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成纤维细胞生长因子信号调控早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移
目的 利用Sprouty2基因阻断成纤维细胞生长因子(FGF)信号,探讨FGF在早期鸡胚胎发育过程中对神经嵴细胞迁移的影响及其机制. 方法 通过体内培养的方法孵育鸡胚至HH9期,通过显微注射的方法将Sprouty2-绿色荧光蛋白(GFP)质粒注射入神经管腔内.实验侧使用电穿孔转染的方法转染胚胎半侧神经管,另一侧正常神经管设为对照侧.采用神经嵴细胞特异标记物HNK1免疫荧光的方法检测Sprouty2基因阻断FGF信号后是否影响胚胎头部和躯干部神经嵴细胞的迁移过程.随后,进一步通过检测神经细胞钙黏分子N-Cadherin的表达来观察细胞之间黏附作用的改变. 结果 HNK1免疫荧光检测结果显示,Sprouty2转染侧即阻断FGF信号通路后,HNK1在早期鸡胚胎的头部和躯干部的表达量均比对照侧的表达量增多；而神经细胞钙黏分子N-Cadherin检测结果表明,Sprouty2转染侧和正常对照侧N-Cadherin在头部和躯干部神经管上表达量的差异均无显著性. 结论 Sprouty2基因阻断FGF信号后,促进了早期鸡胚胎神经嵴细胞的迁移,但是FGF信号对此过程的影响可能不是由神经钙黏分子N-Cadherin介导的.
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电穿孔转染悬浮细胞条件的优化
目的 以RNA依赖性腺嘌呤脱氮酶(ADAR1)为靶基因优化悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞的电穿孔转染条件.方法 通过控制电压、温度、细胞状态等转染条件,采用不同条件组合将靶向ADAR1的sRNA导入悬浮培养的小鼠原代淋巴细胞,用倒置显微镜观察、细胞计数、台盼蓝拒染试验来计算sRNA序列转染率和细胞存活率.结果 小鼠原代淋巴细胞在400 V,40 μs条件下可获得大转染率,约为30.6;良好的细胞状态以及低温条件可获得更好的转染效果.结论 电穿孔转染法是一种高效的基因转染方法,通过优化其转染条件,可以提高其对悬浮细胞的转染率.
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四种嵌合免疫受体在T淋巴细胞中的表达分析
目的 利用基因工程技术构建含人源抗癌胚抗原(CEA)单链抗体(scFv)的4种嵌合免疫受体(CIR),比较其在T淋巴细胞表面表达的情况.方法 将构建好的嵌合免疫受体CIRZ、CIR1、CIR2、CIR3通过电穿孔方法分别转染人T淋巴细胞,流式细胞仪检测各嵌合免疫受体在T淋巴细胞的表达情况.结果 有3种嵌合免疫受体成功表达在T细胞的表面,它们分别是CIR1、CIR2、CIR3,其中CIR3的表达更好.结论 嵌合免疫受体能够在T淋巴细胞的表面有效表达,为下一步的体内实验打下基础,同时为这一治疗策略终应用于临床提供可靠的实验依据.
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靶向大鼠β-catenin基因的小RNA对离体缺氧缺血性脑损伤大鼠神经干细胞分化及Ngn1、BMP4基因表达的影响
目的 探讨缺氧缺血性脑损伤(HIBD)大鼠神经干细胞(NSCs)修复损伤的可能机制.方法 传至2、3代的SD大鼠NSCs随机为空白对照组(未转染质粒者,CON),转染阴性对照质粒组(ncNSCs)和转染β-catenin siRNA真核表达质粒组(siNSCs),分别在不同脑组织匀浆上清液中培养,以模拟HIBD及正常脑内微环境.应用免疫荧光方法观察各组NSCs的分化情况；应用反转录PCR、Western blot法检测NSCs Ngn1,BMP4基因表达情况.结果 与CON组比较,ncNSCs分化为神经元和少突胶质细胞的百分比明显增加(Pa＜0.05),其中HIBD组增加较多；ncNSCs分化为星形胶质细胞的百分比显著减少(P＜0.05).与CON组相比,siN-SCs分化为神经元的百分比显著减少(P＜0.01),分化为星形胶质细胞的百分比显著增加(P＜0.01)；少突胶质细胞的分化增加,但少于ncNSCs组(P＜0.01),其中HIBD组分化为神经元和少突胶质细胞较多.与CON组比较,ncNSCs Ngn1 mRNA和Ngn1蛋白的表达显著增加(Pa＜0.01),而BMP4 mRNA和BMP4蛋白的表达均显著减少(Pa＜0.01)；与CON组和ncNSCs组比较,siNSCs的Ngn1 mRNA和Ngn1蛋白表达显著减少(Pa＜0.01),BMP4 mRNA和BMP4蛋白的表达显著增加(Pa＜0.01),2个siNSCs组间Ngn1和BMP4的表达差异无统计学意义.结论 HIBD时受损的脑组织可进行自主修复,与β-catenin促进ncNSCs向神经元分化有关,BMP4和Ngn1在HIBD大鼠NSCs的增殖分化中起重要的协调作用.
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质粒电穿孔转染条件的选择
电穿孔转染,作为物理方法的一种,出现于20世纪80年代中期~([1]).这种方法不仅能够将DNA、RNA,还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞.它是一种高效、简便的基因转移系统,具有其它转移方法无可比拟的优越性,如操作简便、快捷,可重复性强,转染率高,适用谱广等.
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电穿孔转染SD大鼠神经干细胞条件优化
目的 以原代培养的SD大鼠神经干细胞为研究对象,优化电穿孔转染条件.方法 通过设置不同的电压、脉冲时间、电压脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的靶向大鼠β-catenin基因的siRNA质粒导入SD大鼠神经干细胞,48 h后观察并比较神经干细胞的转染效率,确定佳电转染条件.结果 300V电压、60μs脉冲时间或300V电压、80μs脉冲时间的转染条件下,SD大鼠神经干细胞可获得较好的转染效率,分别为(62.21±11.56)％和(53.34±9.0)％.结论 电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化,可以提高SD大鼠神经干细胞的电转染效率
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两种方法转染EGFP基因对脐血造血干/祖细胞体外生长影响的比较
目的 探讨两种非病毒载体介导增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)转染方式对脐血干/祖细胞体外生长的影响.方法 免疫磁珠分选CD34+脐血干/祖细胞,平均分为3组,即未转染EGFP组、阳离子聚合物转染EGFP组和电穿孔转染EGFP组,将各组脐血CD34+细胞接种于人骨髓间充质干细胞(MSCs)构建的二维培养体系中在无外源性细胞因子情况下进行体外培养,7 d后进行集落形成单位(CFU)实验和高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)实验.并利用荧光显微镜观察转染EGFP的CD34+细胞集落形成,Wright-Giemsa 染色了解其分化情况.结果 阳离子聚合物转染和电穿孔转染都可减少造血干/祖细胞集落形成的数目,且集落的大小也较未转染组小(P＜0.05).电穿孔转染组荧光集落形成的数目多于阳离子聚合物转染组,且所形成的荧光集落更大更亮(P＜0.05).两种转染方式的脐血造血干/祖细胞在体外培养后仍具有多向分化能力.结论 这两种非病毒载体介导EGFP基因转染方式均可造成脐血造血干/祖细胞生物学特性不同程度的损害.但电穿孔转染方式对于造血干/祖细胞体外生长损害较阳离子聚合物转染要小,且转染效率更高,转染基因表达更稳定.
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小鼠大脑皮质神经元电穿孔转染条件的优化
目的:以原代培养的小鼠大脑皮质神经元为研究工具,优化电穿孔转染条件.方法:通过设置不同的电压和脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的shNC质粒导入小鼠大脑皮质神经元,24 h后观察并比较神经元的转染效率,确定佳电转染条件.结果:200 v电压,25 ms,脉冲时间或250 v电压,15 ms脉冲时间的转染条件下,小鼠大脑皮质神经元可获得较好的转染效率,分别为(31.15±1.89)%和(29.10±1.93)%.结论:电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化,可以提高小鼠大脑皮质神经元的电转染效率.
