在HepG2细胞的HLA-Ⅰ表达
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
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乙型肝炎病毒基因突变研究的临床意义
在乙型肝炎病毒(HBV)基因的负链核苷酸序列中,至少有4个开放读码框架(ORF),包括编码外膜蛋白的S基因区,编码核壳蛋白的C基因区,编码聚合酶的P基因区和调节病毒基因转录水平的X基因区.
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流感病毒疫苗研究进展
流感是由流感病毒所引起的一种急性呼吸道传播疾病,可季节性地感染禽类、哺乳动物和人类。流感病毒又可分为A、B、C三种类型,其中以A型流感病毒的暴发为频繁。甲型流感病毒属于正黏病毒科[1],其基因组共由8个独立的单链RNA片段组成,编码10种蛋白:血凝素蛋白(HA);基质蛋白(M)分为M1和M2;神经氨酸酶(NA);核壳蛋白(NP);非结构蛋白(NS)包括NS1和NEP;PB1,PB2和PA三种聚合酶,每种多肽对于流感病毒都具有重要的生物学功能。甲型流感病毒根据其主要表面抗原HA和NA的抗原性的差异分为不同亚型,目前已发现了17种亚型的HA蛋白,和10种亚型的NA蛋白[2]。具有高度传染性,经常在短期内突然暴发并迅速蔓延,造成不同程度的流行。早在1580年,流感暴发就首次为人类所详尽记载,近年来流感病毒的暴发也越来越频繁,如2009年暴发于美洲的H1N1甲型流感和在香港引起恐慌的H3N2流感,以及2013年在我国长江流域暴发的H7N9禽流感。
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丙型病毒性肝炎的诊断与治疗
1989年美国Choo等应用分子克隆技术,从受感染的黑猩猩血液标本中找到了一个与本病恢复期血清起阳性反应的克隆,命名丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV),由其引起的肝炎命名为丙型肝炎(hepatitis C,HC).初步研究表明在电镜下HCV为RNA病毒,其直径为55nm,呈球形颗粒,HCV基因组总长9 416个核苷酸,为单股正链,有一个大的开放读码框架,能编码3 014个氨基酸多肽,基因组的两侧分别为5'和3'端的非编码区,编码区从5'端依次为核蛋白(C)区,包膜蛋白(E)区和非结构(NS)区.后者又分为NS1、NS2、NS6、NS4、NS5、等区,NS1又称为E2/NS1.C区基因编码核壳蛋白,E1E2/NS1编码包膜糖蛋白,两者为病毒结构蛋白,NS2、NS6、NS4、NS5区各自编码不同功能的非结构蛋白,其中NS5编码HCV基因组螺旋酶,NS5编码HCV基因组的复制酶.传染源是急、慢性患者和亚临床感染者.传染播途径主要为输血及血液制品,也可通过血液透析、单采血浆、肾移植、性接触、静脉吸毒、母婴传播等.
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酵母表达的普马拉汉坦病毒核壳蛋白在欧(鼠平)模型中诱导保护作用
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141 小鼠鼻内接种含有16型HPV次要核壳蛋白L2交叉中和表位的多肽可诱生全身和粘膜抗体
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110减毒柯萨奇病毒核壳蛋白中表达的外源性多肽的免疫原性
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乙型肝炎HBeAg与HBV DNA定量关系的探讨
目前HBV DNA和HBeAg的存在及其水平是反映HBV感染及传染性强弱的直接可靠的指标,是临床上指导慢性乙型肝炎的诊断、治疗及预测疗效的重要依据.随着分子生物学技术,荧光免疫技术的发展,HBV脱氧核糖核酸及其血清标志物检测已由过去的定性检测发展到现在的定量检测.近年来关于HBeAg与HBV DNA定量关系的研究越来越多,在此,我们就HBeAg与HBV DNA的定量关系进行分析与探讨.一、HBV DNA与HBeAg的形成过程HBV DNA的复制分成两个阶段:第一阶段,在肝细胞核内,部分双链环状HBV DNA(rcDNA)进入肝细胞核后,在宿主酶的作用下,以负链DNA为模板延长正链,形成共价闭合环状DNA(cccDNA),然后以cccDNA为模板,在宿主RNA聚合酶Ⅱ的作用下,转录成几种不同长短的mRNA,其中3.5 kb的mRNA含有HBV DNA序列上全部遗传信息,称为前基因组RNA(pgRNA);第二阶段,在肝细胞质中,pgRNA被转运至肝细胞质,pgRNA和DNA聚合酶一起被核壳蛋白(HBcAg)包裹形成病毒核心,在核心颗粒内,pgRNA作为模板,在DNA聚合酶介导下,合成负链DNA;再以负链DNA为模板,合成正链DNA,形成子代的rcDNA,胞质中的子代rcDNA也可进入肝细胞核内,再形成cccDNA,维持cceDNA池并继续复制.另外一部分mRNA转译病毒蛋白:HBcAg、HBeAg、HBsAg、P蛋白、X蛋白[1].
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严重急性呼吸综合征-冠状病毒原核表达蛋白血清特异性抗体检测方法的比较
SARS冠状病毒(CoV)的主要结构蛋白包括刺突蛋白(S)、膜糖蛋白(M)、被膜蛋白(E)以及核壳蛋白(N)[1].N蛋白由422个氨基酸组成,在病毒体内含量丰富,是机体抗SARS-CoV免疫应答的主要靶蛋白之一[2].
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扁平疣不同时期病毒核壳蛋白L1抗原表达
扁平疣存在着明显的自愈现象,并已证明扁平疣自愈过程是以T细胞为主的免疫反应[1].为了解人类乳头瘤病毒(HPV)抗原在该过程中的表达情况,我们对不同时期的皮损用免疫组化方法对HPV的核壳蛋白主要抗原L1的变化进行观察,现将结果报道如下.