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细胞内Ca2+在轮状病毒感染对Caco-2细胞NHE3蛋白调控中的作用
目的 研究轮状病毒(rotavirus,RV)感染对Caco-2细胞表面钠-氢(Na+-H+)交换蛋白3(NHE3)水平和生物活性的影响及其调控机制.方法 构建表达NHE3的Caco-2细胞模型,分为对照组(CTL组)、RV组、细胞内Ca2+络合剂BAPTA-AM组和BAPTA-AM+RV组,用BCECF-AM法和细胞表面NHE3生物素化法测定Na+-H+交换蛋白活性和细胞表面NHE3蛋白水平,Western blot测定细胞Cdc42蛋白水平.结果 与CTL组相比,RV感染可引起细胞Na+-H+交换蛋白活性以及细胞表面NHE3蛋白水平明显降低,此抑制作用可被BAPTA-AM拮抗,此外RV感染可引起Cdc42蛋白水平升高,这一作用也可被BATPA-AM拮抗.结论 RV感染对NHE3蛋白水平及生物活性的调控可能与细胞内Ca2+介导的Cdc42依赖性内吞途径有关.
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TAT-LHRH修饰的壳聚糖/DNA纳米粒的细胞内吞途径
目的 探索对肝癌细胞HepG2具有较高转染效率和靶向性的TAT-LHRH修饰的壳聚糖/DNA纳米粒的内吞途径.方法 采用复凝集法,将荧光标记的质粒DNA与壳聚糖或TAT-LHRH修饰的壳聚糖混合制备壳聚糖/DNA纳米粒(CDN)和TAT-LHRH修饰的壳聚糖/DNA纳米粒(TLCDN).观察3种内吞途径抑制剂Chlorpromazine、Filipin或Dynasore对HepG2细胞摄入CDN或TLCDN的影响,用高内涵采集数据并分析.结果 Chlorpromazine对CDN摄入的抑制作用高于对TLCDN摄入的抑制作用,但其差异无统计学意义；Filipin明显抑制HepG2对TLCDN的摄入,但对CDN的摄入则起促进作用；Dynasore能同时抑制HepG2对上述2种纳米粒的摄入,且程度基本相同.结论 肝癌细胞HepG2对CDN的摄入主要通过网格蛋白依赖性细胞内吞途径,而对TLCDN的摄入途径包含网格蛋白依赖性细胞内吞途径和小窝蛋白介导的细胞内吞途径,但以后者为主.
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精氨酸修饰的壳聚糖作为基因载体的跨膜机制研究
目的 研究证实精氨酸修饰壳聚糖(ACS)制备的载基因纳米粒子显著地提高壳聚糖(CS)基因载体的转基因效率,该文进一步探索ACS摄入及跨膜机制对基因转染效率的影响.方法 用荧光标记的CS或者ACS与荧光素酶质粒DNA复合制备CS载基因纳米粒子[壳聚糖载基因纳米粒子(CGN),精氨酸修饰壳聚糖载基因纳米粒子(ACGN)];与大鼠平滑肌细胞系A10细胞、不同跨膜通道的抑制剂(氯丙嗪、非律平和Dynasore)共孵育,以评价其基因递送的跨膜途径.通过与不同跨膜途径的抑制剂共转染,观察不同跨膜通道对转基因效率的影响.结果 ACGN细胞摄入量是CGN的2倍[(1.534±0.016) μg/mg蛋白质vs (0.755±0.007) μg/mg蛋白质].与CGN相比,ACGN内乔通道有所改变,非律平(质量浓度5μg/mL,小窝蛋白内乔通道的特异抑制剂)能显著地抑制ACGN的细胞摄入(46.6％)和转基因效率(48.2％),而小窝蛋白内吞通道对CGN作用不明显.结论 实验数据显示,ACS改变了基因载体的内吞通道,促进了基因纳米粒子的细胞摄入量,同时也大幅度地提高了转基因效率.
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JEV入侵BHK-21细胞内吞途径的初步研究
目的 利用Real-time RT-PCR技术研究,对乙型脑炎病毒入侵细胞的内吞途径进行初步研究.方法 选用氯丙嗪、制霉菌素和细胞松弛素D3种药物分别处理细胞,以分别阻滞网格蛋白介导内吞途径、细胞膜穴样内陷途径和巨胞饮途径,然后进行JEV感染实验,通过Real-time RT-PCR方法测定感染后1h、12h、24 h细胞内的病毒拷贝数.结果 与仅实施感染实验、未进行药物处理的对照组比较,3种药物处理组的细胞内病毒拷贝数在感染后各时相点均呈现不同程度的下降,在感染1h、12h和24 h后,氯丙嗪处理组细胞内病毒拷贝数分别下降了59.58％,53.34％和61.35％；细胞松弛素D组细胞内病毒拷贝数分别下降了23.59％,30.77％和30.14％；制霉菌素组细胞内病毒拷贝数分别下降了35.56％,34.40％和34.40％.结论 乙型脑炎病毒主要利用网格蛋白介导内吞途径进入BHK-21细胞.
关键词： 乙型脑炎病毒 实时荧光定量RT-PCR 内吞途径 -
JEV和EV71感染SH-SY5Y细胞内吞途径的初步研究
目的 初步探讨乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)感染人神经细胞的内吞途径机制.方法 通过蛋白酶K实验检测JEV和EV71感染人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的入侵速率.采用MTT法检测针对不同内吞途径关键分子的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)以及化学抑制剂对SH-SY5Y细胞的细胞毒性.用JEV和EV71感染siRNA或化学抑制剂预处理的SH-SY5Y细胞,荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测不同处理对两种病毒mRNA和靶蛋白表达的影响.结果 确定针对网格蛋白重链的siRNA (siCHC)高工作浓度为50nmol/L,针对小窝蛋白1的siRNA (siCAV1)的高工作浓度为100 nmol/L.qRT-PCR结果显示,siCHC转染神经细胞能抑制EV71 mRNA的表达(t=17.153,P＜0.01),但不能抑制JEV mRNA的表达(P＞0.05);而siCAV1转染神经细胞能抑制JEV mRNA的表达(t=11.406,P＜0.01),但不能抑制EV71 mRNA的表达(P＞0.05).针对网格蛋白途径的化学抑制剂氯丙嗪(Chlorpromazine)可抑制EV71 mRNA的表达(t=4.114,P＜0.05),且呈剂量依赖性,而氯丙嗪并不影响JEV mRNA的表达(P＞0.05);针对小窝途径的化学抑制剂非律平(Filipin)可抑制JEV mRNA的表达(t=4.064,P＜0.05),且呈剂量依赖性,而非律平并不影响EV71 mRNA的表达(P＞0.05),与siRNA结果相一致.结论 初步推测JEV入侵人神经细胞是通过小窝蛋白1依赖性的内吞作用入胞,而EV71感染人神经细胞则是通过网格蛋白依赖型的内吞途径.
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EV71入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞机制的初步研究
目的:初步研究肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的机制.方法:将临床EV71分离株接种于人横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma,RD)细胞,扩增和纯化病毒;MTT法检测不同病毒胞吞途径阻断剂对SK-N-SH细胞生长抑制作用;用特异性的化学阻断剂预处理靶细胞后,TaqMan real-time PCR验证其对EV71 mRNA表达的影响.结果:RD细胞能够成功扩增出EV71病毒,病毒滴度为1×105 TCID50.随着药物浓度梯度的增加,SK-N-SH细胞的生长增殖受到抑制.TaqMan荧光定量RT-PCR结果显示氯丙嗪(chlorpromazine,CPz)能够抑制EV71 mRNA的表达(P＜0.05),制霉菌素(nystatin,NT)对其影响不大(P＞0.05).结论:初步推测EV71入侵SK-N-SH细胞是通过网格蛋白依赖性的内吞作用入胞.
