干扰素调节因子3 rs2304204野生型及突变型重组质粒的构建及活性分析

目的 构建干扰素调节因子3(IRF-3) rs2304204野生型及突变型重组质粒并比较二者启动子活性.为进一步研究IRF-3对HBV感染的影响打下基础.方法 以人全血DNA为模板,扩增含rs2304204位点的IRF-3启动子区1355bp目的序列,插入pGL3-Basic载体中,构建rs2304204野生型的重组质粒(wIRF-3).以wIRF-3为模板,利用基因定点突变试剂盒构建rs2304204突变型重组质粒(mIRF-3).wIRF-3、mIRF-3和pGL3-Basic质粒分别转染HEK293细胞,采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性,并计算荧光素酶相对活性单位(RLU).结果 成功构建IRF-3rs2304204野生型及突变型重组质粒,且wIRF-3质粒转染组RLU明显高于mIRF-3质粒转染组(P＜0.005).结论 野生型重组质粒的启动子活性明显高于突变型重组质粒,启动子活性的不同可能进而影响机体抗HBV感染的临床结局.

人乳头瘤病毒2(HPV-2)变异株的突变E2蛋白转录抑制作用的研究

皮肤寻常疣的发生与多种基因型别HPV的感染密切相关.本研究利用PCR方法对1例临床罕见的寻常疣患者感染的HPV-2毒株LCR及E2基因序列进行扩增、测序,分别构建含HPV-2变异株及原毒株LCR的重组CAT基因报导质粒pBLCAT-LCR和表达突变及野生型E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-E2,通过瞬时转染HeLa细胞,研究变异株启动子活性及突变E2蛋白的转录抑制作用.结果显示,患者感染的HPV-2变异株LCR及E2基因均存在多处点突变.变异株早期启动子活性明显高于原毒株;突变的E2蛋白转录抑制作用较野生型E2蛋白显著降低;变异株LCR上E2结合位点核苷酸的突变明显降低E2蛋白对病毒早期启动子的抑制作用.提示HPV-2变异株启动子活性增强及突变E2蛋白转录抑制作用的降低与这一罕见巨大寻常疣临床表型之间存在着重要的联系.

建立基于自主复制型载体的端粒酶转录调节细胞系

端粒酶通过催化端粒合成,保持端粒长度,从而保证细胞的持续分裂能力.其活性与生殖细胞和干细胞的增殖,体细胞的衰老和异常增殖、癌变等病理生理过程密切相关[1].逆转录催化亚单位hTERT的转录调节是端粒酶活性调节中的限速步骤[2],然而,目前对hTERT基因表达的具体机制仍不明了.研究基因转录调控的体内方法多通过瞬时转染及检测报告基因表达情况来分析启动子活性.由于众多因素的存在,这种瞬时转染的敏感性较低、重复性差.

FasL对CD28基因启动子活性的抑制作用

目的探讨FasL对CD28基因启动子活性的影响,为研究凋亡信号在免疫衰老中的作用提供资料. 方法采用MTT法和annexinⅤ-FITC染色测定细胞凋亡,Northern blot检测CD28 mRNA的表达水平,构建CD28基因上游非编码区序列的报告基因载体,并瞬时转染Jurkat E6-1细胞后,用Luciferase检测报告基因启动子的活性. 结果 FasL在Jurkat E6-1细胞介导的凋亡可使CD28 mRNA水平降低.CD28启动子的有效序列在上游-400 bp的范围内,并且FasL介导的凋亡信号可明显降低CD28启动子活性. 结论 FasL介导的凋亡信号是CD28基因启动子活性降低的重要原因.

系列截短和缺失的hTERT启动子报告载体的构建及活性验证

目的 构建系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体并验证其活性.方法 PCR扩增系列截短及缺失的hTERT启动子基因,克隆人pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体.分别与pRL-TK内参照质粒共转染HepG2和COS-7细胞,48h后裂解细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性.结果 成功构建系列截短及缺失的hTERT启动子报告载体,分别命名为pGL3B-895、pGL3B-371、pGL3B-DELS2、pGL3B-349、pGL3B-329、pGL3B-318、pGL3B-306.双荧光素酶报告基因检测结果显示在肝癌细胞和工程细胞中上述报告载体均具有启动子活性.结论 成功构建具有启动子活性的系列截短及缺失的hTERT启动子荧光素酶报告载体,为进一步探讨肝癌发生中人端粒酶逆转录酶表达调控机制提供必要的实验材料.

HIV-1感染相关细胞因子IFN-γ通过Rta基因启动子激活人类疱疹病毒8型

目的研究HIV-1感染中相关细胞因子IFN-γ对人类疱疹病毒8型(HHV-8)Rta基因启动子活性影响;评价Rta基因启动子在多种细胞中的启动活性.方法将已构建的HHV-8 Rta启动子+虫荧光素酶报告基因重组质粒和含HIV-1 Tat基因重组表达质粒转染多种细胞,转染后24 h加入IFN-γ和/或重组HIV-1 gp120刺激,刺激后24 h收集细胞,进行虫荧光素酶活性检测.试验同时以佛波酯类化合物TPA刺激为阳性对照,进行佳刺激时间点的选择和不同转染方法转染效率的比较. 结果① HHV-8 Rta启动子启动活性在TPA刺激后的24 h达到高峰;② HHV-8 Rta启动子启动活性的发挥不依赖于HHV-8和/或EBV基因组的存在,且在血管内皮细胞(HUVECs)中启动活性佳;③ IFN-γ可以诱导Rta启动子活性;但HIV-1 Tat和gp120蛋白与IFN-γ协同上调Rta启动子活性的能力较弱. 结论 HIV-1感染中相关细胞因子IFN-γ至少部分通过Rta基因启动子激活HHV-8的复制.

诱导型一氧化氮合酶基因启动子-969G→C多态性的功能

目的:探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子-969G→C多态性的功能意义.方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增已知的iNOS基因启动子-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子DNA序列,再采用基因重组技术将获得的启动子与PGVB-2-E荧光素酶载体质粒连接,构建新的重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,并进行酶切图谱分析和测序分析.然后将重组质粒分别在脂质体的介导下转染HepG2细胞,检测荧光素酶的表达水平,分析不同基因型启动子的活性差异.结果:成功构建iNOS基因-969G→C多态性的GC和GG基因型启动子荧光素酶载体重组质粒pPGV-iNOSmt和pPGV-iNOSwt,发现iNOSmt启动子的活性比对照启动子的活性显著升高,升高132.1%,差异有显著性(P＜0.05),iNOSwt启动子的活性比对照启动子的活性升高14.3%,差异无显著性(P＞0.05).iNOSmt启动子活性升高的百分率是iNOSwt启动子的9倍.结论:iNOS基因启动子-969G→C的多态性改变导致该启动子的活性增强.

丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6上调新生多肽相关复合物α多肽基因的表达

目的:探讨HCV核心蛋白结合蛋白6对新生多肽相关复合物α多肽启动子的激活作用.方法:以基因表达谱芯片技术筛选HCBP6表达质粒转染HepG2细胞后的差异表达基因为基础,利用生物信息学技术确定NACA的启动子区域(NACA-p),聚合酶链反应(PCR)扩增NACA-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-NACA-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-HCBP6共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-NACA-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-NACA-p+pcDNA3.1(-)-HCBP6组CAT的表达活性是pCAT3-NACA-p的4倍.结论:pCAT3-NACA-p具有启动子活性;HCV核心蛋白结合蛋白6对NACA-p有激活作用.本研究为探讨HCV核心蛋白结合蛋白6的功能提供新的实验及理论基础.

丙型肝炎病毒核心蛋白上调层粘蛋白B1链基因启动子表达活性的研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对层粘蛋白B1链(LAMB)启动子转录的激活作用.方法:以我室构建的HCV核心蛋白反式调节基因的cDNA文库抑制性消减杂交(SSH)筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定LAMB的启动子区域(LAMB-p),聚合酶链反应(PCR)扩增LAMB-p,克隆至真核表达载体pCAT3中,构建pCAT3-LAMB-p表达载体;以该质粒转染COS-7、NIH 3T3细胞系,用酶联免疫黏附方法(ELISA)法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;与pcDNA3.1(-)-core共转染NIH 3T3细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性.结果:质粒pCAT3-LAMB-p在NIH 3T3、COS-7细胞中能够激活CAT的表达;共转染实验中pCAT3-LAMB-p+pcDNA3.1(-)-core组CAT的表达活性是pCAT3-LAMB-p的3.3倍.结论:构建的pCAT3-LAMB-p具有启动子活性;HCV核心蛋白对LAMB-p有激活作用.本研究为利用SSH技术研究HCV核心蛋白致肝细胞癌机制提供新的实验及理论基础.

GATA-4 M310V单基因突变参与家族性房间隔缺损的机制研究*

目的:在以往发现家族性先天性房间隔缺损GATA-4 M310V单基因突变的基础上,本研究进一步探讨该突变导致家族性房间隔缺损的可能机制.方法:选取一个先天性房间隔缺损家族(三级亲属成员共31人中有8例单纯性房间隔缺损患者),采集外周血样,采集少量心肌组织标本.体外成功构建GATA-4基因野生型及突变型真核表达载体并转染细胞系,按照不同载体组合(16种组合)转染Hela细胞,应用双荧光素酶报告系统检测GATA-4基因突变对心脏肌球蛋白重链-α(α-Myhc)、心房利钠肽因子(ANF)启动子活性的影响.应用绿色荧光蛋白定位法检测GATA-4 M310V突变对GATA4蛋白核定位的影响.结果:双荧光素酶检测结果:对于α-Myhc启动子,引入GATA-4基因表达载体后,随着GATA-4表达载体浓度的上升,其启动子活性呈现上升趋势,差异有统计学意义(P＜0.005)；引入GATA-4(A928G)突变基因表达载体后,相同GATA-4表达载体转染剂量(100 ng、200 ng)调控的启动子活性增强,差异有统计学意义(P＜0.005)；但随GATA-4突变型表达载体引入量的增加(300 ng),启动子活性似乎有下降趋势,差异无统计学意义(P=0.195).对于ANF启动子,引入GATA-4基因表达载体、GATA-4突变基因表达载体后,启动子活性变化组间差异及趋势变化并不明显(P＞0.05).结论:GATA-4 M310V突变影响了α-Myhc启动子活性及GATA4蛋白的核定位,该突变对GATA4蛋白核定位的影响可能是该突变导致家族性房间隔缺损新的重要分子生物学机制.

PDGF-BB和SDZ RAD对血管平滑肌细胞p27基因启动子活性和p2 7mRNA表达的影响

卵巢颗粒细胞中卵泡刺激素受体基因突变与其启动子活性的关系

卵巢颗粒细胞中卵泡刺激素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因突变是否影响其启动子活性,不同的学者报道尚不统一~([1-2]).报告基因法常用来研究某段DNA序列是否具有转录启动功能及其转录活性,该方法已被众多实验证实是有效的.

人SOX7启动子荧光素酶报告质粒构建及HMGA2对其活性影响的研究

目的 研究发现,HMGA2促进肿瘤细胞发生EMT与其下游基因SOX7有关.为进一步验证转录因子HM-GA2与其下游基因SOX7之间的调控关系,本研究通过构建人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒,采用荧光素酶报告实验观察HMGA2对SOX7基因启动子荧光素酶活性的影响,为研究HMGA2转录表达的调控机制提供必要的实验基础.方法 采用PCR技术扩增人SOX7基因启动子序列(-1 549～+79nt),将SOX7基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中构建质粒pGL3-SOX7-promoter;再分别将pGL3-SOX7-promoter、pGL3-basic-SOX7-promoter和对照质粒(pLV-UbC-IRES2-EGFP)、pGL3-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒(pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP)3组质粒共转染293T细胞,培养48 h后,检测3组荧光素酶的表达情况,观察HMGA2对SOX7基因启动子的调控作用.结果 通过菌落PCR和核酸测序证实,人SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒pGL3-SOX7-promoter构建成功;将pGL3-SOX7-promoter和HMGA2表达质粒(pLV-UbC-HMGA2-IRES2-EGFP)共转染293T细胞48 h后,与对照组相比,SOX7基因启动子介导荧光素酶的活性降低约31％,受到明显抑制(P=0.003),提示HMGA2可能调控SOX7基因启动子的活性.结论 本研究成功构建了SOX7基因启动子荧光素酶报告质粒,初步验证了SOX7是HMGA2下游的作用靶点.

5-Fu对A549细胞NKG2D配体MICA/B启动子活性的作用

目的:克隆A549 细胞NKG2D配体MICA/B的启动子,分析其活性,并研究5-Fu对MICA/B启动子活性的调节作用.方法:PCR方法扩增人MICA/B的启动子及其5个截短体基因,用双荧光报告基因系统进行启动子活性分析,并测定不同浓度5-Fu处理对启动子活性的影响.结果与结论:克隆了人MICA启动子(-455/+4)、MICB启动子(-470/+40)及其5个截短体基因,MICA的相对活性分别为:3.61,2.26,1.63,0.313,0.711,0.663;MICB的相对活性分别为:17.49,10.11,7.398,0.822,0.997,0.49.用20,40,80,160,320 μg/ml的5-Fu处理A549细胞8 h后,MICA启动子活性分别是未处理的1.69,1.48,1.62,1.55,1.78倍, MICB启动子活性分别是未处理的1.44,1.87,1.38,1.19,1.25倍.表明不同浓度5-Fu处理A549细胞后MICA/B启动子相对活性上升.

KSHV RTA上调宿主细胞Bcl-2表达的分子机制研究

目的 研究卡波氏肉瘤病毒(Kaposis's Sarcoma-Associated Herpesvirus,KSHV)编码的复制转录激活因子(replication and transcription activator,RTA)调控宿主细胞Bcl-2表达的分子机制.方法用实时聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot)技术检测RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平;采用PCR定点突变和荧光素酶报告基因技术,检测RTA对Bcl-2基因启动子活性的调节,并鉴定启动子序列中对RTA调控具有重要作用的顺式反应元件.结果 RTA转染的细胞、TPA诱导的KSHV阳性细胞Bcl-2 mRNA和蛋白质表达水平显著增高.RTA通过与Bcl-2基因启动子中CCN9GG反应元件结合激活Bcl-2的转录,这种激活作用呈剂量依赖性,并且P2启动子对RTA反式激活Bcl-2基因不可或缺.结论 KSHV RTA能够上调宿主细胞Bcl-2表达,CCN9GG样RTA反应元件和P2启动子对RTA调控Bcl-2表达具有重要作用.

GAGA元件相关蛋白在人类细胞中对含有果蝇GAGA元件启动子的调控

目的 探讨在人类细胞中GAGA元件相关蛋白(GRP)是否对含有果蝇GAGA元件(dGAGA)的启动子具有调控作用及其机制.方法 共转染果蝇GAGA因子(dGAF)、GRP与含有野生型或突变型dGAGA的ftz启动子氯霉素乙酰转移酶CAT报告基因质粒,利用实时RT-PCR检测启动子活性;电泳迁移率变更分析检测Jurkat细胞核抽提物与dGAGA探针的结合.结果 Jurkat 细胞内,GRP既可单独、也可协同dGAF激活含野生型GAGA元件的ftz启动子活性,使该活性在一定范围内以剂量依赖关系升高,过量时,则引起阻遏作用;而GRP与dGAF均不能激活含突变型GAGA元件的ftz启动子.电泳迁移率变更分析初步显示Jurkat 细胞内有与GAGA元件结合的蛋白存在.结论 Jurkat细胞中有人类GAGA元件结合蛋白存在,它既可与GAGA元件结合直接参与人类基因的调控,又可介导依赖于GRP剂量对相关基因的双向调节.

白细胞介素2受体α基因负调控元件相关结合蛋白的筛选与克隆

白细胞介素2受体(IL-2R)α亚基的胞内末端较短,可能不直接参与IL-2的信号传递,但它在激活淋巴细胞中的特异表达以及与IL-2结合参与淋巴细胞增殖和免疫应答强度的调控.本组曾报道IL-2Rα基因5＇端顺式调控元件NRE不仅与其3＇端下游NRE反向重复序列(NIRS)共同参与对IL-2Rα基因表达的调控,同时反式作用因子可能通过NRE和/或NIRS以及单链或双链DNA的选择性影响该基因的启动子活性[1].为研究IL-2Rα基因NRE的作用机制,本组对其特异的结合蛋白进行了研究.

ABCG2在人多发性骨髓瘤细胞株中的表达及甲基化调控

ABCG2是三磷酸腺苷结合盒(ATP-binding cassette,简称ABC)转运蛋白超家族中G亚家族第2个成员,又被称作乳腺癌耐药蛋白,作为一种跨膜半转运蛋白,介导了对多种化疗药物的外排,引起多药耐药.Bailey-Dell等[1]发现该基因转录起始点上游312 bp区域,具有启动子活性,该区域存在大量的CpG岛,ABCG2表达很可能受启动子甲基化调节.

t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因片段的克隆及启动子活性分析

目的：构建包含不同Alpha基因片段的重组报告质粒和Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，并评价Alpha基因启动子活性。方法：利用软件对Alpha基因进行启动子预测；采用PCR技术扩增出5种不同长度的Alpha基因片段和正常TFEB基因启动子序列pTFEB，构建含Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒；采用脂质体转染法将其分别转染至人胚肾293T细胞；通过荧光素酶活性检测确定Alpha基因的启动子活性。同时构建含Alpha1-TFEB融合基因表达质粒，转染293T细胞后，采用Western blot法检测转染前后TFEB蛋白的表达水平。结果：成功构建含不同Alpha基因片段和pTFEB的重组报告质粒。与pGL3-Basic质粒转染组进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha3、Alpha4、Alpha5质粒转染组的荧光素酶活性显著增高（P<0.01）；与正常TFEB基因启动子进行比较，Alpha1、Alpha2、Alpha5的荧光素酶活性明显增高（P<0.01）；与pGL3-Enhancer质粒转染组进行比较，pGL3-Enhanc-er-Alpha1-TFEB表达质粒组TFEB蛋白的表达明显升高。结论：t（6；11）染色体易位肾细胞癌中Alpha基因具有启动子活性，可促进TFEB表达，Alpha5片段强活性区域位于643~693位碱基序列。

乙型肝炎病毒X蛋白转录激活细胞DNA甲基转移酶基因启动子进而上调其表达

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是常见的恶性肿瘤之一。大量资料显示，慢性HBV感染是其发生、发展的一个重要病原学因素，80％的 HCC与 HBV感染有关，而85％～90％的 HBV 相关性 HCC 存在 HBV 基因组整合［1］。HBV 基因组整合位点并不随机发生，多集中在 HBV DNA反式激活蛋白的基因编码区，即X蛋白编码基因，其编码蛋白能够反式激活同源／异源的病毒／细胞转录调节序列，与乙型肝炎的慢性化和正常肝细胞中癌基因激活和（或）抑癌基因失活密切相关。之前的研究均证实，HBx是一种非常强大的反式激活因子，胞核内的 HBx尽管不能直接与DNA结合，但可与多种转移因子蛋白相互作用，导致特定基因的转录活性升高［2‐3］。有研究报道，DNA甲基转移酶（DNM T ）启动子序列中含有 A P1、S P1、S P3等转录因子结合位点，而有关 HBx广泛激活转录因子AP1、SP1、SP3的研究多有报道［4］，且HBx参与表观遗传路径、诱导抑癌基因甲基化进而下调其表达、参与 HCC发生与发展的研究也日益增多，而抑癌基因甲基化过程由 DNM T 催化并维持。有研究表明， HCC患者血清及肝组织中 DNM T 表达升高［5‐6］，但有关HBx与DNM T转录表达之间是否存在关联及其可能的机制依然不甚明确，需更深入的研究。本研究通过分析启动子活性，从另一方面来研究影响基因调控的因素，设计特异性引物扩增包含DNM T 1、DNM T 3A、DNM T 3B启动子区域的DNA片段，构建相应的启动子报告载体，试图从启动子水平阐述HBx对DNM T的影响。