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HIV-1相关炎性细胞因子诱导人血管内皮细胞中潜伏感染KSHV的溶解性周期复制
目的研究HIV-1感染相关炎症细胞因子是否能够激活人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)中潜伏感染的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV);探讨该激活作用是否由KSHV Rta基因所介导.方法采用体外模拟系统,研究了与HIV-1感染T细胞诱生的细胞因子相似的重组人细胞因子对HUVEC中潜伏感染的KSHV复制的影响.通过Northern blot和定量PCR检测ORF26(该基因编码的病毒次要衣壳蛋白仅在KSHV被激活时表达) mRNA表达来分析KSHV的激活.运用KSHV Rta基因启动子(KSHV复制时先被激活的启动子)驱动的虫荧光素酶报告基因进一步证实并扩展研究结果.结果包括干扰素-γ(IFN-γ)、肝细胞生长因子/扩散因子(HGF/SF)及制瘤蛋白M(oncostatin M, OSM)在内的重组细胞因子不仅可诱导HUVEC中潜伏感染的KSHV发生溶解性周期复制,而且能增强Rta启动子活性.结论 HIV-1感染相关的炎性细胞因子是诱导HUVEC中KSHV溶解性周期复制的因素,而且该过程至少有部分由KSHV的Rta启动子介导.
关键词： 细胞因子 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 复制和转录激活蛋白 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒K12基因诱导裸鼠体内肿瘤的形成
目的证实卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)K12基因在体外可以转化小鼠成纤维细胞系NIH3T3细胞,体内可以诱导肿瘤的形成. 方法采用PCR法构建含KSHV K12基因的重组反转录病毒表达质粒,将该质粒转染NIH3T3细胞,嘌呤霉素筛选获得稳定细胞.采用软琼脂集落形成试验和裸鼠成瘤试验,分别证实K12基因体外转化细胞和体内致瘤特性.免疫组化(IHC)染色进一步评价转化细胞及其诱导的肿瘤组织中血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Fas和FasL的表达水平. 结果K12基因转化的NIH3T3细胞在软琼脂中可以形成集落、在裸鼠体内可以形成肿瘤;转化的细胞及其诱导的肿瘤组织中可观察到VEGF、Fas和FasL的表达,其中,Fas和FasL的表达较高. 结论 KSHV K12基因具有体外转化细胞、体内诱导肿瘤形成的能力.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 K12基因 转化 肿瘤 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白gpK8.1的抗原性与免疫原性分析
目的 表达并纯化卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白gpK8.1,分析其抗原性和免疫原性.方法 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-ogalactopyranoside,IPTG)诱导重组大肠杆菌表达KSHV gpK8.1,用KSHV病人阳性血清作为抗体,经ELISA和Western blot检测其抗原性;用纯化的gpK8.1蛋白免疫新西兰兔,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用Western blot检测兔抗gpK8.1多克隆抗体特异性识别重组与天然gpK8.1抗原的能力,评价其免疫原性.结果 ELISA和Western blot证实3份KSHV阳性血清均能识别重组gpK8.1蛋白;重组gpK8.1蛋白免疫动物6周后,兔血清多克隆抗体效价达到105.结论 高效表达并纯化的gpK8.1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为KSHV检测试剂和疫苗研究提供了基础资料.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 包膜糖蛋白gpK8.1 抗原性 免疫原性 -
抗原捕获ELISA检测卡波济肉瘤相关疱疹病毒的方法建立
目的 建立检测卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的抗原捕获ELISA方法,初步探讨其临床应用的可行性. 方法 以纯化的抗gpK8.1单克隆抗体(McAb)和多克隆抗体(PcAb)配对作为包被抗体和检测抗体,建立和优化抗原捕获ELISA检测方法,评价其敏感性、特异性和重复性,并初步用于3例已知KSHV阳性血清和257例临床血清样品中抗原的检测. 结果 包被的McAb浓度为5μg/ml、检测抗体浓度为1.6 μg/ml时,P/N值高,检测的敏感度为31.28 ng/ml,且与EB病毒(ESV)、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)、单纯疱疹病毒2型(HSV-2)等抗原无交叉反应,特异性高.检测3例KSHV阳性患者血清均为阳性,在257例临床血清样品中,4例捕获到KSHV抗原. 结论 建立了检测KSHV的抗原捕获ELISA方法,为可能的KSHV检测试剂研制提供重要实验依据.
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细胞周期蛋白激酶9(CDK9)对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解复制周期的影响
目的 探讨细胞周期蛋白激酶9(cyclin-dependent kinase 9,CDK9)在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi′s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)裂解复制周期中的作用.方法 分别应用CDK9特异性抑制剂FIT-039处理或CDK9小干扰RNA(siRNA)转染iSLK.219及TREx-K-Rta BCBL-1细胞,四环素(Dox)或佛波酯(TPA)和丁酸钠刺激48 h后,分别采用荧光显微镜和实时定量PCR(qPCR)方法观察红色荧光蛋白(RFP,病毒裂解复制)阳性细胞数目及KSHV相关基因的mRNA转录水平.染色质免疫沉淀(ChIP)试验检测KSHV PAN启动子上RNA PolⅡ及其磷酸化CTD-S2的富集含量.结果 FIT-039处理和CDK9-siRNA转染后,iSLK.219细胞RFP阳性率显著降低、TREx-K-Rta BCBL-1细胞中KSHV裂解复制周期相关基因ORF50、PAN及K2的mRNA转录水平明显下降.且FIT-039处理后,TREx-K-Rta BCBL-1细胞中KSHV PAN启动子上结合的RNA PolⅡ及其磷酸化CTD-S2含量显著下降.结论 CDK9可能通过磷酸化RNA PolⅡ丝氨酸调控KSHV病毒裂解复制.
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抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒vIL-6蛋白合成肽多克隆抗体的制备及初步应用
目的 制备与鉴定抗卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)多克隆抗体,并探讨将其初步应用于检测天然vIL-6蛋白的价值.方法 设计并合成3条vIL-6候选肽,免疫新西兰兔,制备抗vIL-6多克隆抗体,用间接ELISA法鉴定该抗体的效价.构建重组质粒pHAGE-vIL-6并转染293T细胞和EA.hy926细胞,表达并纯化vIL-6-His融合蛋白,通过western blot鉴定抗vIL-6多克隆抗体对该蛋白质的识别.通过western blot和免疫荧光方法检测对KSHV阳性细胞中天然vIL-6蛋白的识别.结果 由3号vIL-6候选合成肽制备的抗vIL-6多克隆抗体效价大于8 000,能特异性识别重组质粒pHAGE-vIL-6转染293T细胞和EA.hy926细胞产生的vIL-6-His融合蛋白,以及天然vIL-6蛋白.结论 本实验采用合成肽作为半抗原制备的抗vIL-6多克隆抗体,可以应用于检测重组和天然vIL-6蛋白.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 病毒白细胞介素6蛋白 合成肽 多克隆抗体 -
KSHV抗凋亡蛋白vFLIP编码基因的克隆表达及抗vFLIP多克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备由卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,vFLIP)的多克隆抗体,通过vFLIP重组蛋白对该抗体特异性进行鉴定,并将此抗体初步应用于天然病毒vFLIP蛋白表达的检测.方法:对vFLIP蛋白抗原表位进行预测分析,设计并合成3条多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为抗原,免疫新西兰白兔,制备抗vFLIP的多抗;以pCDH-vFLIP质粒为模板扩增vFLIP片段,插入到真核表达载体pEF-MCS-Flag-IRES/Puro中,构建pEF-vFLIP表达载体,利用脂质体将其转染HEK293T细胞,并在其中表达vFLIP.采用ELISA、蛋白质印迹法鉴定vFLIP多克隆抗体的效价及特异性,将该抗体用于天然病毒vFLIP的检测.结果:经限制性内切酶鉴定和核酸序列测定证实成功构建了重组质粒pEF-vFLIP,Flag抗体可以特异性识别该质粒在HEK293T和EA.hy926细胞内表达的vFLIP-flag融合蛋白.进一步的ELISA结果显示,制备的兔抗vFLIP多克隆抗体效价为1:11 000以上.该抗体不但与HEK293T和EA.hy926细胞内表达的重组vFLIP-flag融合蛋白反应,而且能够特异性识别PEL细胞中天然的病毒vFLIP蛋白.结论:构建了含vFLIP基因的重组真核表达载体;采用人工合成肽作为半抗原制备的抗KSHV vFLIP多抗,可以成功地检测重组vFLIP蛋白和天然病毒蛋白.
关键词： 病毒FLICE抑制蛋白 合成肽 多克隆抗体 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 -
含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定
目的:在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)vIL-6基因,并进一步纯化和鉴定表达蛋白.方法:以本实验室已构建的重组质粒pGEX-6p-1-vIL-6为模板,PCR扩增目的基因片段,将PCR产物克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,构建vIL-6的重组原核表达质粒pET-32a(+)-vIL-6.将重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实,成功构建了含有vIL-6基因的原核表达载体.蛋白质印迹法结果显示,在大肠埃希菌BL21(DE3)中His-Tag融合蛋白得到了表达,亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL-6融合蛋白.结论:重组质粒pET-32a(+) -vIL-6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达,利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白.
关键词： 病毒白细胞介素6基因 原核表达 融合蛋白 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 -
KSHV包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A和gL的克隆及真核表达
目的:克隆并在293T细胞中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白编码基因K8.1、K8.1A与gL.方法:以BCBL-1细胞总DNA为模板,用PCR方法扩增出K8.1和gL基因;以BCBL-1细胞的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出K8.1A基因.将PCR产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,分别构建含K8.1、K8.1A和gL基因的重组真核表达质粒.重组质粒转染293T细胞,用Western blot的方法检测K8.1和K8.1A在293T细胞中的表达;RT-PCR方法检测gL基因在293T细胞中的转录.结果:核酸序列分析的结果表明,克隆的K8.1、K8.1A和gL基因与GenBank中已登记的KSHV K8.1、K8.1A和gL基因序列100%同源.Western blot结果显示,在约35 ku位置有目的条带,与预期的重组K8.1和K8.1A蛋白大小一致.RT-PCR结果显示约在500 bp位置检测到特异性条带.结论:KSHV K8.1、K8.1A和gL编码基因在293T细胞中获得正确表达.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 包膜糖蛋白编码基因 真核表达 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染前列腺上皮细胞并激活Wnt信号通路的初探
目的:研究卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是否能够感染前列腺非致瘤性上皮细胞系RWPE-1及前列腺癌细胞系PC-3,并初步探索其相关信号通路变化.方法:将12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BC-3,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染RWPE-1及PC-3,观察前列腺细胞的细胞病变效应(CPE).采用RT-PCR检测KSHV即刻基因ORF50 mRNA转录状况:进一步运用Western blot检查病毒裂解期产物病毒白细胞介素6(vIL-6)的蛋白表达水平:后采用Western blot法检测被感染细胞胞浆和胞核中β-catenin表达水平.结果:PC-3细胞感染KSHV后未见明显CPE,但RT-PCR和Western blot均在预期位置检测到KSHV基因ORF50和vIL-6的mRNA及其编码的蛋白条带.RWPE-1细胞感染KSHV后可出现明显的CPE.感染后24 h可以检测到vIL-6的表达.Wnt通路蛋白β-catenin在感染KSHV的RWPE-1细胞胞浆和胞核均呈上升趋势.结论:KSHV可以感染前列腺细胞系并有可能激活Wnt通路.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 前列腺癌 感染 Wnt通路 -
HIV-1 Tat对KSHV感染SK-N-SH细胞的影响
目的:初步探索人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)反式激活蛋白(Tat)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)感染人神经母细胞瘤细胞系SK-N-sH细胞(SK细胞)的影响.方法:将原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-I细胞与SK细胞共培养.观察SK细胞的细胞病变效应(CPE)并采用Real-time PCR检测KSHV在SK细胞中的复制.重组质粒Tat+pcDNA3.1(+)和空载体pcDNA3.1(+)分别转染SK细胞,经G418筛选获得抗性克隆,以RT-PCR和Western blot检测Tat基因的表达.通过BCBL-1细胞与SK-Tat/SK-vector细胞共培养,采用Real-time PCR检测SK-Tat/SK-vector细胞中KSHV裂解期基因ORF50和26的mRNA表达.结果:细胞共培养后,SK细胞出现CPE且SK细胞中检测到KSHV的基因.RT-PCR和Western blot均在Tat预期位置检测到特异性条带.Real-time PCR检测显示Tat降低KSHV ORF50和26 mRNA转录水平.结论:初步探索表明,在细胞共培养过程中Tat蛋白抑制KSHV在SK细胞中的复制.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 HIV-1'Tat 共培养 -
HIV-1 假病毒的构建及对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系的感染研究
目的:分离、克隆水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)的包膜糖蛋白(VSV-GP)编码基因,包装人类免疫缺陷病毒1型human immunodeficiency virus-1,HIV-1)假病毒,并研究其对人原发性渗出性淋巴瘤细胞系 BCBL-1 细胞的感染状况.方法:根据GenBank登记的VSV-GP基因核苷酸序列设计1对PCR引物,其5'端分别引入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点.以质粒 pHCMV-G为模板,PCR扩增VSV-GP基因,经双酶切后定向克隆进真核表达载体 PcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒 pVSV-GP.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后与含包装和复制功能缺陷的 HIV-1 基因组重组质粒 pNL4-3.Luc.R-E-共转染人胚肾HEK 293T细胞.收获细胞进行Western blot,检测HIV-1 p24蛋白的表达;收获HIV-1假病毒感染 BCBL-1 细胞,进行虫荧光素酶(Luciferase)报告基因活性检测以及用ELISA的方法检测感染后细胞上清中 HIV-1 p24蛋白的含量.结果:PCR分离、克隆的 VSV-GP 序列全长1 536 bp,序列经过核酸分析证实;Western blot在 HIV-1 p24 蛋白预期位置检测到特异性条带;HIV-1 假病毒感染 BCBL-1 细胞后上清可以检测到HIV-1 p24蛋白,并且测得 Luciferase 活性值较对照组显著增高(P<0.05).结论:成功包装了 HIV-1 假病毒,并且该病毒可以感染 BCBL-1细胞.
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IL-10、IL-4及其受体启动子在人类单纯疱疹病毒1型激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒复制过程中的启动活性分析
目的:分离和鉴定人类IL-10、IL-10受体(IL-10Rα)、IL-4及其受体IL-4Rα启动子序列,并分析IL-10、IL-4以及其受体的启动子在人类单纯疱疹病毒1型(HSV-1)激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)过程中的启动活性.方法:以人类基因组DNA为模板,PCR扩增IL-10、IL-10Rα、IL-4Rα启动子区序列,并分别克隆载入pGL-3基本载体中虫荧光素酶(Luciferase)报告基因的上游.进一步将上述构建的重组质粒与本室保存的含IL-4启动子重组质粒分别转染HSV-1感染的BCBL-1细胞,并作Luciferase活性检测.结果:分离了IL-10、IL-10Rα和IL-4Rα的启动子区域序列,并成功克隆了含启动子序列重组报告质粒;HSV-1感染的BCBL-1细胞在进一步转染了IL-10、IL-10Rα、IL-4和IL-4Rα启动子重组报告质粒后,其Luciferase值与相应的对照比较显著升高(P＜0.05).结论:在BCBL-1细胞中,HSV-1可通过直接激活IL-10、IL-4以及相应受体的启动子来上调它们的表达;在HSV-1感染的BCBL-1细胞中,IL-10和IL-4可能对KSHV的裂解复制起到促进作用.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 人类单纯疱疹病毒1型 白细胞介素 启动子活性 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定
目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定.方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株.采用Western blot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHV K8.1包膜糖蛋白的能力.结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Western blot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHV K8.1包膜糖蛋白.结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体.
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卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究
目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达.方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5'端分别引入BamH Ⅰ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1(+).进一步在原有的下游引物5'端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒.将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆.后用抗flag M2单克隆抗体进行Western blot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达.结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671 bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHV vIL-6基因呈现100%同源性.Western blot结果显示,在约25 ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致.结论:KSHV vIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 病毒编码IL-6 flag序列 真核表达 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA的克隆及在真核细胞中的表达
目的:分离、克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA,并将其置于真核细胞中进行表达.方法:用K8.1B基因设计一对PCR引物,其5'端分别引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点.以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增KSHV K8.1B编码序列,经双酶切后克隆进pcDNA3.1(+)载体中,构建含K8.1B cDNA的重组真核表达质粒.重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后转染人胚肾293细胞,经G418筛选获细胞克隆.用间接免疫荧光染色(IFA)检测K8.1B cDNA编码蛋白在293细胞中的表达状况.结果:RT-PCR分离、克隆的K8.1B cDNA全长501 bp,核酸序列分析显示,该基因与Genbank中已登记的K8.1B编码基因呈现100%同源性.经IFA证实该重组蛋白为KSHV K8.1B特异性蛋白.结论:KSHV包膜糖蛋白K8.1B编码cDNA在293细胞中获得了正确表达.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 K8.1B RT-PCR 免疫荧光染色 -
病毒白细胞介素6对甲基转移酶1表达的影响
目的:观察病毒白细胞介素6(viral interleukin-6,vIL-6)对甲基转移酶1(DNA methyltransferase l,DNMT1)表达的影响.方法:vIL-6真核表达质粒转染293T细胞,荧光定量RT-PCR和Western blot法检测DNMTI表达的变化,比色法检测DNMT1的活性.结果:荧光定量RT-PCR和Western blot均表明vIL-6可显著促进DNMT1的表达,且vIL-6能上调DNMT1的活性.结论:vIL-6能诱导DNMT1的表达,可能是卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)致DNA甲基化异常,促进肿瘤发生发展的分子机制之一.
关键词： vIL-6 甲基转移酶1 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒体外感染人牙龈成纤维细胞初探
目的:探索卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)体外感染人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)的途径和方法,为研究KSHV导致口腔卡波济肉瘤病变的机制提供依据.方法:用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞系的BC-3细胞,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染HGF细胞.观察细胞病变效应(cytopatric effect,CPE).采用RT-PCR和Western blot分别检测HGF细胞内KSHV编码基因的转录情况和蛋白表达水平.结果:KSHV感染HGF细胞后可出现CPE;感染后采用RT-PCR可检测到不同时间点ORF26和ORF73基因的转录;感染后12 h可检测到vIL-6蛋白的表达.结论:KSHV可感染HGF细胞并建立潜伏感染,为进一步研究KSHV导致的口腔kS发病机制提供了较好的体外模型.
关键词： 口腔卡波济肉瘤 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 人牙龈成纤维细胞 感染 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原编码基因的克隆及表达
目的:分离卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核心抗原(LANA)羧基端基因(0RF73C),并在大肠杆菌中克隆和表达.方法:设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点,提取稳定状态的BCBL-1细胞的总DNA作模板,通过PCR扩增KSHV ORF73C,PCR产物经双酶切后按正确的读码框克隆进原核表达质粒pGEX-6p-1中,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白.结果:经核酸序列测定及分析,分离、克隆的ORF73C基因与基因数据库中登记的ORF73基因的羧基端的621bp的序列有99%同源性.经IPTG诱导的重组质粒转化菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳显示有大小约为46ku的融合蛋白表达.结论:初步表明ORF73C基因在大肠杆菌中获得正确表达.
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病毒白细胞介素-6对抑癌基因p16启动子区甲基化及蛋白表达的影响
目的 观察病毒白细胞介素-6(viral interleukin-6,vIL-6)对抑癌基因p16启动子区甲基化及蛋白表达的影响.方法 以vIL-6真核表达质粒转染293T细胞(转染组)为实验,空载体转染的293T细胞(空载体组)和未转染的293T细胞(未转染组)为对照,3组均采用Western blot法检测DNA甲基转移酶1的表达情况,甲基化特异性PCR法检测p16启动子区甲基化状态,荧光定量RT-PCR和Western blot法检测p16基因的表达.结果 转染组DNA甲基转移酶1蛋白表达较未转染组和空载体组增加；转染组p16基因启动子区出现甲基化改变；转染组p16 mRNA表达量明显低于未转染组和空载体组,差异有统计学意义(P＜0.05)；转染组P16蛋白表达较未转染组和空载体组降低.结论 vIL-6可上调DNA甲基转移酶1表达,导致抑癌基因p16启动子区甲基化,抑制p16基因表达；vIL-6所致的DNA甲基化改变,可能是其致瘤机制之一.
关键词： 病毒白细胞介素-6 p16 卡波济肉瘤相关疱疹病毒
