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华蟾素注射液中酯蟾毒配基的分离及体内外抗肿瘤活性筛选
目的:通过观察华蟾素注射液中酯蟾毒配基体内外抗肿瘤的作用效果和对部分酯蟾毒配基类单体体外抗胰腺癌细胞的药效筛选,以明确酯蟾毒配基抗胰腺癌的物质基础.方法:运用现代色谱技术分离华蟾素注射液,得到酯蟾毒配基类成分,采用HPLC-DAD-FT-ICR-MS分析并鉴定酯蟾毒配基类化合物的主要单体.通过体外细胞筛选酯蟾毒配基抗肿瘤的活性,在体内建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型以评价酯蟾毒配基药效,在体外将分离所得酯蟾毒配基的主要活性单体进行抗胰腺癌活性筛选.结果:华蟾素注射液中的酯蟾毒配基在体外对肝癌BEL7402细胞,胃癌BGC823细胞和胰腺癌SW1990,MIA PaCa-2细胞的半数抑制浓度(IC50)分别为(0.47 ±0.03),(0.06±0.01),(0.06±0.02),(0.11±0.03) g·L-1,酯蟾毒配基的半数致死量(LD50)为20 mg·kg-1,体内对SW1990荷瘤裸鼠的治疗效果接近化疗药物吉西他滨,从酯蟾毒配基中分离并鉴定的12个活性物质体外抗胰腺癌的活性筛选出日蟾毒它灵、沙蟾毒精和嚏根草苷元对SW1990和BxPC-3细胞具有明显抑制作用.结论:华蟾素注射液中酯蟾毒配基在体外对胰腺癌细胞的抑制率与胃癌几乎相同,在体内对胰腺癌荷瘤裸鼠有明显治疗效果,同时酯蟾毒配基中的单体成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精和嚏根草苷元在体外对胰腺癌细胞有明显的抑制作用.
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HPLC法测定蒡芩慢咽滴丸中酯蟾毒配基及华蟾酥毒基的含量
可靠.
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不同品种及产地蟾皮中抗肿瘤活性成分含量比较
目的:对不同品种及不同产地蟾皮中所含抗肿瘤脂溶性活性成分酯蟾毒配基、华蟾酥毒基以及水溶性活性成分吲哚类生物碱的含量进行比较.方法:应用HPLC法测定广西、湖南、陕西产黑眶蟾蜍,江苏、安徽、河北、山东产中华大蟾蜍蟾皮中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基的含量,并采用分光光度法,以5-羟色胺盐酸盐为对照测定其所含吲哚类生物碱的含量.结果:山东产蟾皮中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基未检测到,其余6个产地蟾皮中酯蟾毒配基、华蟾酥毒基的含量分别在0.0612-0.5760、0.1163-0.4950mg/g,其中河北产蟾皮中酯蟾毒配基含量高,江苏产蟾皮中华蟾酥毒基含量高.7个产地蟾皮中吲哚类生物碱含量在0.5150-1.300mg/g,其中江苏产蟾皮中吲哚类生物碱含量高,河北产含量低.结论:不同品种蟾皮差异不大,但不同产地蟾皮中抗肿瘤活性成分的含量存在较大差异,因此在研发以蟾皮为主药的抗肿瘤制剂时,应建立蟾皮药材的质量控制标准,以保证制剂的质量.
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灵猫香解毒丸的质量标准研究
目的:制定灵猫香解毒丸的含量测定标准.方法:采用反相高效液相色谱法测定蟾酥中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基.结果:华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在48.84～784.44,50.28～804.48 ng与峰面积呈良好线性关系,平均回收率100.5%,100.3%.结论:本实验定量方法简便、实用,重复性好,能够较好控制灵猫香解毒丸的质量.
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多指标综合评价优选蟾皮脂溶性成分提取工艺
目的 考察蟾皮中的脂溶性有效成分华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的乙醇回流提取工艺.方法 建立HPLC法测定蟾皮提取物中两种有效成分的含量,采用正交试验设计,以乙醇浓度、提取时间及加醇倍数为因素,以浸膏得率、两种有效成分含量为评价指标,考察蟾皮乙醇煎煮回流提取方法,结合方差分析确定佳提取工艺.结果 在0.35～5.6μg ·ml-1范围内,华蟾酥毒基线性方程:A =36793C +743.9(r =0.9990,n=6),平均加样回收率为97.77％;在0.30 ～4.8 μg ·ml-1范围内,酯蟾毒配基回归方程:A =28 149C +2084.5(r=0.9990,n=6),平均加样回收率98.31％.乙醇煎煮回流法各因素影响顺序为:乙醇浓度＞提取时间＞加醇倍数,确定优提取工艺为A3B1C1.结论 乙醇浓度是影响蟾皮中脂溶性成分提取工艺的主要因素,采用多指标综合评价法优化蟾皮脂溶性成分提取工艺合理、可行.
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华蟾酥毒基和酯蟾毒配基与不同血浆蛋白结合率的测定
建立测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基与人、比格犬和大鼠血浆蛋白结合率的方法；采用平衡透析法,并以高效液相色谱法进行测定,计算华蟾酥毒基和酯蟾毒配基与不同血浆的蛋白结合率.华蟾酥毒基和酯蟾毒配基在3种不同透析内液中的线性范围均为0.50～40.00 μg·mL-1,透析外液均为0.25～4.00 μg·mL-1.在3种不同透析内液和透析外液中,华蟾酥毒基提取回收率为(68.73±2.16)％～(79.27±1.62)％,酯蟾毒配基为(71.59±4.31)％～(83.47±2.63)％.华蟾酥毒基在人、大鼠和比格犬血浆中的平均血浆蛋白结合率分别为85.63％、80.21％和70.10％,酯蟾毒配基分别为84.51％、75.11％和70.60％.结果表明,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基与3种血浆蛋白结合率较高,且结合率人＞大鼠＞比格犬.
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HPLC法测定心可宁胶囊中蟾酥的含量
目的:采用HPLC法测定心可宁胶囊中蟾酥的含量.方法:色谱柱为Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相为乙腈- 0.5%磷酸二氢钾溶液(55∶45)(用磷酸调pH值为3.2),流量1.0 mL·min-1,检测波长296 nm.结果:华蟾酥毒基在5～100 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r=1.000 0),平均回收率为99.0%,RSD为1.8%;酯蟾毒配基在4.99～99.8 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r=1.000 0),平均回收率为98.2%,RSD为1.4%.结论:本法简便、快速、准确,可用于产品的质量控制.
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心可宁胶囊中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的HPLC法含量测定
目的:建立HPLC法测定心可宁胶囊中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量测定方法,以更好的控制其质量.方法:采用Thermo C18色谱柱,以0.5％磷酸二氢钾溶液-乙腈(50:50)为流动相,用磷酸调pH至3.2,检测波长为296 nm.结果:华蟾酥毒基在30.72 ～71.68 μg· mL-1范围内呈良好的线性关系(r=1.0000),酯蟾毒配基在30.78 ～71.82 μg· mL-1范围内呈良好的线性关系(r =0.9999),华蟾酥毒基和酯蟾毒配基平均回收率分别为99.76％和99.88％,RSD分别为1.29％和0.62％;测定3批样品,华蟾酥毒基和酯蟾毒配基总量分别为0.053、0.053、0.054 mg·粒-1,RSD为1.09％.结论:本方法准确、有效,可以作为该类产品的质控检测方法.
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RP-HPLC测定蕲龙胶囊中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量
目的 建立蕲龙胶囊中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量测定方法.方法 采用高效液相色谱法,Phenomenex luna C18 (250 mm× 4.6mm,5μm)色谱柱,流动相为乙腈-水(50:50),流速0.8 mL/min,检测波长296nm.结果 方法学考察结果表明,本研究建立的分析方法有较好的重现性和稳定性.华蟾酥毒基平均加样回收率为98.5％(RSD-0.55％,n=6)；酯蟾毒配基平均加样回收率为101.0％(RSD=0.67％,n=6).结论 本方法定量准确、重复性好,可用该制剂的质量控制.
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银杏悬浮细胞对酯蟾毒配基3-羟基的选择性异构化反应
目的利用银杏悬浮细胞对酯蟾毒配基进行结构修饰.方法利用只含生长素2,4-D的MS培养基诱导银杏嫩叶,使细胞脱分化形成愈伤组织,然后将愈伤组织转移至含一定浓度6-BA, NAA, 和2,4-D的液体MS培养基中以形成悬浮细胞.把酯蟾毒配基加入生长状态良好的悬浮细胞中转化四天.提取出溶解于液体相的转化产物, 采用硅胶吸附柱层析法, 以石油醚和丙酮为展开体系进行梯度洗脱, 然后对转化产物进行分离纯化.结果经过四天转化, 得到一个转化产物, 转化率达40%, 通过对转化产物的质谱, 核磁共振氢谱和碳谱等波谱数据进行分析, 并与有关文献进行对比, 证明转化产物为3-表-酯蟾毒配基.结论以银杏悬浮细胞作为一种生物酶体系,可以把来源于动物的蟾蜍甾烯类化合物酯蟾毒配基转化成3-表-酯蟾毒配基.
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HPLC同时测定干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基成分的含量
目的：建立干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基2种化学成分含量测定的高效液相色谱法。方法：采用DIKMA C18色谱柱（250 mm×4.5 mm，5μm），流动相为磷酸盐缓冲液（30 mmol/L磷酸二氢钾以磷酸调节pH值为3.0）及乙腈，梯度洗脱，柱温为35℃，流速为0.8 mL/min，进样量为10μL，检测波长为296 nm。结果：2种化学成分检出限浓度均为1.0μg/mL，定量限浓度均为2.5μg/mL，线性范围为2.5~100.0μg/mL，在线性范围内相关系数均在0.99以上，平均加样回收率为98.8%~99.9%。结论：本方法简便、准确、快速、重复性好、专属性高，可用于干蟾皮中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基2种化学成分的含量测定。
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HPLC法测定安替可胶囊中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量
高效液相色谱法测定安替可胶囊中华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量,色谱柱采用Kromasil C18;流动相为0.5 %磷酸二氢钾溶液-乙腈(60:40) (用磷酸调节pH值为3.2);流速为0.8mL·min-1,检测波长为296nm;两种成份总平均回收率为96.5%,RSD=0.8%;华蟾酥毒基与酯蟾毒配基的浓度分别在0.05～0.45 mg·mL-1范围内,质量浓度与峰面积具有良好的线性关系.本法稳定、准确,重现性好.
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HPLC法同时检查华蟾素片中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基限量和测定蟾蜍噻咛的含量
目的 采用HPLC法对华蟾素片中有毒成分蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基进行限量检查；并利用HPLC法测定其有效成分蟾蜍噻咛的含量.方法 限量检查:色谱柱为Agela C18柱,流动相为乙腈-0.5％磷酸二氢钾溶液(50∶50)(用磷酸调节pH为3.2),检测波长为296nm.含量测定:色谱柱为Kromasil C18柱,流动相为乙腈-水(10∶90),检测波长为226nm.结果 在与蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基对照品色谱峰相同的保留时间处,5批样品出现的色谱峰面积之和小于对照品峰面积之和.蟾蜍噻咛在0.1045～1.0448μg范围内呈良好的线性关系,r=0.9998;平均回收率为98.9％,RSD=1.6％；每片含量不得少于0.15mg.结论 方法快速、准确、重复性好,可用于华蟾素片质量标准的控制.
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微乳毛细管电泳法测定蟾酥及其制剂中蟾毒内酯类成分的含量
目的 应用微乳毛细管电泳法测定蟾酥及其制剂中蟾毒内酯类成分的含量.方法 运行微乳缓冲液由0.81%正庚烷、6.61%正丁醇、3.31%SDS及89.27%10 mmol/L硼砂溶液组成,pH=9.2.运行电压15 kV(恒压分析);柱温40℃;检测波长298 nm.结果 华蟾毒精和酯蟾毒配基的线性范围分别为54.8～548.0 mg/L及51.6～516.0 mg/L;平均回收率分别为97.29%～99.82%(RSD为1.86%～2.91%,n=6)及97.52%～101.69%(RSD为2.14%～3.02%,n=6).结论 该方法简便、准确、重现性好,可作为蟾酥及其制剂中蟾毒内酯类成分的质量控制方法.
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冻干蟾皮凝胶剂质量标准及初步药效学研究
目的 建立冻干蟾皮凝胶剂质量标准和初步药效学研究.方法 采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基进行定性鉴别,高效液相色谱(HPLC)法测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,色谱柱kromasilC18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-水(B)(48∶52);流速:1 mL/min;检测波长:296 nm;柱温:30℃;进样量:10μL.采用S180腹水型实体瘤小鼠进行初步抑瘤药效学研究.结果 硅胶G薄层板上,在与对照品色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,且斑点大小适中,分离度良好.华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在0.056～4.48 μg/mL,0.256～10.24 μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系(r=0.9987、0.9996).加样回收率(n=6)为100.27％、101.68％,相对标准偏差为1.56％、1.67％.初步药效学结果显示冻干蟾皮凝胶剂不同剂量组均有显著抗肿瘤作用,且高剂量组效果佳,抑瘤率为48.03％.结论 建立了冻干蟾皮凝胶剂质量标准,初步药效学表明冻干蟾皮凝胶剂具有显著抗肿瘤作用.
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反相HPLC法同时测定牛黄消炎丸中华蟾酥毒基、酯蟾酥配基的含量
目的:建立用反相HPLC法同时测定牛黄消炎丸中华蟾酥毒基、酯蟾毒配基含量的方法.方法:采用反相HPLC法测定华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量,色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(25mm×5μm,麦科菲);乙腈-0.5%磷酸二氢钾溶液(40:60)(用磷酸调pH值至3.2)为流动相,检测波长为296nm,柱温为40oC.结果:华蟾酥毒基进样量在0.2578μg～1.5468μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9999,回归方程Y=768131x-16329,平均回收率为97.67%(n=6):酯蟾毒配基进样量在0.2482μg～1.4892μg范围内,与峰面积里良好的线性关系,r=0.9999,回归方程Y=727051x-18342,平均回收率为100.07%(n=6).结论:定量方法操作简便、结果可靠,可用于牛黄消炎丸中蟾酥的质量控制.
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蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基大鼠体内药动学研究
目的 建立检测大鼠血浆中3种蟾蜍甾烯类化合物蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的HPLC法,并用于蟾酥在大鼠体内的药动学研究.方法 分别于大鼠尾iv给予蟾酥提取物0.8 mg/kg后2、5、10、15、20、30、45、60、90 min,眼眶取血,采用乙腈沉淀蛋白与液液萃取相结合方法进行血浆样品预处理,以HPLC法测定大鼠血浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的质量浓度,以Kinetica软件拟合药动学参数.结果 蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分离,重现性、精密度、线性关系良好,达到体内分析要求；经非房室模型拟合,得到蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基在大鼠体内主要药动学参数；iv给药30 min时,血药浓度均降至Cmax的1/5以下.结论 建立的蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基血药浓度测定方法操作简单、结果准确可靠；蟾蜍甾烯类成分在大鼠体内代谢较为迅速,所得数据可为蟾酥提取物的药动学研究提供参考.
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血栓心脉宁片UPLC-PDA指纹图谱研究
目的 建立血栓心脉宁片(XXT)的UPLC-PDA指纹图谱,考察不同批次XXT质量的一致性,为XXT质量稳定性提供可靠的科学依据.方法 样品经甲醇提取,采用Waters Acquity UPLC HSS T3(50 mm×2.1 mm,1.8μm)色谱柱,以乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,190～400 um波长扫描,体积流量0.5 mL/min,进样量3μL,柱温40℃;对30批XXT样品进行方法学考察、相似度计算和聚类分析;单味药材进行共有峰归属,并通过对照品对共有峰的化学成分进行指认.结果 建立了XXT UPLC-PDA指纹图谱,280 nm波长下标定28个共有峰,其中1、10、12～16、18、21～28号峰来自丹参,2～4、6、8、9、17号峰来自川芎,3、7、9、11、16号峰来自毛冬青、5号峰来自槐花,19、20号峰来自蟾酥,经对照品比对指认出4号峰为阿魏酸、5号峰为芦丁、13号峰为丹酚酸B、19号峰为酯蟾毒配基、20号峰为华蟾酥毒基、28号峰为丹参酮ⅡA;通过聚类分析30批XXT可分为2类,经中药色谱指纹图谱评价软件(2012版)计算得30批XXT相似度均大于0.960.结论 建立的XXT UPLC-PDA指纹图谱具有良好的精密度、稳定性和重复性,方法简便可靠,可为进一步完善XXT的质量评价提供参考依据.
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RP -HPLC法同时测定蟾麝救心滴丸中蟾酥华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量
目的 建立采用RP-HPLC法同时测定蟾麝救心滴丸中蟾酥华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法. 方法 采用反相HPLC法测定华蟾酥毒基、酯蟾毒配基的含量,C18色谱柱;流动相:乙腈-水,梯度洗脱(0→25 min,56∶ 44;26→44 min,0∶ 100;45→50 min,56∶ 44,V/V),流速:1.0 ml/min,检测波长为296 nm,柱温为35 ℃. 结果 华蟾酥毒基在0.211 8-2.118 μg范围内呈现良好的线性关系(r=0.999 7),平均回收率为99.49%,RSD值为1.2%(n=6);酯蟾毒配基在0.201 2-2.012 μg范围内,呈现良好的线性关系(r=0.999 6),平均回收率为99.97%,RSD值为1.7%(n=6). 结论 RP-HPLC法简便可行、准确、重现性好,可作为蟾麝救心滴丸中蟾酥华蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量测定方法.
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RP-HPLC法测定华蟾素片中华蟾毒配基、酯蟾毒配基的含量
目的:建立华蟾素片中华蟾毒配基、酯蟾毒配基的含量测定方法.方法:采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),使用ZORBAX Eclipse XDB C18柱,乙腈:0.5%KH2PO4溶液(40:60)为流动相,检测波长:296nm.结果:此方法线性关系良好,华蟾毒配基的平均加样回收率为98.42%,RSD为0.82%.酯蟾毒配基的平均加样回收率为99.10%,RSD为2.29%.结论:方法简便快速,分离度好,结果稳定,可用于华蟾素片的质量控制.
