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转HJC-1和G6-EPSPS基因抗虫耐草甘膦水稻表达蛋白的小鼠急性经口毒性研究
目的 探讨转HJC-1和G6-EPSPS基因抗虫耐草甘膦水稻表达蛋白的急性经口毒性.方法 选择体重18~ 22 9、SPF级健康昆明种小鼠,禁食16 h后,G6蛋白以1693.3 mg/kg.BW剂量,HJC-1蛋白以751和1 502 mg/kg.BW2个剂量经口灌胃染毒,连续观察2周.结果 G6蛋白和751 mg/kg.BW剂量的HJC-1蛋白染毒后未见明显中毒症状,观察期内无死亡;1502 mg/kg.BW剂量的HJC-1蛋白雌雄各死亡1只.结论 G6表达蛋白对小鼠急性经口毒性LD50>1693.3 mg/kg.BW;HJC-1表达蛋白对小鼠急性经口毒性LD50>751 mg/kg.BW.
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结核病DNA疫苗的现状与未来
1990年Wolff等[1]在一次基因治疗的实验研究中意外地发现不加任何处理的基因也可在骨骼肌细胞中表达蛋白至少2月,从而产生了核酸疫苗或基因疫苗、基因免疫、核酸免疫的全新概念,开创了免疫学和疫苗学的新领域.核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗,由能引起机体保护性免疫反应的病原体抗原的编码基因和真核表达载体构建而成,它被注入机体后,通过宿主细胞的转录系统表达蛋白抗原,诱导宿主产生细胞免疫应答和体液免疫应答,从而达到预防和治疗疾病的目的.DNA疫苗可诱导全面的免疫反应,尤其是特异性CTL识别、杀伤、破坏被感染的细胞及清除细胞内的病原体,这对于清除寄生于巨噬细胞内的结核分支杆菌非常有意义.1996年以来WHO将结核病核酸疫苗研究列为资助的项目之一.本文概述了结核病DNA疫苗研究的现状,及其在结核病预防和治疗方面需进一步研究的问题和应用前景.
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一种适用于短肽制备抗体的亲和纯化方法
在免疫组织化学检测过程中,抗体的纯度对于减少检测背景和假阳性起着关键作用.为了获得高纯度的抗体,亲和纯化的方法被广泛应用[1-3].为了研究某种特定基因编码产物的时空表达模式,可将基因的序列克隆到原核表达载体上,获得目的基因的原核表达蛋白,用于制备抗体进行免疫组化研究.
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CpG寡核苷酸增强UPEC FimH疫苗黏膜免疫的实验研究
尿路致病性大肠杆菌(uropathogenic Escherichia coli,UPEC)是引起尿路感染(UTI)的主要病原菌.FimH蛋白是UPEC I型菌毛的黏附成分,介导UPEC侵入膀胱上皮细胞.本实验用FimH的真核表达质粒和蛋白免疫小鼠可产生较高浓度的IgG抗体.为提高尿路黏膜中保护性ISA的水平.以CpG质粒为佐剂,与FimH的真核表达质粒和原核表达蛋白进行不同组合免疫小鼠,观察不同组的小鼠产生的免疫反应.
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新疆出血热病毒S基因在真核系统的克隆和表达
目的在真核系统表达XHFV S基因片段,制备安全、特异、便于操作的S蛋白. 方法设计引物,扩增得到S基因编码片段,用杆状病毒表达载体pFastBac HT b克隆S基因,并在昆虫细胞中表达S基因. 结果地高辛探针杂交和PCR扩增结果表明成功地构建了含XHFV S基因片段的pBac-Sxhf质粒.SDS-PAGE分析表达产物在相对分子质量(Mr)为66×103下方出现1条明显的蛋白条带,Western blot发现该蛋白带可以与抗XHF病毒核蛋白单克隆抗体发生反应. 结论构建的含XHFV S基因的重组杆状病毒可以在昆虫细胞表达S蛋白,该蛋白可与特异性抗体相结合.
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重组小鼠Galectin-9在大肠杆菌中的表达以及体外功能检测
本研究旨在构建重组Galectin-9(半乳糖凝集素9)原核表达质粒,并对表达蛋白进行纯化和功能学鉴定.通过常规RT-PCR技术扩增小鼠Galectin-9基因序列,并将其插入质粒pET-11a的多克隆位点之间,构成重组表达质粒pET-11a-Galectin-9.
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乙型肝炎病毒S基因系列单突变克隆人工构建
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因高频突变位点(T126S,M133L,T144A)变异对HBV生物学活性的影响,开发新的检测HBsAg试剂盒,混合HBV多价疫苗及多效价的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG).方法:利用人工定点突变技术,基因重组,建立系列HBVS基因‘a'决定簇真核细胞表达的质粒.结果:测序和计算机软件分析,克隆的质粒基因突变序列完全正确,并且能在真核细胞中表达,被HBsAg单克隆抗体识别.结论:所构建的乙型肝炎病毒S基因单突变克隆能够在真核细胞表达蛋白,所表达的蛋白可以正确折叠,维持天然二级构象,具有良好的抗原性,为开发新的检测试剂盒,HBV疫苗及高效价的乙型肝炎免疫球蛋白奠定物质基础.
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HCVC区DNA疫苗的研究现状
1974年Golafield首先报告输血后非甲非乙型肝炎.1989年Choc et al应用分子克隆技术获得本病毒基因克隆,并命名本病及其病毒为丙型肝炎(Hepafifis C)和丙型肝炎病毒(HCV).由于至今尚未分离到病毒颗粒,使得必须以可得到的病毒核酸成分进行重组、表达蛋白,进而进行疫苗研究.本文详细阐述了HCVC区基因结构、HCVC蛋白功能以及HCV-C区DNA疫苗方面的内容及进展,以期为将来进一步的研究提供帮助.
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蛋白质免疫印迹(Western Blot)
该技术可以从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。原理:Western免疫印迹( Western Blot )是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
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CTGF在软骨中的研究进展
结缔组织生长因子(CTGF)是CCN家族成员之一.CCN(CTGF、Cef10/cyr61和Nov的缩写)家族包括半光氨酸富集蛋白(cysteine-rich61,CYR61/CCN1)、CTGF(CCN2)、肾母细胞瘤过度表达蛋白(ne-phroblastoma overexpressed,NOV/CCN3)、Wnt诱导信号通路蛋白-1(Wnt-induced secreted proteins-1,WISP-1/CCN4)、WISP-2/CCN5和WISP-3/CCN6.
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胃肠道间质瘤(GIST)的基因突变检测:支持诊断和预测格列卫治疗反应
在1998年[1]和2003年[2],一些关于胃肠道间质瘤的重要研究已经阐明胃肠道间质瘤存在c-kit或PDGFRA(platelet-derived growth factor receptor-alpha)基因突变,这种突变属于功能获得性突变.c-kit 或PDGFRA表达蛋白同属跨膜酪氨酸激酶受体,在一般情况下,与配体结合形成二聚体,从而激活酪氨酸激酶体系,参与机体的生理活动.两种受体基因任何一种发生突变,都会产生无配体作用下,受体自身持续性激活,并引领与细胞分化、生长、凋亡相关的下游信号传导活跃,导致细胞的肿瘤性生长.c-kit 和(或)PDGFRA基因突变,成为胃肠道间质瘤发生、发展的重要动因.这是近十年来病理学转化性研究重要成果的例证[3].
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喉鳞状细胞癌中p27和血管内皮生长因子与肿瘤血管形成的关系
我们采用流式免疫荧光技术对45例喉鳞状细胞癌组织中的抑癌基因p27和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表达蛋白进行过检测[1,2],现再用FⅧ因子抗体标记肿瘤组织血管内皮细胞,计算肿瘤内微血管密度(intratumoral microvessel density, IMVD),以了解其相互关系.
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鼻咽癌中蛋白酪氨酸磷酸酶基因表达的研究
鼻咽癌是我国南方高发恶性肿瘤,为常见的组织学类型是低分化鳞状细胞癌(简称鳞癌),其发生发展和转移涉及多种癌基因和抑癌基因的相互作用.近年来新发现的蛋白酪氨酸磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10/ mutated in multiple advanded cancer/TEP1,TGF beta regulated and epithelial cell enriched phosphatase 1,PTEN/MMAC1/TEP1,以下简称PTEN)被认为是一种新的肿瘤抑癌基因[1],其表达蛋白在人体多种肿瘤细胞的增殖和分化调控中起了重要作用.本研究采用超敏免疫组化技术(ultrasensitive immunohistochemistry,SP法),对40例鼻咽癌进行PTEN蛋白质表达水平的检测,以探讨该基因在鼻咽癌发生中的作用.
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真核细胞表达基因工程抗体的研究进展
大肠杆菌E.coli表达系统是非常常用、有效和方便的表达系统,可以进行许多异源蛋白的高效表达.然而原核细胞系统表达蛋白时,存在多种缺陷:真核基因通常含有内含子,原核细胞不能对其进行正确的剪切和拼接;缺乏真核生物的蛋白翻译后修饰和加工;表达产物多以包涵体形式存在,复性困难且效率很低;背景杂蛋白多、不易于纯化等,因此不可避免地对利用原核细胞表达基因工程抗体造成一定影响.
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转FBP7-iaaM基因棉籽表达蛋白的小鼠急性经口毒性研究
目的 探讨转FBP7-iaaM基因棉籽表达蛋白的急性经口毒性.方法 选择体重18~22 g的SPF级健康昆明小鼠16只,雌雄各半.禁食16h后,以iaaM基因表达蛋白2 000 mg/kg剂量一次经口灌胃染毒,连续观察2周.结果 该蛋白染毒后未见明显中毒症状,两周内未出现死亡.结论 iaaM基因表达蛋白对小鼠急性经口毒性LD50>2 000 mg/kg.
关键词: FBP7-iaaM基因 表达蛋白 小鼠 急性经口毒性 -
超声造影剂联合超声介导耐药基因反义寡脱氧核苷酸转染裸鼠肝癌细胞逆转多药耐药效应的研究
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,严重危害人类的健康.研究肝癌多药耐药(multi-drug resistance,MDR)是肝癌临床治疗迫切需要解决的问题,肝癌MDR与耐药基因mdr-1、mrp和相应表达蛋白P-gp、MRP(P190)密切相关[1].本研究以mdr1、mrp-反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)+超声造影剂+超声转染裸鼠QGY/CDDP肝癌移植瘤,以期实现在体对瘤细胞MDR的逆转并探讨其效应和作用机制.
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WT1异构体与白血病发生发展及预后的关系
WT1基因作为肿瘤抑制基因参与Wilms瘤的发生.然而,大量研究显示WT1基因作为一种重要的转录调控因子,参与许多肿瘤特别是白血病的发生,其通过两种选择性剪接编码产生四种主要异构体,不同异构体的功能及相互之间的比例与白血病的发生、发展及预后之间的关系逐渐引起人们的关注,本文就此进行综述.1 WT1基因的结构特点WT1基因定位于染色体11p13,全长约50 kb,有10个外显子,编码约2.9 kb mRNA.WT1蛋白含两个功能结构域,其羧基末端含有4个Cys-Cys-His-His锌指结构,为DNA结合功能区;氨基末端则富含谷氨酰胺和脯氨酸,与转录调控有关.WT1 mRNA经过选择性剪接可以编码四种同源异构体.在第五外显子处,编码17个氨基酸插入调控区与锌指区之间,可把WT1表达蛋白分为+17AA及-17AA两种异构体.在第九外显子末端即第三和第四锌指结构之间插入KTS(Lys-Thr-Ser)三个氨基酸,从而又可将WT1表达蛋白分为+KTS和-KTS两种异构体.通过不同的组合,可细分为四种主要的剪接体,这四种不同的含锌指结构的DNA结合蛋白分别为+ 17AA/+KTS,+17AA/-KTS,-17AA+KTS,-17AA/-KTS,以下分别简称为(+/+,+/-,-/+,-/-).四种异构体比例的严格平衡在细胞增殖、分化和凋亡的调节及肿瘤形成等方面同样起着重要作用.
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蛋白质组学技术及其在肺癌中的应用研究
蛋白质组学技术已广泛应用于探讨各种疾病的发病机制、早期诊断等,本文就其在肺细胞株、肺癌组织表达蛋白、肺癌血清等方面的研究进行综述.1 蛋白质组和蛋白质组学的概念
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PTEN表达与肿瘤
PTEN是Steck等3个国际科研小组分别克隆到的一种抑癌基因,是目前发现的第一个具有磷酸酶活性的抑癌基因.Pten蛋白的主要功能位于N端,符合蛋白酪氨酸磷酸酶及双特异性磷酸酶催化区的核心基序,并与张力蛋白、辅助蛋白高度同源.本文综述了Pten抑癌基因及Pten表达蛋白的发现、结构、作用机理和目前PTEN的研究进展.
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周期型马来丝虫复合基因重组质粒和相应表达蛋白的免疫学研究
目的 构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂/3-磷酸甘油醛脱氢酶(BmCPI/BmGAPDH)复合基因重组质粒,并转染人宫颈癌细胞(Hela)进行重组蛋白表达.将重组质粒和相应表达蛋白进行免疫学研究比较,为研制新型的抗丝虫基因工程疫苗提供理论及实验依据.方法 扩增周期型马来丝虫目的编码基因.将目的基因片段和载体分别双酶切后进行连接,构建复合基因重组质粒pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH,鉴定后转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞,进而通过RT-PCR和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株.亲和层析纯化所表达的重组蛋白并通过免疫蛋白印迹法(Western blot)对纯化的重组蛋白进行生物学鉴定.60只BALB/c小鼠分5组,每组12只,第2、4、6周分别免疫1次.磷酸盐缓冲液(PBS)对照组为注射PBS 100 μl;空质粒/CpG对照组为注射pcDNA3.1 100 μg和CpG 30 μg;复合重组质粒/CpG组为注射pcDNA3.1-BmCPI/BmGAPDH 100 μg和CpG 30 μg;复合重组蛋白/CpG组为注射pcDNA3.1-BmCPI/BmGAPDH复合重组蛋白50 μg和CpG 30 μg;复合重组质粒/复合重组蛋白/CpG组前2次注射pcDNA3.1-BmCPI/BmGAPDH 100 μg和CpG 30 μg;后1次注射pcDNA3.1-BmCPI/BmGAPDH复合重组蛋白50 μg和CpG 30 μg.用RT-PCR方法检测肌肉组织内目的基因;用酶联免疫吸附试验(ELISA)、特异性增殖试验(MTT法)分别检测免疫小鼠血清抗体效价、T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中细胞因子干扰素(INF)-γ、白细胞介素(IL)-4水平.结果 复合重组质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织扩增出目的基因.复合重组质粒/复合重组蛋白/CpG组小鼠免疫4、6周后血清抗体效价(1 695.12±1.43、3 199.63±1.34)均高于复合重组质粒/CpG组(712.69±1.08、1 510.08±1.43,P均<0.05)和复合重组蛋白/CpG组(800.02±1.34、1 510.08±1.43,P均<0.05);第6周的复合重组质粒/复合重组蛋白/CpG组小鼠淋巴细胞刺激增殖指数(1.629±0.235)高于复合重组蛋白组(1.248±0.110,P<0.05);免疫4、6周后,复合重组质粒/复合重组蛋白/CpG组和复合重组质粒/CpG组小鼠血清IFN-γ水平[(101.660±5.101)、(178.265±7.139)mg/L,(102.067±3.722)、(115.148±6.031)mg/L]均高于复合重组蛋白组[(75.438±2.102)、(82.004±3.777) mg/L,P均<0.05];免疫后6周,复合重组质粒/复合重组蛋白/CpG组和复合重组蛋白/CpG组的小鼠血清IL-4水平[(75.385±3.318)、(46.363±3.672)mg/L]均明显高于复合重组质粒/CpG组[(36.691±3.443)mg/L,P均<0.05).结论 pcDNA3.1-BmCPI/BmGAPDH核酸疫苗和相应蛋白疫苗均可诱导BALB/c小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答反应.核酸疫苗-蛋白疫苗联合免疫效果有明显的优势.
关键词: 马来丝虫 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 3-磷酸甘油醛脱氢酶 复合基因 表达蛋白 免疫