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DNA甲基化及其芯片技术研究进展
DNA甲基化是早发现的、基本的表观遗传学机制.大量研究表明DNA甲基化与人类疾病有密切关系.DNA甲基化改变包括全基因组水平DNA低甲基化和CpG岛局部高甲基化.DNA甲基化分析方法发展迅速,尤其是近年来,DNA甲基化芯片技术已成为高通量分析DNA甲基化的快速、有效的方法.DNA甲基化芯片主要包括CpG岛微阵列和甲基化寡核苷探针微阵列.本文围绕DNA甲基化相关概念、发生机制、与疾病的关系及主要研究方法等方面进行综述.
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细胞荧光素酶报告基因试验受CpG岛甲基化状态影响
目的 研究细胞内源性上皮型钙黏素基因(E-cadherin,CDH1)启动子CpG岛甲基化状态是否影响报告基因试验的结果 .方法 甲基化特异性PCR法测定8种人肿瘤细胞系CDH1启动子CpG岛甲基化状态,免疫印迹法测定其蛋白表达;根据该基因启动子-73位A/C多态和单倍体型构建2组长短不同的CDH1启动子-荧光素酶报告基因[pGI3-A(-73)/-C(-73)和pGL3-H1/-H4],活性差异采用t检验进行统计分析.结果 (1)CDH1在MCF7、MKN74、PC-3和AGS细胞中COG岛末甲基化,除AGS外均存在CDH1表达;在HeLa、BGC823、A549和RKO细胞中CpG岛甲基化并且无表达;(2)在CDH1未甲基化细胞系MCF7、MKN74、PC-3和AGS中pGL3-C<,(-73)报告基因活性(分别为:0.78±0.10、0.17±0.01、0.11±0.01、1.19±0.18)均显著高于pGL3-A(-73)报告基因活性(分别为:0.30±0.08、0.07±0.01、0.07±0.01、0.39±0.04)(t值分别为:-6.298、-12.349、-8.128、-7.388,P值均<0.01),而在CDH1甲基化细胞中则相反[HeLa、BGC823、A549和RKO细胞中pGL3-C(-73)报告基因活性分别为:0.09±0.02、0.13±0.02、0.05±0.01、0.01±0.00,pGI3-A(-73)活性分别为:0.16±0.01、0.25±0.01、0.11±0.03、0.03±0.00,pGL3-C(-73)活性低于pGL3-A(-73),t值分别为:5.958、11.189、3.661、13.866,P值均<0.05];(3)在MKN74和RKO细胞中,pGL3-H1/-H4的启动子活性分别为1.57±0.23/0.94±0.06和0.38±0.02/0.50±0.04,差异亦存在统计学意义(t值为4.577和-4.915,P值为0.010和0.003),并且在两种细胞巾活性相反.结论 细胞内源性目的 基因CpG岛甲基化状态对报告基凶试验结果 可能有重要影响,高活性基因型的启动子也是容易受抑制的启动子.
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乳腺癌组织中APC和Bikunin基因异常甲基化
目的 探讨 APC 和 Bikunin 基因甲基化状态与乳腺癌临床病理特征之间的相关性.方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应法检测 152 例乳腺癌组织中 APC 和 Bikunin 基因的甲基化状态.结果 乳腺癌组织中 APC 基因启动子区 CpG 岛甲基化频率为 40.8%,其甲基化状态与肿瘤大小有相关(X2=4.041;P=0.044),但是与患者年龄、生存期、肿瘤的病理类型、组织学分级、临床分期、淋巴结转移以及雌激素或孕激素受体等状态无相关性;Bikunin 基因启动子区 CpG 岛甲基化频率为 24.6%,与肿瘤的临床病理学特征无相关性.结论 APC 和 Bikunin 基因启动子区 CpG 岛异常甲基化是乳腺癌组织中的频发事件,与乳腺癌的预后无相关性.
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人组织样品中SNCG基因CpG岛甲基化拷贝数定量分析
目的 建立准确测定肿瘤组织中SNCG基因CpG岛甲基化拷贝的含量的方法.方法 利用亚硫酸氢钠修饰-克隆测序法确定胃组织该CpG岛中关键性CpG位点,然后利用限制性内切酶建立了测定该位点甲基化状态的分析法(COBRA),再利用变性高效液相色谱技术进行定量.结果 对2个肿瘤细胞系、2个正常人胃黏膜样品、2对原发性胃癌及其癌旁非癌组织进行分析发现,在该CpG岛的16个CpG位点中,-88位等5个CpG位点的甲基化状态与整个CpG岛的甲基化状态一致;利用限制性内切酶Acil能够区分该位点甲基化状态:在该位点未甲基化时(GTGG)不能酶切,而甲基化时(GCGG)酶切敏感;在变性高效液相色谱仪上甲基化片段和非甲基化片段能够完全分离;根据色谱峰面积可知两者的比例,在1.25%～100%范围内有良好的线性关系,重现性较好;对克隆测序样品进行限制性内切酶-变性高效液相色谱测定,结果与克隆测序一致.结论 建立的限制性内切酶-变性高效液相色谱法能够定量测定SNCG基因CpG岛甲基化.
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CpG岛靶向siRNA诱导P16沉默的甲基化分析
目的 探讨RNA介导DNA甲基化(RdDM)是否参与哺乳动物细胞中P16基因的甲基化沉默.方法 将靶向P16基因CpG岛不同位点(启动子区和外显子区)的小干扰RNA(siRNA),分别转染人胃癌细胞系BGC823,用RT-PCR、免疫印迹检测P16基因的表达,用甲基化特异性PCR(MSP)和克隆测序等分析DNA甲基化.结果 靶向P16基因启动子与外显子区域的siRNA均能诱导P16基因表达的降低,但两者都不能诱导同源序列DNA甲基化.结论 在BGC823细胞系上,siRNA不能通过甲基化诱导方式调控P16基因的表达.
关键词： CpG岛 RNA介导DNA甲基化 siRNA p16 -
5-氮杂-2'-脱氧胞苷诱导肝癌细胞HepG2 RUNX3基因表达及增强药物敏感性
UNX3(PEBP2aC/CBFK3/AML2)为新近克隆的一种候选抑癌基因,该基因在人类多种肿瘤中存在甲基化异常,而抑癌基因启动子及其CpG岛胞嘧啶高甲基化可导致基因表达失活.
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ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性
近年来研究发现ABO血型与许多疾病的发生发展相关,某些肿瘤导致A、B血型物质减少的现象已日益引起关注.本研究探讨ABO基因启动子CpG岛甲基化与白血病的相关性.采用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测了不同血型的健康人群和各种血液病患者外周血红细胞表面ABH抗原的相对含量,用PCR和MSP-PCR分别检测血液病患者和健康人ABO基因启动子DNA序列和CpG岛甲基化,以及ABO基因启动子-102位点的甲基化.结果发现,白血病患者均出现不同程度的A、B抗原减少;通过对比检测健康人和患者的AB0基因启动子序列,未发现有序列的不同,说明启动子序列高度保守;利用重亚硫酸盐对DNA样本进行修饰后,通过对健康人和患者的ABO基因启动子序列进行扩增和测序,发现健康人和再生障碍性贫血患者在ABO基因启动子的CpG岛区没有甲基化的位点,而急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞白血病(CML)和部分骨髓增生异常综合征(MDS)患者在位置为-102、-101、-100、-99和-97位置的C碱基均有甲基化的现象.结论:甲基化是造成白血病患者AB抗原下降的原因;-102、-101、-100、-99和-97这几个甲基化位点有可能是白血病的特异性表现;针对-102位点检测结果提示-102位点是否甲基化有可能作为白血病鉴别诊断中一个有意义的分子标识物.
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恶性血液病细胞株中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的初探
本研究探讨基因IEX-1启动子区CpG岛甲基化状态的改变及其与恶性血液病发生的相关性.应用MSP的方法检测9种恶性血液病细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态,并把经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阳性对照,把正常人外周血单个核细胞中IEX-1 CpG岛甲基化状态作为阴性对照.结果显示:在NB4、Molt4.、Raji细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈高甲基化状态;在CA46、CEM、U937、K562、HL-60、Jurkat细胞系中IEX-1基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态;在正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子区CpG岛呈非甲基化状态;经M.sssI酶处理过的正常人外周血单个核细胞中IEX-1基因启动子CpG岛呈高甲基化状态.结论:IEX-1基因启动子区CpG岛甲基化状态的改变与恶性血液病有一定的相关性.
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恶性血液病细胞系分泌型卷曲相关蛋白基因启动子CpG岛甲基化状态的检测及意义
为了研究分泌型卷曲相关蛋白(secreted frizzled-related protein,SFRP)家族基因启动子CpG岛的甲基化状态,探讨SFRP基因启动子区CpG岛的异常甲基化状态与恶性血液病发病机制的可能联系,采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)的方法检测了9种恶性血液病细胞系及正常人外周血单个核细胞中sFRP基因启动子区的甲基化状态.结果显示:9种恶性血液病细胞系中SFRP1、2基因启动子区均呈高甲基化状态,CA46、HL60和U937细胞中的SFRP4基因以及U266细胞中的SFRP5基因启动子区呈部分甲基化状态,其他细胞系SFRP4、5基因启动子均呈完全甲基化状态.正常人外周血单个核细胞中SFRP1、2,4、5基因启动子区均呈非甲基化状态.结论:SFRP基因启动予区异常甲基化模式与恶性血液病的发生密切相关.SFRP基因启动子区的甲基化状态有可能成为恶性血液病新的分子诊断标记物.
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脐血CD34+细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究
本研究旨在通过检测脐血CD34+细胞和正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性.采用半定量RT-PCR检测脐血CD34+细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点.结果发现,CD34+细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNC不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129 bp的C碱基发生甲基化.结论:HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一.HOXB4在CD34+细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关.初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径.
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NRF2启动子甲基化与男性不育
目的：探讨抗氧化基因NRF2启动子上游CpG岛内408~994 bp位置处的甲基化水平与男性不育之间的关系。方法酚氯仿法手提精子DNA，建立重亚硫酸盐修饰精子DNA后克隆测序法（即 BSP-克隆测序法），选择正常男性及不育中少、弱、畸精症男性患者每份精液样本 DNA的抗氧化基因NRF2的三个片段，每个片段选择15～20个正确的克隆结果并比较其甲基化水平。结果不育男性少、弱精组和正常精液组其抗氧化基因NRF2启动子上游408～994 bp处99%甲基化位点均为非甲基化状态，正常男性精子 DNA 第7个甲基化位点缺失率（18.14%）明显比少弱精组（24.9%）缺失率低（P＜0.05）。结论虽然正常生育男性及不育男性少、弱精患者抗氧化基因NRF2启动子上游408～994 bp区均呈现非甲基化状态但其第7个甲基化位点缺失可能与精子成熟障碍有关。
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抑癌基因甲基化位点定量检测在宫颈癌早期诊断中的意义探讨
目的 利用Sequenom定量检测宫颈癌抑癌基因(SOX-1、NKX6.1、PAX-1、LMX1A、ONECUT1、WT1)甲基化的程度和甲基化的位点.方法 利用石蜡切片提取组织DNA,对提取的DNA进行甲基化位点的保护并设计针对抑癌基因转录起始点前的富含CPG岛区域的引物进行PCR扩增,将扩增出的DNA转录成RNA后使用Sequenom质谱分析仪进行基因甲基化程度的定量检测和甲基化位点的检测.结果 正常对照组和宫颈上皮内瘤样病变(CIN)Ⅰ级组各个基因的甲基化程度较低(<20%),无统计学意义(P>0.05),CINⅢ级组各个基因的甲基化程度较高(>45%),与正常对照组相比有统计学差异(P<0.05).结论 通过定量研究宫颈癌抑癌基因甲基化的程度可以为宫颈癌的早期预防和治疗方式提供靶标和理论指导.
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半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用
目的改进甲基化特异性聚合酶链反应(MSP),采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态.方法用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后,采用半巢式MSP(引物分别为MS,M1A和MS,M2A),分析了60例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态.结果单独用MSP,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为80%.采用半巢式MSP,甲基化发生率为86.7%,比单独采用MSP提高了几个百分点,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式.结论半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性.同时,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关.
关键词： 半巢式甲基化特异性聚合酶链反应 p16基因 CpG岛 甲基化 -
胃癌TIMP3基因启动子甲基化及其蛋白表达的研究
目的:探讨组织金属蛋白酶抑制因子-3(tissueinhibitor of metalloproteinase 3,TIMP3)基因启动子甲基化与其蛋白表达的相关性,并分析TIMP3基因CpG岛异常甲基化与胃腺癌及其临床病理特征的关联性,方法:应用甲基化特异性PCR(MSP)技术和免疫组织化学方法分别检测78例患者的胃正常黏膜组织、胃癌组织及转移淋巴结中,TIMP3基因启动子甲基化和蛋白表达情况.结果:胃正常黏膜组织、早期、进展期胃癌组织和转移淋巴结中TIMP3基因启动子均有甲基化修饰,其阳性率分别为35.9%(28/78);85.0%(17/20),89.7%(52/58);转移淋巴结100%(78/78).胃癌组TIMP3基因启动子甲基化率明显高于胃正常黏膜组(P＜0.05).胃正常黏膜组织TIMP3蛋白表达全部为阳性(100%),20例早期胃癌中,6例阳性(30%),58例进展期胃癌中,2例阳性(3.4%),在转移淋巴结中全部不表达(0%).胃癌70例蛋白表达阴性的标本中,64例TIMP3基因启动子甲基化阳性(91.4%),TIMP3蛋白表达与启动子甲基化呈明显负相关(P＜0.01).结论:启动子区CpG岛高甲基化是胃癌组织中TIMP3基因表达失活的主要机制,可能成为胃癌分子诊断与病期评估的标志之一.
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大肠腺癌THBS1 CpG岛甲基化及其蛋白表达的研究
目的:探讨凝血栓蛋白1(THBS1)基因启动子CpG岛异常甲基化,蛋白表达与大肠腺癌及其临床病理特征的关联,并分析THBS1基因蛋白表达与其甲基化的相关性.方法:应用免疫组化和甲基化特异性PCR技术分别检测大肠腺癌94例及其残端正常黏膜组织中,THBS1基因启动子CpG岛甲基化和蛋白表达情况.结果:大肠腺癌和癌旁组织中,THBS1蛋白表达率(61.7%vs 77.7%),CpG岛甲基化率(25.5% vs 11.7%)的差异均有显著性(前者χ2=5.67,P=0.017,后者χ2=5.93,P=0.015),老年患者肿瘤组织中THBS1蛋白表达率明显低于非老年患者(48.8% vs 72.5%,χ2=5.55,P=0.018),甲基化率明显高于非老年患者(37.2% vs15.7%,χ2=5.68,P=0.017),直径≥3 cm的肿瘤组织中THBS1蛋白表达率显著低于直径＜3 cm的肿瘤(53.4% vs 75.0%,χ2=4.37,P=0.037),甲基化率显著高于直径＜3 cm的肿瘤(32.6%vs 13.9%,χ2=4.16,P=0.041),C期和D期肿瘤组织中THBS1蛋白表达率显著低于A期或B期肿瘤(44.4%vs 73.3%,72.1%,χ2=7.36,v=2,P=0.025)、甲基化率显著高于A期或B期肿瘤(41.7%vs 13.3%,16.3%,χ2=8.04,v=2,P=0.018),大肠腺癌THBS1蛋白阴性与阳性表达的组织之间,启动子CpG岛甲基化率的差异有显著性(0%vs 66.7%,P＜0.0 005).结论:THBS1基因异常甲基化是其蛋白表达缺失的主要原因之一,并在大肠癌的发生发展中起重要作用.
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胰腺癌细胞系BxPC3及胰腺癌组织Ras相关区域家族1A启动子CpG岛的甲基化状态
目的 检测Ras相关区域家族1A(Ras association domain family 1A,RASSF1A)在胰腺癌细胞株BxPC3及胰腺癌组织中的甲基化状态,探讨其启动子异常甲基化在胰腺癌发病机制中的可能作用.方法 采用结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测胰腺癌细胞株BxPC3、5例正常胰腺组织、13对胰腺癌及相应癌旁正常胰腺组织中RASSF1A启动子CpG岛的甲基化状态,计算其甲基化率.以甲基化酶抑制剂5-Aza-dC(5-Aza-2-deoxycitydine)处理BxPC3,观察处理前后甲基化率变化情况及RASSF1A mRNA表达变化.结果 在BxPC3细胞株中,RASSF1A启动子的CpG岛甲基化率为62.90%;正常胰腺、癌旁及癌组织中平均分别为9.14%、53.79%和55.82%.与正常胰腺组织相比,胰腺癌旁及癌组织的RASSF1A启动子甲基化率明显增高(P值<0.01),而癌旁及癌组织之间无明显差异(P>0.05).BxPC3经5-Aza-dC处理后,RASSF1A的CpG岛甲基化率显著下降至42.50%(P<0.05),同时RASSF1A mRNA表达增强.结论 RASSF1A启动子CpG岛异常甲基化是胰腺癌发生发展中的早期事件,可能参与胰腺癌的发病过程.
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胰腺癌组织SPARC基因CpG岛甲基化状态及临床意义
目的 检测胰腺癌SPARC基因CpG岛的甲基化状态及其与临床病理参数的关系.方法 收集17例胰腺癌及相应癌旁组织、6例CP和6例正常胰腺组织以及6例健康成人外周血液标本,抽提DNA,进行亚硫酸氢盐修饰,然后行甲基化特异性PCR,检测SPARC基因第一外显子区CpG岛的甲基化状态,并分析与肿瘤病理参数的关系.结果 健康人外周血白细胞DNA中SPARC基因第一外显子区CpG位点均无甲基化.正常胰腺、CP、胰腺癌及相应癌旁组织SPARC基因第2、3、4、5、6、7 CpG位点的甲基化率分别为61.6%、47.1%、37.5%、24.7%;第1,8、9、10、11、12 CpG位点的甲基化率分别为52.0%、28.7%、16.7%和0.胰腺癌SPARC基因甲基化率与正常胰腺、CP比较均差别非常显著(P＜0.001),与相应癌旁组织比较差别不显著.胰腺癌SPARC基因CpG岛甲基化与患者性别、年龄、危险诱因(如长期吸烟或饮酒、CP)、肿瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴结转移等均无显著差异.结论 胰腺癌SPARC基因第一外显子区CpG岛为高甲基化状态,可能为胰腺癌发生、发展的早期事件.
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Ras相关基因在非小细胞肺癌中的异常甲基化研究
基因启动子中CpG岛的异常甲基化常导致抑癌基因表达沉默,已被证实在众多肿瘤的发牛中扮演重要角色.Ras 相关区域家族1A基因(RASSFlA)作为新型抑癌基因,已被发现在肺癌和多种恶性肿瘤中具有较高的甲基化率和表达缺失.
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DNA甲基化与肝细胞癌
DNA甲基化是目前肿瘤发病机制研究中的热点,肝细胞癌中肿瘤相关基因特别是抑癌基因的异常甲基化,构成其独特的甲基化谱,成为肝细胞癌的表遗传标志,在肝细胞癌的诊断、疗效观察、预后判断及治疗等方面,发挥着重要的作用.
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胰腺癌中基因的CpG岛甲基化异常(文献综述)
基因CpG岛甲基化异常包括甲基化过度和甲基化不足,以甲基化过度为主.在恶性肿瘤中甲基化过度主要发生在抑癌基因,从而使抑癌基因不能表达,细胞发生转化并向恶变发展.另一方面,一些原癌基因甲基化不足或去甲基化,癌蛋白大量表达,进一步使抑癌基因甲基化过度导致的恶变加剧.
