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华蟾毒配基抑制组蛋白乙酰化诱导肝癌细胞死亡的机制
目的 探讨华蟾毒配基通过改变表观遗传修饰调控肝癌细胞死亡的机制.方法 通过CCK-8法检测不同浓度(0、0.75、1.5、2.5、5、10 μmol/L)华蟾毒配基作用于肝癌HepG2细胞24 h细胞增殖能力的变化;5μmol/L华蟾毒配基作用HepG2细胞12、24 h后,流式细胞术检测细胞周期,蛋白印迹检测钙/钙调素依赖蛋白激酶2β(CaMK2B)、甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)、磷酸化MeCP2(p-MeCP2)、乙酰化组蛋白H3.1 (Ac-Histone3.1)和甲基化组蛋白(Met-Histone3.1)的表达变化;5μmol/L华蟾毒配基作用HepG2细胞24 h后,细胞免疫荧光结合扫描共聚焦检测CaMK2B和MeCP2相互作用.结果 华蟾毒配基能显著抑制肝癌HepG2细胞生长,抑制效果呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P＜0.05),药物作用细胞后,细胞周期发生G2/M期阻滞,差异有统计学意义(P＜0.05).5μmol/L华蟾毒配基可促进CaMK2B和MeCP2在细胞核内结合,Western blot结果显示华蟾毒配基作用HepG2细胞后上调CaMK2B和p-MeCP2表达(P＜0.05),抑制Ac-Histone3.1表达,促进Met-Histone3.1 (P＜0.05).结论 华蟾毒配基通过激活CaMK2B-MeCP2信号通路抑制组蛋白乙酰化、促进甲基化继而诱导肝癌细胞死亡.
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高效液相色谱法测定心可宁胶囊中华蟾毒配基的含量
目的:建立高效液相色谱法测定心可宁胶囊中华蟾毒配基的方法.方法:采用Zorbax ODS(250mm×4.6mm,5μm)为色谱柱,以甲醇:水(75:25)为流动相,流速:0.5ml·min-1,紫外检测器波长:296nm,用索氏提取器提取心可宁胶囊中的华蟾毒配基.结果:华蟾毒配基的浓度在(0.02 725～0.13625)μg·ml-1(r=0.9994,n=5)范围内线性关系良好,平均回收率为99.07%.结论:本方法操作简便、精密度好、回收率高、稳定可靠,适用于心可宁胶囊的质量控制.
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蟾五草组分散组方筛选及体外药效作用
[目的]筛选对蟾皮华蟾毒配基组分增效减毒的配伍药物并考察该方剂体外对肿瘤细胞及正常细胞的活性影响.[方法]利用析因设计(24)和正交设计L(9 34)优化蟾皮华蟾毒配基组分、五味子组分、黄芪组分和甘草酸之间的配伍关系.利用细胞增殖与毒性检测(CCK-8)法检测该方剂对SW620、L02、人细胞因子诱导性杀伤T细胞(CIK细胞)在不同时间点的细胞存活率,并进一步考察其对L02细胞释放丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的影响.[结果]析因设计确定了4种药物间有交互效应并确定本方剂由4种药味组成;正交设计进一步优选出配伍剂量:蟾皮华蟾毒配基组分2 μg/mL,五味子组分10 μg/mL,黄芪组分5 μg/mL,甘草酸10 μg/mL.组方完成后将该方剂命名蟾五草组分散.与蟾皮华蟾毒配基组分相比,蟾五草组分散能降低SW620细胞存活率,而增加L02、CIK细胞存活率;另外,能降低L02细胞释放ALT.[结论]配伍合理的蟾五草组分散实现了对蟾皮华蟾毒配基组分的增效减毒.
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蟾酥活性成分下调极光激酶表达并促进肝癌细胞周期阻滞的机制研究
目的 探讨极光激酶(AURK)在肝癌中的作用,以及蟾酥活性成分华蟾毒配基和蟾蜍灵下调AURK表达和抑制肝癌HepG2细胞增殖的机制.方法 Kaplan-Meier生存函数法分析极光激酶A(AURKA)和极光激酶B(AURKB)mRNA表达水平与肝癌患者生存期的关系;MTT法检测HepG2细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期变化,蛋白免疫印迹法检测AURKA、AURKB、Xklp2靶向蛋白(TPX2)、染色体结构维持蛋白2(SMC2)、DNA拓扑异构酶2(TOP2A)和细胞周期蛋白依赖性激酶1 (CDK1)的表达水平.结果 Kaplan-Meier生存分析显示AURKA和AURKB mRNA表达水平与肝癌患者生存期呈现显著负相关;华蟾毒配基和蟾蜍灵可抑制HepG2细胞生长,抑制效应呈现时间和浓度依赖性;华蟾毒配基和蟾蜍灵均引起细胞周期G2/M期阻滞,下调AURKA、AURKB、TPX2、SMC2、TOP2A和CDK1蛋白表达(P＜0.05).结论 AURKA和AURKB mRNA表达水平与患者生存期呈现显著负相关.华蟾毒配基和蟾蜍灵能有效促使AURKA和AURKB表达下调,调控有丝分裂相关分子,引起HepG2细胞周期阻滞,从而抑制其增殖.
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华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响
目的 研究华蟾毒配基联合索拉非尼对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响及作用机制.方法 MTT法检测Huh7细胞增殖;Hoechst33342/PI荧光双染法检测Huh7细胞凋亡形态变化;流式细胞仪检测细胞周期;免疫细胞化学法检测Ki67蛋白表达;Western blotting法检测Bax、Bcl-2、Caspase-8、极光激酶A(AURKA)、Ras、Raf、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p-ERK蛋白的表达变化.结果 华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药对Huh7细胞的增殖均有抑制作用,联合用药组的增殖抑制作用更明显,具有协同效应;荧光染色可见细胞凋亡形态变化;索拉非尼引起Huh7细胞周期S期阻滞,华蟾毒配基和联合用药引起Huh7细胞周期GE/M期阻滞,联合用药组G2/M期阻滞较单药组更明显;华蟾毒配基和索拉非尼均能减弱Ki67表达,联合用药组的作用更为显著;华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药上调Bax和Caspase-8蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax/Bcl-2比例,对ERK蛋白表达无明显影响,显著下调AURKA、Ras、Raf和p-ERK蛋白表达,联合用药组的作用更为显著(P＜0.05).结论 华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路抑制肝癌Huh7细胞增殖,诱导其凋亡.
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RP-HPLC法测定梅花点舌丸中脂蟾毒配基、华蟾毒配基的含量
目的建立梅花点舌丸中脂蟾毒配基、华蟾毒配基的含量测定方法.方法采用反相高效液相色谱法,使用C18柱,乙腈-0.5%KH2PO4溶液(50:50)为流动相,检测波长:296 nm.结果此方法线性关系良好,脂蟾毒配基的平均加样回收率为97.40%,RSD为2.22%.华蟾毒配基的平均加样回收率为97.78%,RSD为2.63%.结论方法简便、可靠,分离度较好,结果稳定,可用于梅花点舌丸的质量控制.
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大鼠舌下静脉给药华蟾毒配基的药动学研究
目的 建立华蟾毒配基在大鼠体内的血药浓度的HPLC测定方法,并根据血药浓度-时间数据计算其体内药动学参数.方法 经舌下静脉分别注射0.251、0.503、1.006 mg/kg华蟾毒配基,采用RP-HPLC法测定血清中药物浓度,用3P87药动学软件计算药动学参数.结果 华蟾毒配基在大鼠体内的动力学过程可用一级动力学过程的二室开放型模型来描述.高、中、低3个不同剂量组的主要药动学参数分别为:t1/2α:0.483 0、0.377 7、0.272 3 h;t1/2β:4.418 9、5.897 2、2.468 2 h;V(c):2.512 0、8.660 6、27.937 8 L/kg;AUC:12.197 0、8.412 3、2.9056μg/(h·mL);CL:2.049 7、5.943 7、34.416 6 L/(kg·h).结论 本研究建立的RP-HPLC测定大鼠静脉注射不同剂量华蟾毒配基后血药浓度的实验方法简便、快速、灵敏,血清中内源性物质不干扰测定,可为华蟾毒配基临床安全合理用药和制剂质量控制提供依据.
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蟾皮华蟾毒配基组分体外对肿瘤及正常细胞株的抑制作用
[目的]测定蟾皮第18组分(F18)的化学成分并考察其体外对不同细胞株的抑制作用.[方法]通过质谱法对已分离的F18进行测定,采用噻唑蓝法(MTT法)检测F18对人SW480、SW620、BGC823肿瘤细胞株、人L02、CIK正常细胞株及鼠C26、CT26、4T1肿瘤细胞株的抑制作用,CCK-8法检测F18对SW620、L02、CIK在不同时间点的细胞存活率,后流式细胞术检测F18对SW620细胞周期的影响.[结果]经鉴定蟾皮F18的主要成分为华蟾毒配基,故将蟾皮F18命名蟾皮华蟾毒配基组分(CFSB).CFSB对SW480、SW620、BGC823、L02、CIK、C26、CT26、4T1细胞的IC50值分别为1.10、1.15、1.55、4.85、2.63、21.22、31.39、20.75 mg/L,对SW620、L02、CIK细胞存活率呈时间依赖性.流式细胞术测定浓度在2 mg/L的CFSB干预SW620细胞24 h后其S期、G2/M期细胞比例分别由36.41%增至55.73%、10.89%增至16.95%.[结论]CFSB对肿瘤细胞和正常细胞的增殖均有抑制作用,可使SW620细胞周期阻滞在S期和G2/M期.
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蟾酥及其有效成分的药理作用及机制研究进展
蟾酥(chan su)为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液,经加工干燥制成.蟾酥含有多种化学成分,具有强心、升压、镇痛以及抗肿瘤等多种药理活性,临床应用广泛,现已突破传统用法,将其制成口服液、注射剂、涂膜剂、微丸剂及微球、脂质体、β-环糊精包合物、透皮给药系统等应用到临床各科中.现将近十年来蟾酥及其有效成分的药理作用等方面的研究综述如下.
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RP-HPLC法测定华蟾素片中华蟾毒配基、酯蟾毒配基的含量
目的:建立华蟾素片中华蟾毒配基、酯蟾毒配基的含量测定方法.方法:采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC),使用ZORBAX Eclipse XDB C18柱,乙腈:0.5%KH2PO4溶液(40:60)为流动相,检测波长:296nm.结果:此方法线性关系良好,华蟾毒配基的平均加样回收率为98.42%,RSD为0.82%.酯蟾毒配基的平均加样回收率为99.10%,RSD为2.29%.结论:方法简便快速,分离度好,结果稳定,可用于华蟾素片的质量控制.
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蟾酥活性成分协调索拉非尼通过下调Akt/NF-κB信号途径抑制肝癌HepG2细胞生长
目的 探讨蟾酥活性成分蟾蜍灵和华蟾毒配基协调索拉非尼抑制肝癌HepG2细胞生长的机制.方法 MTT法检测HepG2细胞经药物作用12、24、48 h后的增殖活性;Hoechst 33342荧光染色检测细胞形态学变化;流式细胞仪检测药物对HepG2细胞周期的影响;Western blot检测Akt、p-Akt(Ser473)、IκB、NF-κB、p-NF-κB p65、Bcl-2、Bax、cyclin A、PC-NA蛋白表达水平.结果 蟾蜍灵、华蟾毒配基和索拉非尼作用组均能抑制HepG2细胞增殖,且药物联合作用组的增殖抑制率明显高于单独药物作用组,呈时间依赖性,用金氏公式得出在24 h具有协同作用(P＜0.01);荧光染色结果显示,HepG2细胞经药物处理24 h后,细胞呈现出核染色质凝集的凋亡形态特征;细胞周期检测结果显示,索拉非尼作用组使细胞周期阻滞于G0/G1期(P＜0.01),蟾蜍灵、华蟾毒配基作用组使细胞周期阻滞于S期(P＜0.01),药物联合作用组使细胞周期阻滞于S期(P＜0.01);Westem blot结果显示,蟾蜍灵、华蟾毒配基和索拉非尼单独药物作用组和联合作用组Akt、NF-κB总蛋白表达均无明显变化,p-Akt(Ser473)、p-NF-κB p65、Bcl-2、cyclin A、PCNA蛋白表达水平逐渐降低,联合作用组比单独药物作用组降低更为明显(P＜0.01).IκB、Bax蛋白表达水平逐渐升高,联合作用组比单独药物作用组升高更加明显(P＜0.01).结论 蟾酥活性成分蟾蜍灵和华蟾毒配基协调索拉非尼通过下调Akt/NF-κB信号通路,抑制肝癌HepG2细胞增殖.
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钠钾ATP酶抑制剂通过调节DNA损伤感应复合体Mre11/Rad50/Nbs1的表达诱导肝癌HepG2细胞周期阻滞
目的：研究钠钾ATP酶抑制剂华蟾毒配基( cinobufa-gin)对人肝癌 HepG2细胞 DNA损伤修复阻断及其发生机制。方法免疫组化分析人肝癌临床组织标本、正常肝组织中钠钾ATP酶α1亚单位的表达；以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,实验分为对照组、5μmol · L-1华蟾毒配基作用6、12和24 h组；单细胞电泳检测 DNA双链断裂, Real time-PCR和Western blot检测损伤修复基因Mre11、Rad50、Nbs1和p53的表达变化,流式细胞术检测细胞周期。结果肝癌组织钠钾ATP酶α1亚单位表达与癌旁组织相比明显升高( P <0．05)；华蟾毒配基诱导HepG2细胞DNA断裂的发生率与作用时间高度相关,作用时间延长断裂效应更加明显(P<0．05),Mre11,Nbs1,Rad50和p53表达随药物作用时间延长逐渐升高(P<0．05),流式细胞术分析细胞周期对照组S期细胞比例为(21．32±4．21)%,5μmol·L-1华蟾毒配基处理6 h 后为(33．25±5．72)%,处理12 h 后为(56．72±6．29)%,作用24 h后为(67．32±9．42)%。结论华蟾毒配基激活 Mre11/Rad50/Nbs1损伤感应复合体介导肝癌HepG2细胞周期阻滞。
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钠钾泵抑制剂通过调节细胞周期相关蛋白的生成介导肝癌HepG2细胞周期S期阻滞与凋亡
目的 研究钠泵抑制剂哇巴因(ouabain)和华蟾毒配基(cinobufogenin)对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用及细胞周期的改变,初步分析其机制.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,MTT比色法检测哇巴因和华蟾毒配基对HepG2细胞增殖的影响;Hoechst 33342荧光染色检测细胞形态学变化;流式细胞术检测细胞周期;实时定量PCR和Western blot检测CyclinA1、CDK2、PCNA和p21~(CIP1)表达的变化.结果 哇巴因和华蟾毒配基可明显抑制HepG2细胞增殖,抑制作用呈时间-浓度依赖性.荧光染色显示药物处理24 h后,细胞呈现典型的凋亡形态特征;细胞周期分析显示,实验组S期细胞比例升高,实时定量PCR和Western blot结果显示:哇巴因和华蟾毒配基可下调CyclinA1、CDK2和PCNA的表达(P<0.05),上调p21~(CIP1)的表达(P<0.05).结论 钠泵抑制剂可抑制肝癌HepG2细胞的增殖,引起细胞周期S期阻滞,诱导细胞凋亡,这与其调节细胞周期相关蛋白的生成关系密切.
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RP-HPLC法测定梅花点舌丸中酯蟾毒配基和华蟾毒配基的含量
目的:建立梅花点舌丸中酯蟾毒配基、华蟾毒配基的含量测定方法.方法:采用反相高效液相色谱法,使用C18柱,乙腈-0.5%KH2PO4溶液(50:50)为流动相,检测波长:296 nm.结果:线性关系良好,酯蟾毒配基的平均加样回收率为97.4%,RSD为2.3%.华蟾毒配基的平均加样回收率为97.8%,RSD为2.7%.结论:方法简便可靠,分离度较好,结果稳定,可用于梅花点舌丸的质量控制.
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反相高效液相色谱法测定梅花点舌丸中酯蟾毒配基、华蟾毒配基的含量
目的:建立测定梅花点舌丸中酯蟾毒配基、华蟾毒配基的反相高效液相色谱法.方法:采用KromasilC18柱,流动相为乙腈∶0.5%KH2PO4溶液(50∶50),检测波长为296nm.结果:该方法线形关系良好,酯蟾毒配基的平均加样回收率为97.40%,RSD为2.2%;华蟾毒配基的平均加样回收率为97.78%,RSD为2.6%.结论:方法简便可靠,分离度较好,可用于梅花点舌丸的质量控制.
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毒性中药蟾酥质量检测方法研究
目的:建立蟾蜍中多种药效及毒性成分蟾蜍毒素的定性定量检测方法.方法:采用液相色谱-质谱/质谱联用方法检测蟾酥中多种蟾蜍毒素成分.结果:建立了华蟾毒它灵、蟾蜍灵、华蟾毒配基及脂蟾毒配基的LC-MS/MS检测方法.比较了蟾酥样本的液相色谱-质谱/质谱联用分析数据.对4个不同来源中华大蟾蜍及黑眶蟾蜍的蟾酥样本进行检测,检出华蟾毒它灵、蟾蜍灵、华蟾毒配基及脂蟾毒配基的含量范围为0.05%～5.12%(w/w).结论:液相色谱-质谱/质谱联用方法可用于蟾酥足性定量检测,并为质量评价提供参考.
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蟾酥提取物华蟾毒配基和蟾毒灵含量测定
目的:研究蟾毒灵和华蟾毒配基在蟾蜍中的含量,建立相关的高效液相测定方法.方法:从中华大蟾蜍(Bufobufogargarizanscantor)蟾酥片中提取有效成分蟾毒灵和华蟾毒配基,通过高效液相测定其在蟾蜍中的含量.结果:蟾毒灵和华蟾毒配基两者的RSD值均小于3%,符合要求.
