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尼克酰胺、β-细胞调节素、bFGF、HGF联合诱导人脐血CD34+细胞向胰岛素分泌细胞的分化
目的 探讨在体外培养条件下用尼克酰胺、β-细胞调节素(betacellulin)、bFGF、HGF诱导人脐血CD34+细胞向胰岛细胞的分化.方法 用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含5%FBS,1×ITS,4.7mg/L亚油酸,10-4mol/L 2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,扩增后于培养第5d加入尼克酰胺、betacellulin、bFGF、HGF进行诱导,并于诱导14d、24d留取细胞.应用RT-PCR、免疫细胞化学染色方法检测分化细胞中胰岛细胞标志物,并用ELISA方法检测培养液中胰岛素水平.结果 流式细胞仪检测结果显示,CD34+细胞的平均分离纯度＞90%,达到分离要求.RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达nestin、ngn3、IPF-1 mRNA.免疫细胞化学染色可见诱导的CD34+细胞中出现nestin和insulin阳性表达细胞.胰岛素分泌细胞的分化率平均为(9.8±2.7)%.ELISA检测发现诱导组和未诱导组培养液中的insulin含量有显著性差异(P＜0.01).结论 体外联合应用上述因子能诱发脐血CD34+造血干细胞向胰岛素分泌细胞的分化.
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细胞因子体外诱导脐血CD34+细胞增殖并向巨核细胞/血小板分化的研究
本研究旨在观察几种不同细胞因子组合通过体外培养以诱导造血干/祖细胞增殖和向巨核细胞/血小板分化.应用无血清培养基(StemSpan SFEM)体外扩增脐血CD34+细胞并向巨核细胞/血小板定向分化,将不同细胞因子组合分为3个阶段培养,并比较其培养效果.结果表明,在第一阶段的第14天时,SCF + TPO + FL + IL-3组细胞扩增倍数高为11000 ± 1 000,显著高于SCF + TPO + FL组,但与SCF + TPO + IL-3组及SCF + TPO + FL+ IL-3 +羟皮质激素组相比较无显著差异;在第二培养阶段的第7天时,SCF + TPO + FL + IL-11组巨核细胞系扩增倍数为204666.7 ± 11718.9,显著高于SCF+TPO+FL+IL-3组,与SCF + TPO + FL + EL-11 + BMP4 + VEGF组比较并无显著差异.在第三阶段中,SCF + TPO + FL + IL-11和SCF + TPO + FL + IL-11 + BMP4 + VEGF 2组的CD41+血小板样细胞所占比例显著高于SCF + TPO + FL + IL-3组.结论:SCF + TPO + FL + IL-3因子组合可显著提高造血干/祖细胞的扩增倍数,SCF + TPO + FL + IL-11组合有利于巨核细胞的扩增成熟及分化,为下一步的体外培养巨核细胞/血小板体系的建立奠定了一定的基础.
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脐血CD34+细胞和外周血单个核细胞中HOXB4基因表达及其启动子区CpG岛甲基化状态的研究
本研究旨在通过检测脐血CD34+细胞和正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中HOXB4基因表达水平及其启动子区CpG岛的甲基化水平,初步探讨造血系统中HOXB4基因的表达水平与其启动子区甲基化的相关性.采用半定量RT-PCR检测脐血CD34+细胞和PBMNC中HOXB4基因的表达,应用亚硫酸氢盐测序法检测这两种细胞中HOXB4基因启动子区CpG岛的甲基化位点.结果发现,CD34+细胞高表达HOXB4,HOXB4基因启动子区CpG岛未发生甲基化;PBMNC不表达HOXB4,HOXB4基因启动子区在ATG上游-129 bp的C碱基发生甲基化.结论:HOXB4基因启动子甲基化程度是其基因表达水平的负性调节机制之一.HOXB4在CD34+细胞中的高表达与其基因启动子低甲基化有关,而HOXB4在PBMNC中的基因沉默则可能与其启动子区的甲基化密切相关.初步筛选出的HOXB4基因启动子区CpG岛甲基化位点,为后续研究奠定了基础,也为扩增造血祖细胞提供一条新途径.
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人骨髓间充质干细胞体外支持脐血CD34+细胞增殖的研究
为了研究人骨髓间充质干细胞(MSC)作为滋养层细胞体外支持脐血CD34+细胞扩增的作用,将MSC和胎儿骨髓来源的成纤维细胞样骨髓基质细胞系(HFCL)经60Coγ线照射后分别制备细胞滋养层,比较不同滋养层细胞和添加或不加细胞因子对脐血CD34+细胞增殖数及LTC-IC数的影响.结果表明,无论有无添加细胞因子(rhFL、rhSCF、rhTPO),HFCL滋养层组培养12天扩增细胞数明显高于MSC滋养层组,以第0天细胞数为100%(下同),有细胞因子组为(9797±361)%vs(7061±418)%,无细胞因子组为(5305±354)%vs(1992±247)%,均P＜0.01.MSC滋养层组CD34+细胞扩增数与HFCL滋养层组相比无显著差异[(825±305)%vs(820±191)%,P＞0.05],但在细胞因子存在时低于HFCL滋养层组[(939±212)%vs(1617±222)%,P＜0.01].MSC滋养层组维持脐血中LTC-IC的能力明显优于HFCL滋养层组[第5周CFU-GM数(129.95±8.73)个/105接种细胞数vs(89.81±10.29)个/105接种细胞数,P＜0.05];细胞因子存在时,其作用更为明显[第5周CFU-GM数(192.93±4.95)个/105接种细胞数vs(90.47±14.28)个/105接种细胞数,P＜0.01].MSC与HFCL按一定比例混合,可提高扩增效率.当MSC与HFCL之比为4:1时,集落形成数量高,达(186.89±11.11)个/105接种细胞数,明显高于比例为3:2(131.45±13.02)个/105接种细胞数和二者单用组[前者(138.92±14.84)个/105接种细胞数,后者(64.63±6.11)个/105接种细胞数;均P＜0.01].结论:MSC维持脐血中LTC-IC集落形成的能力优于基质细胞系HFCL,HFCL支持脐血CD34+细胞的增殖能力优于MSC,MSC加上适量HFCL可显著提高CD34+细胞扩增效率.
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脐血CD34+细胞体外扩增时HOXB4基因表达的变化
同源盒基因家族成员HOXB4反映原始造血干/祖细胞(PHSC/PHPC)的自我更新和增殖能力.本研究采用实时定量RT-PCR的方法在mRNA水平上检测HOXB4基因的表达,以观察体外扩增脐血CD34+细胞自我更新的水平.结果显示:随着体外培养时间的延长,虽然CD34+细胞数增加,但HOXB4表达下降;周后,HOXB4几乎检测不到,与成熟外周血淋巴细胞表达HOXB4的水平相同;CD34+细胞与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)共培养可以减缓CD34+细胞HOXB4表达的下降.结论:脐血CD34+细胞体外扩增过程中自我更新能力逐渐下降.CD34+与BM-MSC共培养有助于减缓体外扩增的CD34+细胞自我更新能力的丧失.
关键词： HOXB4 脐血CD34+细胞 体外扩增 骨髓间充质干细胞 实时定量RT-PCR -
人胎盘绒毛组织悬液支持脐血CD34+细胞体外扩增的作用
本研究旨在探讨不同时期的胎盘组织悬液对脐血造血干细胞体外扩增的作用,进一步了解随着胎龄的增长胎盘造血功能发生的变化.应用早期(B组)、中期(C组)和足月(D组)胎盘绒毛组织悬液,并设定空白对照(A组),以共培养的方式分4组进行体外扩增脐血造血干细胞并培养观察扩增后的集落形成能力.结果表明,以接种初浓度为对比,共培养7d后A组细胞呈逐渐衰减趋势,B组扩增效果不明显,仅为扩增前的1.40±0.20倍,C组和D组造血干细胞均能有效扩增,扩增倍数分别为2.93±0.50和4.80±0.40.集落培养14 d后的结果显示,C、D组集落形成总数明显高于A、B组,C组CFU-GM、CFU -GEMM、BFU-E集落数均略高于D组.结论:在没有外源性细胞因子存在的情况下,不同时期的胎盘绒毛组织悬液均可以支持造血干细胞的体外扩增,且随着胎盘发育其支持造血的功能呈不断增强的趋势.扩增后的造血干细胞的集落形成能力却呈先增强后减弱的现象,中期胎盘培养扩增后的干细胞集落形成能力强,略强于足月期胎盘扩增后的造血干细胞.
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Puma表达下调对人脐血CD34+造血细胞抗放射作用的初步研究
Puma属于BCL-2家族中BH3-only亚家族,动物和细胞研究发现其通过p53依赖和非依赖途径诱导细胞凋亡,并具有抗放射保护不增加肿瘤发生率的作用.本研究检测Puma基因敲降后对人脐血CD34+造血干祖细胞生物学功能的影响.应用RT-PCR、Western Blot检测Puma基因在辐射刺激条件下的表达,采用慢病毒感染人脐血CD34+细胞分选GFP+细胞,Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞术检测细胞凋亡,Ki67染色检测细胞周期,CCK-8、Brdu标记法检测细胞增殖能力,并进行集落形成实验(colony formig cell assay,CFC).结果表明:Puma基因表达量随着射线强度的增加而增高,Puma基因表达下调抑制造血祖细胞体外集落形成能力和体外增殖能力.在辐射刺激条件下,抑制Puma基因表达可以减少人脐血CD34+细胞凋亡,维持细胞周期于G0期.结论:人脐血CD34+造血干细胞中Puma基因敲降具有一定的抗辐射作用,维持细胞于静息状态.
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不同时相移植人骨髓间充质干细胞对人脐血CD34+细胞植入NOD/SCID小鼠的影响
为了观察不同时相移植人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血(UCB)CD34+细胞移植的NOD/SCID小鼠造血重建的影响,明确佳的移植时机,将体外培养扩增的人骨髓MSC分别于UCB CD34+细胞移植同时、移植前48小时及移植后48小时输入经60 Co γ射线照射的NOD/SCID小鼠,观察共移植后42天内小鼠外周血白细胞和血小板变化,并于移植后42天处死小鼠,用FACS检测外周血、骨髓和脾脏人源细胞含量.结果表明:(1)MSC和UCBCD34+细胞同时输注可明显降低外周血白细胞和血小板下降幅度,缩短白细胞和血小板恢复时间;二者不同时输注均不降低白细胞和血小板下降幅度,且输注UCB CD34+细胞后48小时输注MSC时外周血血小板恢复时间明显晚于同时输注者.(2)与单纯UCB CD34+细胞移植相比较,不同时相输注MSC均可促进UCB CD34+细胞的植入,三个共输注组间促进骨髓各系造血植入效应无明显差异.结论:人骨髓MSC与UCB CD34+细胞共移植时,以同时移植效果佳,此结果为MSC的临床应用提供了实验依据.
关键词： 间充质干细胞 脐血CD34+细胞 共移植 NOD/SCID小鼠 -
高迁移率族蛋白B1对人脐血CD34+细胞迁移的影响
本研究探讨高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)对人脐血CD34+细胞迁移的影响及其机制.用流式细胞仪检测脐血CD34+细胞表面HMGB1受体:晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced gly-cation end products,RAGE)、Toll样受体2(Toll-like receptors 2,TLR2)及TLR4的表达.用磁珠分选法富集的新鲜人脐血CD34+细胞,经不同浓度的HMGB1(10、50、100、1000 ng/ml)刺激后,应用transwell小室趋化装置观察HMGB1对人脐血CD34+细胞的迁移活性,显微镜下计数,计算趋化指数,即试验孔与对照孔细胞数的比值.以未加HMGB1的培养细胞为时照组.结果表明:人脐血CD34+细胞经免疫磁珠分选富集的纯度达98%以上.HMGB1在一定的浓度范围内随浓度递增对人脐血CD34+细胞的迁移作用逐渐增强,当HMGB1浓度为100 ng/ml时迁移活性强,与对照组比较差异显著(P<0.01).抗-RAGE抗体可部分抑制HMGB1对脐血CD34+细胞的迁移作用.结论:一定浓度的HMGB1加强人脐血CD34+细胞迁移功能,此作用有可能通过RAGE介导.
关键词： 高迁移率族蛋白B1 脐血CD34+细胞 晚期糖基化终产物受体 -
人骨髓间充质干细胞与脐血CD34+细胞体外扩增
为了研究骨髓间充质干细胞(MSC)及细胞因子对脐血CD34+造血祖细胞体外扩增的作用,及其扩增作用对细胞黏附分子的影响,用免疫磁珠富集脐血CD34+细胞,然后接种到含有或不含有MSC和细胞因子的24孔培养板,体外培养1周,观察不同指标并进行组间比较.结果表明:①SDF-1α+SCF+TPO+FL因子组合与SCF+TPO+FL因子组合对脐血CD34+细胞的扩增作用无显著性差异(无论有无MSC细胞层存在)(P＞0.05);②MSC与上述细胞因子共存的培养体系优于相应的单纯细胞因子培养体系(P＜0.05);③扩增前与扩增后脐血造血祖细胞黏附分子CD44的表达没有明显变化.结论:趋化因子SDF-1α对SCF+TPO+FL因子组合的扩增作用无显著影响;MSC增加细胞因子的脐血细胞体外扩增的作用;体外扩增不影响脐血细胞黏附分子CD44的表达.
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脐血CD34+细胞体外短期培养扩增研究
为寻找更有效的体外扩增脐血CD34+细胞的造血细胞因子组合,采集健康产妇脐带血,用免疫磁珠法分选CD34+细胞.采用SCF、FLT3-L、TPO和IL-3 4种具有早期作用的细胞因子的不同组合进行脐血CD34+细胞短期无血清液体培养,观察培养前后有核细胞、CD34+细胞、CD34+/CD38-细胞、CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E数量的变化.结果在3种不同的细胞因子组合中,同时应用SCF、FLT3-L、TPO和IL-3 4种细胞因子培养7 d的扩增效果好.突出的发现是在这种条件下CD34+/CD38-细胞亚群达到平均197.9倍的扩增效果.提示:SCF、FLT3-L、TPO和IL-3 4种细胞因子是脐血CD34+细胞体外扩增理想的细胞因子组合.
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脐血CD34+细胞体外诱导分化为成熟巨核细胞及产出血小板
背景:据作者查新检索,国外尚无通过体外诱导干细胞生成具有功能的血细胞并形成产品的报道.目的:体外诱导脐血CD34+细胞向成熟巨核细胞分化,并观察血小板产出情况.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于200412006在湘雅医院及湘雅三医院中心实验室完成.材料:脐带来源于足月妊娠健康产妇,由湘雅医院提供.方法:免疫磁珠法分选脐血CD34+细胞,按5×107L-1密度接种于24孔培养板,加入含L-谷氨酰胺、铁饱和的人转铁蛋白、CaCl2、胰岛素、去离子牛血清白蛋白及重组人血小板牛成素的StemPro-34无血清培养基,置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件F向巨核细胞诱导培养14～21d.吸取细胞培养液,离心取上清,再次离心弃上清,余下物质即为细胞培养液中比重较小的血小板样颗粒.同法分离正常富血小板血浆中的血小板.主要观察指标:培养细胞与上清液中血小板样颗粒的形态变化、免疫组织化学染色结果、显微及超微结构观察,血小板聚集情况及CD41的表达.结果:培养第10天,巨核细胞诱导培养体系中出现丝状物质,片有血小板样颗粒产生,第16天达高峰:培养细胞强阳性表达血小板特异件抗原GP Ⅱb Ⅲa:光镜观察培养细胞呈成熟巨核细胞形态,但也可见幼稚巨核细胞样,巨核细胞旁可见血小板样颗粒:电镜观察培养细胞大多呈成熟巨核细胞形态,少量呈凋亡状态,上清液中血小板样颗粒与富血小板血浆中的血小板大小、超微结构基本一致,有的血小板表面光滑,有的则呈现不规则表面.上清液中血小板样颗粒与正常富血小板血浆中的血小板均能对凝血酶产生聚集反应,流式细胞仪检测两者具有同样的CD41高表达率.结论:脐血CD34+细胞能在体外诱导生成高纯度且成熟的巨核细胞,并产出血小板.
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靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控
背景:脐血干细胞是基因治疗理想的靶细胞之一,但基因转移率低下是目前面临的主要障碍.酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用,为了克服脐血基因转移率低下的障碍,根据基因调控表达技术原理,是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34+细胞体系.目的:探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性. 单位:卫生部北京医院血液科.材料:实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成.脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血.脐血由北京医院妇产科提供,产妇及家属均知情同意,实验经医学伦理委员会批准.MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司, 流式细胞仪购自美国FACScalibur,人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品,SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心.方法:构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成.AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导.该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因,用作检测细胞增殖的标记.应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+ 细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞.转导后的CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组.主要观察指标:①应用流式细胞仪测定两组CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率,确定基因转移率.②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果.③取培养10周的脐血CD34+细胞于裸鼠的胁部皮下注射,30 d后观察成瘤情况.结果:①实验组与对照组均可获得CD34+ 细胞大量扩增.随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失.②实验组转基因CD34+ 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞,所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主.③裸鼠实验无致瘤特性.结论:转染JAK2 基因的人脐血CD34+ 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值.
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脐血CD34+细胞体外培养生成成熟巨核细胞并产出血小板的研究
目的:诱导脐血造血细胞在体外分化为成熟的巨核细胞并产出血小板,以探讨血小板的生成及释放机制.方法:通过采用优化的培养体系对免疫磁珠分选后得到的脐血CD34+细胞分别进行向巨核系分化的液体培养和集落培养,将培养的细胞和分离的上清液中的血小板样颗粒进行流式细胞术、免疫组织化学染色、光镜、电镜及血小板聚集实验的检测.结果:培养的巨核细胞有前血小板伸出,培养的巨核细胞和血小板样颗粒与正常的巨核细胞和血小板结构一致.免疫组织化学染色检测显示培养的细胞表达血小板特异性抗原GPⅡbⅢa的阳性率为95%以上,且为强阳性.培养的血小板大小颗粒与正常血小板均能对凝血酶产生聚集反应.流式细胞仪检测显示培养的血小板与正常血小板均具有同样的CD41高表达率.结论:脐血造血细胞能在体外诱导生成高纯度且成熟的巨核细胞并产出血小板,为血小板生成机制研究提供一个良好的技术平台.
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靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控的实验研究
目的 探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性.方法 构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2,内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v,F2)组成.AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导.该载体同时含有绿色荧光蛋白(GFP)报告基因,用作检测细胞增殖的标记.应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+细胞,用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞.转导后的CD34+细胞在SCF、FL、TPO、IL-6细胞因子的联合培养条件下,以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组.定期检测CD34+细胞基因转移后GFP动态变化、细胞免疫标记、造血祖细胞集落培养和裸鼠致瘤试验.结果 分选的CD34+细胞纯度为91%以上,基因转移率为49.3%±6.2%;实验组AP20187+SCF+FL+TPO+IL-6(ASFTI)与对照组SCF+FL+TPO+IL-6(SFTI)组均可获得CD34+细胞大量扩增.随着培养时间的延长,实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上,而对照组GFP阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失.在培养6周左右,实验组CD34+CD38-、CD34+CD38+细胞亚群扩增倍数分别为(228.26±32.31)、(321.48±40.52),分别与对照组相比,差异有显著性.ASFTI组转基因CD34+细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落(BFU-E、CFU-GM、CFU-Mix).扩增后CD34+细胞检测染色体核型正常,裸鼠实验无致瘤特性.结论 转染JAK2基因的人脐血CD34+细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞,对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值.
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两种方法转染EGFP基因对脐血造血干/祖细胞体外生长影响的比较
目的 探讨两种非病毒载体介导增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染方式对脐血干/祖细胞体外生长的影响.方法 免疫磁珠分选CD34+脐血干/祖细胞,平均分为3组,即未转染EGFP组、阳离子聚合物转染EGFP组和电穿孔转染EGFP组,将各组脐血CD34+细胞接种于人骨髓间充质干细胞(MSCs)构建的二维培养体系中在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,7 d后进行集落形成单位(CFU)实验和高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)实验.并利用荧光显微镜观察转染EGFP的CD34+细胞集落形成,Wright-Giemsa 染色了解其分化情况.结果 阳离子聚合物转染和电穿孔转染都可减少造血干/祖细胞集落形成的数目,且集落的大小也较未转染组小(P＜0.05).电穿孔转染组荧光集落形成的数目多于阳离子聚合物转染组,且所形成的荧光集落更大更亮(P＜0.05).两种转染方式的脐血造血干/祖细胞在体外培养后仍具有多向分化能力.结论 这两种非病毒载体介导EGFP基因转染方式均可造成脐血造血干/祖细胞生物学特性不同程度的损害.但电穿孔转染方式对于造血干/祖细胞体外生长损害较阳离子聚合物转染要小,且转染效率更高,转染基因表达更稳定.
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体外诱导人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化
目的探讨在体外培养条件下人脐血CD34+细胞向肝细胞的分化.方法用磁性细胞分选试剂盒(MACS)分离出CD34+细胞后在含50 mL/LFBS,1×ITS,4.7 mg/L亚油酸,10-4mol/L2-磷酸抗坏血酸的低糖型DMEM中培养,并以FGF4(100μg/L)、HGF(20μg/L)进行诱导.分别于生长因子刺激前和刺激8、16 d时留取细胞.通过RT-PCR对ALB、AFP、GATA-4等mRNA的表达水平进行检测;用免疫细胞化学染色检测ALB蛋白的表达,并收集培养液测定ALB的质量浓度.结果流式细胞仪检测结果显示CD34+细胞的平均分离纯度＞90%,达到分离要求.RT-PCR检测到诱导后的CD34+细胞表达ALB、AFP、GATA4 mRNA.免疫细胞化学染色可见诱导16 d的CD34+细胞出现ALB阳性表达细胞,ELISA检测表明诱导组8、16 d培养液中的ALB质量浓度明显增高,与诱导前和未诱导组相比均有显著差异(P＜0.01).结论在体外培养条件下,脐血CD34+造血干细胞可分化为表达白蛋白的类肝细胞.
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人参皂甙Rg1和Rb1对脐血CD34+细胞凋亡的影响
目的探讨人参皂甙Rg1和Rb1对体外培养体系中撤除细胞因子引起的脐血CD34+细胞凋亡的干预作用.方法免疫磁珠法纯化获得脐血CD34+细胞,在含有TPO(50μg/L)、SCF(50μg/L)的StemSpanTMSFEM无血清液体培养基中培养7天后,撤除细胞因子实验组加入不同浓度Rg1、Rb1,24h和72h后收集细胞,流式细胞仪FITC-Annexin-V/PI双色荧光标记检测细胞凋亡率,比色法检测Caspase-3活性.结果撤除细胞因子24h后,撤因子组细胞凋亡率为(24.79±2.80)%,Rgl(2.5mg/L、5mg/L、10mg/L)各组细胞凋亡率均降低,分别为(12.35±2.07)%、(11.87±1.20)%和(13.91±0.50)%(P＜0.01);Rb1各组(5mg/L、10mg/L)的细胞凋亡率分别为(17.88±0.65)%、(20.61±0.85)%(P＜0.01);撤除细胞因子24h和72h对照组,Caspase-3活性设为1.00,Rg1-2.5组(0.72±0.09,0.57±0.22,P＜0.01),Rg1-5组(0.51±0.11,0.42±0.10,P＜0.01),Rg1-10组(0.63±0.06,P＜0.01;0.83±0.12,P＞0.05),Rb1-5组(0.54±0.18,0.32±0.18,P＜0.01)Rb1-10组(0.87±0.07,P＞0.05;0.55±0.03,P＜0.01),Caspase-3活性均低于对照组.结论人参皂甙Rg1、Rb1能拮抗因撤除细胞因子诱导脐血CD34+细胞凋亡,此作用与Caspase-3信号通路有关.
