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SARS-CoV核衣壳蛋白单克隆抗体识别抗原位点的分析
SARS-CoV主要的结构蛋白包括刺突糖蛋白(spike glycoprotein, S)、包膜小蛋白(small envelope, E)、膜蛋白(membrane, M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, N).研究发现,N蛋白诱导机体产生很强的免疫应答[1],我们用SARS-CoV全病毒免疫小鼠制备的单克隆抗体,发现有80%是针对N蛋白的抗体,证明N蛋白具有很强的免疫原性,这与以往对动物冠状病毒N蛋白研究结果是一致的[2].本研究通过对SARS-CoV N蛋白单克隆抗体结合抗原位点分析,以及用SARS-CoV抗体阳性血清与单抗对N蛋白进行竞争抑制试验,分析自然状态下机体对N蛋白抗原位点的抗体应答,同时初步观察了临床应用情况.此结果有益于SARS-CoV生物学性状、蛋白组学、发病机制及诊断试剂的研究.
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戊型肝炎病毒实验室诊断技术的现状
戊型肝炎与甲型肝炎相似,是一种经肠道传播的自限性疾病.戊型肝炎病毒(HEV)是引起戊型肝炎的病原体.HEV主要通过粪-口途径传播.HEV主要分为4个基因型,1和2型主要在人群中传播,可引起流行和散发的戊型肝炎;3和4型可在人群与动物之间传播,是人畜共患性疾病,主要引起散发性的戊型肝炎.HEV是一种直径为27~34 nm的无包膜单股正链RNA病毒,基因组全长约7 500 bp,其5'端和3'端各含有一个非编码区,在5'和3'非编码区之间含有3个开放读码框架(ORF),依次为ORF1、ORF2和ORF3,ORF1编码病毒复制所需要的酶类,ORF2编码衣壳蛋白,可诱导机体产生保护性免疫反应;ORF3功能尚不清楚,但含有可被患者血清抗体识别的抗原表位[1-3].
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乙型肝炎病毒S基因系列单突变克隆人工构建
目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因高频突变位点(T126S,M133L,T144A)变异对HBV生物学活性的影响,开发新的检测HBsAg试剂盒,混合HBV多价疫苗及多效价的乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG).方法:利用人工定点突变技术,基因重组,建立系列HBVS基因‘a'决定簇真核细胞表达的质粒.结果:测序和计算机软件分析,克隆的质粒基因突变序列完全正确,并且能在真核细胞中表达,被HBsAg单克隆抗体识别.结论:所构建的乙型肝炎病毒S基因单突变克隆能够在真核细胞表达蛋白,所表达的蛋白可以正确折叠,维持天然二级构象,具有良好的抗原性,为开发新的检测试剂盒,HBV疫苗及高效价的乙型肝炎免疫球蛋白奠定物质基础.
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噬菌体展示技术的原理及应用
0引言1985年Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段进行改造,将EcoR Ⅰ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,表达产物能被抗EcoR Ⅰ内切酶抗体所识别.1988年Parmley et al[2]将已知抗原决定族与pⅢ的N端融合呈现在表面,可特异性地被抗体选择出来,并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.1990年McCafferty et al[3]也报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法,从而开始了这项技术的广泛应用的新时代.
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良性胆道疾病病人CA19-9升高原因探讨
CA19-9(carbolydrate antigen 19-9)是一种单克隆抗体识别的胃肠道肿瘤标志物,对许多消化道肿瘤,尤其是胆道、胰腺肿瘤诊断有较好的应用价值[1,2].但由于其并非某一消化道肿瘤的特异抗原,因此特异性不高,假阳性时有发生,如不加分析、判断,盲目应用,也会导致一些错误的诊断.现将第二军医大学附属东方肝胆外科医院1998年1月至2000年4月行ERCP检查中发现的良性胆道疾病病人CA19-9升高情况进行回顾性分析,报告如下.
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单链抗体技术及其在药用植物研究中的应用
抗原刺激动物免疫系统产生抗体,抗体识别抗原的部位在其重链和轻链的可变区(variable region).如果将抗体的可变区(VH和VL)通过弹性多肽接头(peptide linker)稳定地连接在一起,即为单链抗体(single chain fragments variable,scFv).scFv大小仅为完整抗体的1/6,但其完全保持了抗体的抗原特异性及抗原的结合能力,同时由于为单链,在大肠杆菌或植物体内等容易表达,无须组装即能保持活性.在植物研究领域,其可用于植物病理诊断、植物生物活性成分的检测、定量分析与分离精制;而将单链抗体基因转入植物细胞,更可使转基因植物获得诸如增强对病毒、除草剂等的抗性,体内生理活性物质增加,次生代谢产物量提高等新的特性.特别是通过转入单链抗体基因,提高药用植物中具生物活性的次生代谢产物量的技术,可望发展成为一种新的分子育种方法,可以在不需要明了目标成分的生物合成途径的情况下,提高其产量.
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抗转录中介因子1-γ抗体与特发性炎性肌病合并肿瘤相关性的研究进展
特发性炎性肌病(idiopathic inflammatory myopathy,IIM)是一组以骨骼肌受累为主要表现形式的获得性的异质性疾病,主要包括多发性肌炎(polymyositis,PM)、皮肌炎(der-matomyositis)和包涵体肌炎(inclusion body myositis,IBM)3种类型.临床实践中观察到IIM合并恶性肿瘤(cancer-associ-ated myositis,CAM)的病例并不少见,既往国内外的研究显示IIM患者并发肿瘤的风险为3%~40%[1],其中,皮肌炎合并肿瘤的发生率高于多发性肌炎[2],中国台湾的一项大规模的研究报道了皮肌炎并发肿瘤的发病率高达健康人群肿瘤发病率的10倍[3]早在2006年,Targoff等[4]报道在IIM患者体内存在一个针对相对分子质量为155 000蛋白质的自身抗体,该抗体在其他自身免疫病和非自身免疫病患者的体内均未被发现,似乎是IIM的特异性自身抗体,并且发现该抗体与合并肿瘤的成人IIM相关.随后的研究发现,该抗体识别的靶抗原是转录中介因子1-γ(transcriptional intermediary factor 1-γ,TIF1-γ)蛋白[5].近来研究显示,抗TIF1-γ抗体可能是致病性抗体,与肌炎,尤其是肌炎合并恶性肿瘤的发生机制相关.
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特发性膜性肾病与M型磷脂酶A2受体
膜性肾病是导致成人患者原发性肾病综合征的常见原因.其中特发性膜性肾病约为80%.膜性肾病的发病系循环中的自身抗体识别肾小球足细胞的靶抗原,抗原抗体结合后,在上皮下形成免疫复合物,激活补体形成膜攻击复合物,导致基底膜和肾小球滤过屏障受损,出现蛋白尿[1,2].近半个世纪以来,人们针对特发性膜性肾病的靶抗原作了大量研究,并取得了实质性进展,其中,M型磷脂酶A2受体(M-type phospholipase A2 receptor,PLA2R)是近年来研究的热点,现就PLA2R与特发性膜性肾病之间的关系综述如下.
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ACTH单克隆抗体的制备和鉴定
ACTH是垂体分泌的重要激素之一,测定血浆ACTH对下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的评 价 具有重要意义。制备ACTH单克隆抗体,以期建立ACTH-IRMA方法。 ACTH或其片段与BSA经碳化二亚 胺偶联剂联接后制备免疫原,初次免疫为完全福氏佐剂乳化后在背部皮下多点注射,ACTH剂 量约40 μg,以后每隔4 w以不完全福氏佐剂乳化后在背部或腹腔交替注射4~6次,剂量减 半 。融合前3 d每天以无佐剂的ACTH联接物行腹腔注射,总剂量为60 μg。按常规方法进行细 胞融合,每周换液2至3次。阳性克隆的筛选:培养上清液抗体检测按常规RIA进行,计算结 合率,以结合率大于3倍的非特异结合率为阳性。阳性孔经有限稀释法亚克隆3~4次后获得 2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,5G2为ACTH1-28片段所得,D3为ACTH1-13片 段所得。扩增 细胞,一部分冻存,另一部分种于已致敏的BALB/c小鼠腹腔产生含抗体的腹水。收集的腹水 稀释后,以RIA法测定各稀释点抗体的结合率,计算5G2和D3腹水抗体在50%结合率时的终稀 释度分别可达1:5 000和1:2 000。以 1%琼脂双扩(梅花孔)法作抗体亚类鉴定,5G2和D3抗 体 均为IgG1类型,轻链为λ链。根据标准曲线参数,通过公式6y0/(1- y0)(2- y0)(4- y0)( 3ED50-ED25) 计算5G2和D3抗体的亲和常数分别为5.1×109和4.9 ×107 M-1。以ACT H不同片段作 交叉反应试验,进行特异性鉴定。5G2和D3抗体与ACTH1-10、ACTH1-17、 ACTH1-24的交叉反 应率分别为0.04%、8.70%、100.00%和0、35.30%、69.30%。据此推断5G2抗体识别ACTH 氨基酸序列 的17~28片段,D3抗体识别ACTH氨基酸序列的10~13片段。 以羊抗鼠IgG-Sephadex G75偶 联 物层析柱,进行腹水抗体的亲和纯化。按本室的方法将纯化的5G2和D3抗体分别包被马来酸酐 -苯乙烯共聚物塑料管,制备固化抗体管,以125I-ACTH做固相放免, 通过大结合率 确定5G2和D3抗体的饱和结合量分别为5 μg和20 μg,为建立固相IRMA奠定了基础。 ACTH是 垂体分泌的39肽分子,由于ACTH分子量小,在体内半衰期短;ACTH氨基酸序列只在第26至 33之间有3个氨基酸残基有种属差异,小鼠的免疫细胞不易识别,终导致小鼠不易产生抗 体。在本实验中只有18.3%的小鼠血清抗体阳性,而且抗体滴度不高。我们经过反复筛选获 得的2株抗体分别识别ACTH氨基酸序列的第17~28片段和第10~13片段,其亲和常数分别达 109和107 M-1, 用于液相放射免疫分析不足以达到理想的灵敏度,据文 献报道使用2个单 克隆抗体,建立IRMA方法,则灵敏度可显著提高。由于这2株单抗识别的位点不同,有望建 立ACTH-IRMA方法。
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血清CA-125检测对肝癌、肝硬化的临床评价
CA-125是一种高分子糖蛋白复合物,可被OC125抗体识别的人卵巢浆液性抗原,不稳定,分子量为20-100万之间,对卵巢及生殖系统肿瘤有重要诊断价值[1].
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1例胰腺癌患者血清CA242的动态观察
CA242是一种唾液酸化的糖类抗原,能被CA242单克隆抗体识别,它是一种粘蛋白类型的糖蛋白.在健康人和良性疾病血清中含量很低,在消化道肿瘤患者血清中可升高,特别是对于胰腺癌的诊断有较高的特异性和阳性率.
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HLA与组织配型
HLA历史、HLA成就和HLA在器官移植组织配型中的技术应用早期重要的发现是由科学家们各自独立地作出的,但有力地推动这一领域发展的是一种学术交流特有方式--"组织相容性专题讨论会(Internation Workshop)",在专题讨论会中,学者们通过演示各自实验室的研究技术和心得来推动HLA基因分型和HLA抗体识别的演变历程,实现HLA对器官移植发展的宏观价值和微观意义.
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pKi67及其临床应用现状
细胞增殖分裂受多种因素调节,由细胞周期长短、细胞生成数量及生长分数决定.在细胞周期中,细胞DNA复制合成、有丝分裂除必需有关酶系外,还有些蛋白质与细胞增殖密切相关,可被相应抗体识别,被称为细胞增殖相关抗原,如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、pKi67、核仁组成区嗜银蛋白(Ag-protein in nuclear organizer regions,AgNor)、statin、p53.pKi67是一种与细胞增殖密切相关的核内蛋白.因其只表达于增殖细胞各期中,静止期细胞阴性,而被作为评价细胞生长分数的有效指标,广泛应用于临床及基础研究.
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Fas/FasL研究现况
1概述1989年,日、美两个科研小组分别从小鼠中分离出对多种人体细胞系有溶解作用的抗体,并把这种抗体识别的细胞表面蛋白分别称为APO-1和Fas.后来经分子克隆出的cDNA证明APO-1和Fas是一种成分.