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GATA-4 M310V单基因突变参与家族性房间隔缺损的机制研究*
目的:在以往发现家族性先天性房间隔缺损GATA-4 M310V单基因突变的基础上,本研究进一步探讨该突变导致家族性房间隔缺损的可能机制.方法:选取一个先天性房间隔缺损家族(三级亲属成员共31人中有8例单纯性房间隔缺损患者),采集外周血样,采集少量心肌组织标本.体外成功构建GATA-4基因野生型及突变型真核表达载体并转染细胞系,按照不同载体组合(16种组合)转染Hela细胞,应用双荧光素酶报告系统检测GATA-4基因突变对心脏肌球蛋白重链-α(α-Myhc)、心房利钠肽因子(ANF)启动子活性的影响.应用绿色荧光蛋白定位法检测GATA-4 M310V突变对GATA4蛋白核定位的影响.结果:双荧光素酶检测结果:对于α-Myhc启动子,引入GATA-4基因表达载体后,随着GATA-4表达载体浓度的上升,其启动子活性呈现上升趋势,差异有统计学意义(P＜0.005)；引入GATA-4(A928G)突变基因表达载体后,相同GATA-4表达载体转染剂量(100 ng、200 ng)调控的启动子活性增强,差异有统计学意义(P＜0.005)；但随GATA-4突变型表达载体引入量的增加(300 ng),启动子活性似乎有下降趋势,差异无统计学意义(P=0.195).对于ANF启动子,引入GATA-4基因表达载体、GATA-4突变基因表达载体后,启动子活性变化组间差异及趋势变化并不明显(P＞0.05).结论:GATA-4 M310V突变影响了α-Myhc启动子活性及GATA4蛋白的核定位,该突变对GATA4蛋白核定位的影响可能是该突变导致家族性房间隔缺损新的重要分子生物学机制.
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孕鼠维生素A缺乏对子代心脏GATA-4基因表达的影响
目的 探讨孕鼠维生素A (VA)缺乏对子代心脏GATA-4基因表达的影响.方法 清洁级断乳健康雌性SD大鼠48只,随机分为正常对照(VAN组)组,VA缺乏组(VAD组)和边缘性VA缺乏(MVAD组)组各16只,分别喂养普通饲料、VA缺乏饲料和边缘性VA缺乏饲料.10w后与成熟SD雄性大鼠交配,分别取孕13.5d、孕18.5d胚胎心脏和新生鼠心脏.透射电镜下观察新生鼠心脏超微结构变化.用RT-PCR和Western blot方法检测孕13.5d、18.5d和新生鼠心脏GATA-4基因mRNA和蛋白表达.结果 与VAN组比较,VAD组和MVAD组的新生鼠心脏电镜下出现心肌纤维模糊,排列紊乱断裂,明暗带不清,线粒体排列不规则等.VAD组在3个时期的GATA-4基因mRNA和蛋白表达均低于VAN组(P＜0.01)；MVAD组在孕13.5d和18.5d的GATA-4基因mRNA和蛋白水平与VAN组之间存在差异(P＜0.05),其新生鼠心脏GATA-4基因蛋白水平亦明显低于VAN组(P＜0.01).结论 孕鼠VA缺乏影响子代心脏GATA-4基因水平,可能导致子代心脏超微结构的变化,进而造成心脏发育异常.
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GATA-4基因在大鼠胚胎心脏中的表达
目的:检测GATA-4基因在大鼠胚胎心脏中的蛋白表达变化.方法:取大鼠胚胎12、15、19天心脏,应用Westernblot、免疫组化的方法进行半定量、定位分析.结果:免疫组化显示,GATA-4基因在房室肌、心内膜、心内膜垫、房室瓣及大动脉根部均有表达.Western blot显示.在胚胎12天心脏中,GATA-4基因已有较高表达;在胚胎15天表达明显上调,胚胎19天时表达又有所下降.结论:GATA-4随大鼠胚胎心脏的生长发育呈动态表达,GATA-4与心脏发育密切相关.
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低压脉动电刺激对体外心肌诱导分化过程中GATA-4和NKx2.5基因表达的影响
目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,低压脉动电刺激对心肌转录因子GATA-4和NEx2.5基因表达的影响,探讨电刺激对骨髓间充质干细胞向心肌分化过程的影响及其分子生物学机理.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代MSCs,对照组以10μmol/L 5-氮胞苷(5-aza)诱导,电场组诱导后施加1.5V/cm电场刺激.分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和western blot技术检测troponin I(TnI)表达,RT-PCK法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达.结果 诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,TnI蛋白在诱导后第2周开始表达,第3、4周明显增强.GATA-4和Nkx2.5基因第1周开始表达,第2周增强,第3周达到高峰,持续到第4周.电场刺激组细胞排列更加紧密,诱导后各时间点GATA-4和Nkx2.5基因表达比对照组明显增强.结论 脉动电场刺激促进MSCs向心肌细胞的分化过程,GATA-4和Nkx2.5基因可能调节该促进过程.
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房室间隔畸形患者GATA-4基因一个新的突变功能初步研究
目的 探讨先天性房室间隔畸形患者GATA-4基因的突变以及对所发现的突变点进行功能初步分析.方法 选择的50例汉族先天性房室间隔畸形患者,用聚合酶链反应方法扩增GATA-4基因6个外显子编码区和邻近序列后分别直接测序,并与100名同民族健康者比较;利用生物信息学方法预测点突变对GATA-4蛋白结构和功能影响;以野生型pcDNA3.1-GATA4为模板,用基因定点突变的方法构建突变型GATA-4真核表达载体,在体外和ANF报告质粒共转染Hela细胞,48 h后检测下游报告基因的活性.结果 发现GATA-4基因一个新的杂合子H436Y突变,在NCBI的SNP数据库中未见报道,且在100名对照者中也未发现;GATA-4基因编码第436位组氨酸在生物进化过程中处于高度保守;SIFT和PolyPhen程序预测H436Y突变可能影响GATA-4蛋白质的功能;突变型GATA-4 H436Y质粒激活下游报告基因活性明显下降,与野生型GATA-4质粒相比是(53.8±6.6)%,差异具有统计学意义(P<0.01).结论 GATA-4基因H436Y杂合子突变可能是中国汉族先天性房室间隔畸形致病原因之一.
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骨髓间充质干细胞向心肌诱导过程中GATA-4和Nkx2.5基因的表达
目的 观察骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌诱导分化过程中,心肌转录因子GATA.4和Nkx2.5基因表达的变化规律,探讨其分子生物学机理.方法 体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代以10 pmol/L 5-氮杂胞苷(5-aza)诱导.分别于第1、2、3、4周收集细胞,免疫细胞化学法和Western blot法检测肌钙蛋白I(troponinI,TnI)表达·RT-PCR法分析GATA-4和Nkx2.5基因的表达.结果 诱导后细胞停止生长,并倾向集落化,诱导第2周开始出现TnI阳性细胞,第1周开始即有GATA-4和Nkx2.5基因表达,逐渐增强,第3周达到高峰,持续到第4周.结论 GATA·4和Nkx2.5基因表达在骨髓同充质干细胞向心肌样细胞诱导过程中逐渐增强,可能参与调控心肌细胞的分化过程.
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GATA-4基因与先天性心脏病的关系
先天性心脏病(CHD)是胎儿时期心脏血管发育异常所致的畸形疾病,其发病率约为活产婴儿的8%[1],是婴幼儿非感染性疾病中主要的死亡原因.作为一种多基因遗传病,先心病主要是由于胚胎期遗传因素和环境因素共同作用导致心脏血管异常发育所引起的,但其致病基因尚未确定.
