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UPLC-MS/MS同时测定雷公藤悬浮细胞中8种萜类成分
目的 建立超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography triple quadrupole tandem mass spectrometry,UPLC-QQQ-MS/MS)同时测定雷公藤悬浮细胞中8种萜类成分的定量分析方法.方法 采用Waters HSS T3 C18色谱柱,以0.1％甲酸水-乙腈为流动相,梯度洗脱,流速0.3 ml/min,柱温30℃.采用电离子喷雾源,选择正负离子交替扫描多反应离子检测模式.结果 雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、去氢松香酸、雷酚内酯、去甲泽拉木醛、雷公藤褔啶、扁塑藤素和雷公藤红素8种萜类成分的检测限和定量限范围分别为0.0096～0.2480 ng和0.0192～0.4960 ng,线性关系良好,线性相关系数r在0.9966～0.9993之间,平均加样回收率为95.04％～105.20％,RSD为2.14％～6.31％.结论 该定量分析方法简便、快捷、灵敏度强、准确性高,可同时定量测定雷公藤悬浮细胞中8种萜类成分的含量,为雷公藤及其植物组织培养物的研究和质量控制提供方法学依据.
关键词： 雷公藤 萜类 悬浮细胞 化学定量分析 超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱 -
不同浓度脱落酸对雷公藤悬浮细胞萜类次生代谢产物累积的影响
目的:研究不同浓度脱落酸(Abscisic acid,ABA)对雷公藤悬浮细胞中萜类次生代谢产物的诱导效应,探讨脱落酸的毒物效应(Hormesis).方法:雷公藤悬浮细胞继代培养10 d后,分别加入不同浓度(10 μM,20 μM,50 μM,100 μM,150 μM,200 μM,500 μM)的ABA诱导,并设置空白对照组,每组生物学重复4次.分别采用HPLC和UPLC检测诱导后0 h和240 h的样品,测定悬浮细胞中雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤红素和雷公藤内酯甲4种萜类成分的含量.结果:当ABA浓度为10 μM和20 μM时,诱导组与对照组无差异;50 μM时,与对照组比较,雷酚内酯含量明显升高,雷公藤红素含量升高至2.4倍,雷公藤内酯甲含量升高至4.7倍;当诱导浓度超过100 μM时,与对照组比较,除雷公藤内酯甲外,雷公藤甲素、雷酚内酯、雷公藤红素含量均显著降低.结论:ABA在10~500 μM范围内对不同的雷公藤萜类成分影响作用不同,从整体趋势看,呈现为β曲线,符合Hormesis效应特点;50 μM时ABA对雷公藤红素含量的积累有显著促进作用,为后期研究ABA影响雷公藤红素合成机制奠定基础.
关键词： 脱落酸 雷公藤 悬浮细胞 萜类成分 Hormesis效应 -
雷公藤TwCYP88A1基因全长cDNA克隆与表达分析
目的:研究雷公藤萜类成分的生物合成相关基因,在雷公藤转录组信息数据的基础上,以雷公藤悬浮细胞为研究材料,克隆TwCYP88A1基因.方法:采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆雷公藤TwCYP88A1基因,实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)分析其组织表达谱.结果:TwCYP88A1 cDNA全长1 594 bp,编码491个氨基酸,等电点9.16,相对分子质量55.957 kDa,具有半胱氨酸铁血红素配体信号活性催化位点.植物组织表达分析表明TwCYP88A1基因在雷公藤叶中的表达量高,根中低.结论:从雷公藤悬浮细胞中克隆得到TwCYP88A1基因全长cDNA,对其进行生物信息学分析,揭示其组织表达谱,为深入分析雷公藤细胞色素P450酶、解析雷公藤萜类化合物的生物合成下游途径奠定基础.
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光照对黄芩悬浮细胞内源激素与有效成分相关性的影响
目的:研究光照对黄芩悬浮细胞内源激素与有效成分相关性的影响.方法:采用HPLC法检测黄芩悬浮细胞中黄芩苷含量,酶联免疫吸附法检测内源激素.结果:研究结果表明在光照条件下,伴随着IAA含量的降低,黄芩苷含量也随之降低,两者变化曲线显著相关(r=0.972).相对较高的IAA含量和相对较低的GAs含量有利于黄芩苷的积累,而绝对的GAs含量在本研究中并没有表现出与黄芩苷有很强的相关性.结论:黄芩悬浮细胞有效成分与内源激素绝对含量以及相对含量具有相关性.
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外源生长素对黄芩悬浮细胞有效成分和内源激素含量的影响
目的:探讨外源生长素对黄芩悬浮细胞有效成分和内源激素含量的影响.方法:将稳定继代的黄芩愈伤组织在含有不同浓度NAA或KT的MS液体培养基悬浮震荡培养,光照16 h黑暗8h进行培养18d后,采用HPLC的方法,测定黄芩苷的含量,采用酶联免疫吸附法测定内源激素的含量,以黑暗条件为对照.结果:①与对照组相比,光照和黑暗条件下分别加入0.2 mg· L-1NAA后,黄芩苷含量显著降低,分别为未加入NAA时的2.56%,3.36%.②黑暗条件下,加入外源NAA后,ZR含量显著降低,但IAA,ABA和GAs含量变化不明显.③0.2 mg·L-1 NAA和不同浓度KT的协同作用对黄芩苷的含量呈现先增长后降低的趋势.其中1.0 mg·L-1的KT作用下黄芩苷含量高,且黑暗条件下显著高于光照条件,达到2.13μg·L-1.结论:外源生长素不利于黄芩有效成分黄芩苷的积累,0.2 mg·L-1 NAA+ 1.0 mg·L-1 KT的组合对黄芩苷的积累量具有显著的促进作用.
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非生物诱导子茉莉酸甲酯和水杨酸对半夏悬浮细胞中生物碱代谢的影响
目的：研究非生物诱导子茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）对半夏悬浮细胞系生物碱含量及相关酶活性的影响。方法以叶柄来源的愈伤组织建立半夏悬浮细胞系，调查不同培养时间、MeJA和SA浓度对细胞中生物碱含量的影响，并分析生物碱合成相关酶（IMP脱氢酶、sAMP合成酶）的活性。结果悬浮培养21 d时，悬浮细胞干重（DW）为培养前9倍，且生物碱总量为培养前3倍。MeJA和SA处理均能显著促进生物碱在半夏悬浮细胞中累积。150μmol/L MeJA处理组生物碱含量为对照组3.6倍，达4.7 mg/g DW；50μmol/L SA处理使悬浮细胞生物碱含量达到对照组的2.5倍。100μmol/L MeJA和50μmol/L SA处理使IMP脱氢酶比活力分别为对照组3.0、3.7倍，150μmol/L MeJA和100μmol/L SA处理使sAMP合成酶比活力分别为对照组2.6、4.4倍。结论添加适量外源诱导子MeJA和SA能促进半夏悬浮细胞中生物碱的累积。
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杜仲愈伤组织与悬浮细胞中黄酮和绿原酸积累研究
目的:比较杜仲愈伤组织和悬浮细胞生长及其次生代谢产物黄酮和绿原酸的积累.方法:将杜仲无菌苗真叶诱导的愈伤组织进行悬浮培养,研究了悬浮培养物生长的动态和总黄酮类及绿原酸产量积累的动态.结果:杜仲愈伤组织中黄酮和绿原酸高分别达到13.46,1.712 mg·g~(-1),而悬浮细胞中黄酮和绿原酸高分别达到16.63,3.93 mg·g~(-1).结论:与愈伤组织相比,悬浮细胞具有生长周期短、速率快、黄酮和绿原酸积累量高的优势.
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柘树悬浮培养细胞的化学成分研究
采用硅胶柱色谱,半制备HPLC,Sephadex LH-20等分离和纯化技术,从柘树悬浮细胞培养物中分离得到了10个化合物,依据其理化性质和各种波谱技术分别鉴定为1,3,5-三羟基-4-异戊烯基(口山)酮(1),怀特酮(2),6-异戊烯基芹菜素(3),甘草黄酮C(4),柘树黄酮C(5),erythrivarone A (6),derrone(7),红花素(8),染料木素(9)和香橙素(10).其中化合物1为(山)酮类化合物,化合物2～10为黄酮类化合物,化合物1是从该植物中未曾分离得到的化合物.
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光照对黄芩黄酮类活性成分积累及其相关基因表达的影响
目的:研究光照对黄芩悬浮细胞中黄芩苷、黄芩素的积累及相关基因表达的影响.方法:采用HPLC法检测黄芩悬浮细胞中黄芩苷、黄芩素的含量,应用半定量RT-PCR的方法对相关基因的表达进行分析.结果:光照对黄芩悬浮细胞中有效成分的积累有显著的促进作用,与黑暗条件相比,细胞生长13 d后黄芩苷含量显著增长了806.1%,黄芩素含量显著增长了42.5%,PAL基因在光照条件下的转录水平高于在黑暗条件,光照条件下UBGAT同黄芩素显著相关(r=-0.995).结论:光诱导对黄芩悬浮细胞中有效成分的积累有显著的促进作用,光诱导刺激了与有效成分的积累相关基因(PAL,UBGAT)的表达.
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半夏悬浮培养细胞的EMS诱变和耐高温突变体筛选
目的:确定EMS诱变处理半夏悬浮细胞的适浓度和处理时间.方法:用0.1％,0.2％,0.4％,0.6％的EMS溶液,处理时间为0.5,1.0,2.0h,对半夏悬浮细胞系进行诱变处理.结果与结论:结果表明,不同浓度的EMS和不同时间处理半夏悬浮细胞,结果有明显差异,在每个处理时间下,均是随着EMS浓度的增加而悬浮细胞的存活率逐渐下降.EMS诱变半夏悬浮细胞的适宜剂量为0.4％,佳处理时间为1h.
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PEG胁迫对黄芩黄酮类有效成分积累及相关基因表达的影响
目的:研究不同程度PEG胁迫对黄芩悬浮细胞中黄芩苷、黄芩素的积累及相关基因表达的影响.方法:采用HPLC法检测黄芩悬浮细胞中黄芩苷、黄芩素的含量,用酶标仪检测细胞内游离脯氨酸含量,并用半定量RT-PCR的方法对相关基因的表达进行分析.结果与结论:黄芩悬浮细胞内游离脯氨酸含量随PEG胁迫浓度升高而升高,10％ PEG胁迫黄芩悬浮细胞可以模拟干旱条件,提高悬浮细胞PAL基因表达量且会促进黄芩素的积累.20％ PEG胁迫提高了UBGAT基因的表达量,但同时APX酶活性的提高抑制了黄芩素参与清除活性氧,导致了黄芩素向黄芩苷的转化.
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两种非病毒载体介导microRNA转染的对比
microRNA作为核酸类药物,在细胞和生物体内存在稳定性差,半衰期短,转染效率低,靶向性差[1],故转染过程需要高效、高安全性的载体.Lipofectamine是常用的转染脂质体,可与 DNA形成复合物,有较强的转染能力.聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)属阳离子聚合物,在体内外均有较高的转染效率,不良反应较低[2].选择适合的小分子RNA基因载体对其后续研究至关重要.本研究分别选择了脂质体lipofectamin2000和阳离子聚合物PEI作为microRNA的转染载体,在体外检测其在悬浮细胞THP-1中的转染效率和细胞死亡率,比较两种转染载体的转染特性及作为microRNA基因载体的可行性.
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利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应
目的 利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA (shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率.方法 分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒；将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组；将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度.病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定.结果 成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttlescramble和AD-shuttle).经过HEK 293细胞包装,终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011.NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100％；且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P＜0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P＜0.01).结论 携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默.
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羟化酶催化四氢喹啉类的氧化反应研究
目的：利用系列羟化酶产生菌株的假单胞菌整细胞作为生物催化剂，研究羟化酶催化四氢喹啉类底物的氧化反应。方法运用整细胞生物转化法和悬浮细胞转化法催化四氢喹啉类底物的氧化反应研究，并对反应后生成的产物进行HPLC、GC-MS和LC-MS分析。结果系列羟化酶产生菌株能催化四氢喹啉类底物的氧化反应。结论系列假单胞菌在适宜的底物浓度及反应条件下可以对四氢喹啉类底物进行氧化，并有望成为新型的氨基醇类化合物的新合成方式。
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银杏悬浮细胞对酯蟾毒配基3-羟基的选择性异构化反应
目的利用银杏悬浮细胞对酯蟾毒配基进行结构修饰.方法利用只含生长素2,4-D的MS培养基诱导银杏嫩叶,使细胞脱分化形成愈伤组织,然后将愈伤组织转移至含一定浓度6-BA, NAA, 和2,4-D的液体MS培养基中以形成悬浮细胞.把酯蟾毒配基加入生长状态良好的悬浮细胞中转化四天.提取出溶解于液体相的转化产物, 采用硅胶吸附柱层析法, 以石油醚和丙酮为展开体系进行梯度洗脱, 然后对转化产物进行分离纯化.结果经过四天转化, 得到一个转化产物, 转化率达40%, 通过对转化产物的质谱, 核磁共振氢谱和碳谱等波谱数据进行分析, 并与有关文献进行对比, 证明转化产物为3-表-酯蟾毒配基.结论以银杏悬浮细胞作为一种生物酶体系,可以把来源于动物的蟾蜍甾烯类化合物酯蟾毒配基转化成3-表-酯蟾毒配基.
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长春花悬浮细胞培养体系用于生物转化的研究概况
目的 介绍长春花悬浮细胞培养体系的生物转化作用以及生物转化对于中药新药开发的意义.方法 对过去25年中利用长春花悬浮细胞培养体系进行生物转化的文献报道进行了综述.结果 利用该体系共完成了以下6种类型的反应:羟基化、氧化、还原、碳碳双键的氢化作用、糖基结合作用,以及水解作用.结论 用生物转化的方法处理中药中的化学成分,修饰它们的结构或活性位点,对充分发挥我国中药的资源优势,开发具有自主知识产权的新药具有十分重要的意义.
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两种碘化丙啶染色 DNA 定量方法检测 HL-60细胞凋亡结果的比较
碘化丙啶(propidium iodide,PI)是插入性核酸染料,直接插入双链核酸的2个碱基对之间,每5个碱基插入1个荧光分子,与核酸的结合均匀、稳定。细胞经过 RNA 酶处理后,PI 可以与细胞内 DNA 特异性结合,在流式细胞仪上经488 nm 激光激发,发出峰值610~620 nm 的荧光,可以准确的反映细胞群体中DNA 含量的分布情况,适用于 DNA 定量检测。根据细胞周期中不同时项 DNA 的变化来检测细胞周期中DNA 合成前期( G0/ G1期)、 DNA 合成期( S 期)与DNA 合成后期(G2期)各时项的细胞比例。因为 PI是适用于所有流式细胞仪的染料,这一染色技术在临床肿瘤诊断和医学科研中被普遍的采用,常规使用的染色方法是包括固定、RNA 酶处理、PI 饱和染色3个关键步骤的3步法 PI 染色技术[1]。在一些研究中,当细胞在生理或病理条件下发生了凋亡,DNA 损伤,细胞内 DNA 降低,也可以采用3步法 PI 染色检测亚 G1峰(也称作凋亡峰),用于凋亡细胞比例和特征的分析[2]。但是在实际应用中,由于凋亡时相的不同,当凋亡细胞中 DNA 损伤部分没有完全脱出细胞时,往往检测不到明确可辨的亚 G1峰,敏感度较低。作为细胞凋亡检测的经典方法之一的彗星检测[3],以细胞在电泳移动中 DNA 的迁移形态作为凋亡的特征指标,此技术中比较关键的一步即采用碱性高渗试剂使凋亡细胞中断裂的 DNA 碎片脱出细胞,从而在电泳迁移中呈现出彗星尾样的拖痕,本课题组利用类似方法,用高渗缓冲液作用于固定后的悬浮细胞,使凋亡细胞内断裂 DNA 较彻底的脱出细胞外,再进行 DNA定量检测,提高对细胞凋亡的识别度和敏感性[4]。
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流式细胞术的发展、原理及临床应用
流式细胞术(FCM)是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术.是近年来随着细胞生物学、分子生物学、激光技术、电子计算机技术等学科的高度发展而形成的一种对细胞或生物粒子的结构、功能以及相互间作用进行多参数分析的技术，具有速度快、敏感性高、准确性好等优点[1,2].下面就从FCM的发展、原理以及临床应用上进行一综述,供大家参考.
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流式细胞术的发展、原理及临床应用
流式细胞术(FCM)是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术.是近年来随着细胞生物学、分子生物学、激光技术、电子计算机技术等学科的高度发展而形成的一种对细胞或生物粒子的结构、功能以及相互间作用进行多参数分析的技术,具有速度快、敏感性高、准确性好等优点[1,3].下面就从FCM的发展,原理以及临床应用上进行一综述,供大家参考.
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基于多指标综合评分和正交设计优化雷公藤悬浮细胞总萜类物质的提取工艺
目的 优化雷公藤悬浮细胞总萜类物质的提取工艺.方法 采用UPLC-QQQ-MS测定雷公藤悬浮细胞中雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素的含量.色谱条件为:Waters HSS T3色谱柱(2.1 mm ×100 mm,1.8 μm);0.1％甲酸水溶液-乙腈梯度洗脱;柱温30℃;流速0.3 mL/min;进样量5μL.以3种萜类成分含量的综合评分为指标,在单因素试验的基础上,设计L9(34)正交试验优化甲醇浓度、提取时间和溶剂用量3个参数,并通过验证试验判断该工艺的可行性.结果 雷公藤悬浮细胞萜类成分佳提取工艺为:加入50倍量80％甲醇,浸渍12 h后,超声提取0.5 h,在此条件下,雷公藤甲素、雷酚内酯和雷公藤红素的提取量分别为(52.36±0.60)、(170.73±1.57)、(388.14±5.89) μg/g,综合评分稳定.结论 基于多指标综合评分法和正交设计优化的雷公藤悬浮细胞总萜类物质提取工艺合理可行、重复性好,具有一定的实用性,适用于雷公藤悬浮细胞总萜类物质的大规模提取,可为雷公藤药用资源的开发利用提供参考依据.
