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DSB修复基因hKu70反义RNA真核表达载体构建
目的构建人DNA双链断裂(DSB)修复基因hKu70反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K,为以后的hKu70基因功能和毒理学研究提供实验材料.方法提取人胚肺成纤维细胞(HLF)总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增hKu70基因cDNA保守序列,经与pGEM-T载体连接、筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的hKu70基因cDNA保守序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K.结果经RT-PCR获得467 bp含限制性内切酶位点的DNA片段,T载体克隆后经双酶切、测序,确定该片段为hKu70基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K,并双酶切,测序确证.结论成功构建hKu70基因反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-K,为建立该基因低表达细胞株、DNA双链断裂修复缺陷和有关毒理学研究提供工具.
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大鼠外周血淋巴细胞和脾淋巴细胞HPRT基因突变的比较
目的克隆法研究放射性核素内照射诱发大鼠体细胞HPRT基因突变,比较不同体细胞HPRT基因突变频率.
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γ-H2AX与DNA双链断裂关系的研究进展
H2AX是组蛋白的一个种类,普遍存在于整个基因组中.据报道,DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸-139位C-端保守区域内的H2AX磷酸化形成γ-H2AX,在荧光显微镜下形成可见的γ-H2AX焦点.用特异性抗体的免疫荧光法检测γ-H2AX已成为测定DSB的金标准.目前,多种物理性、化学性和生物性的因素都能诱导形成γ-H2AX焦点.本文综述了不同因素诱导形成γ-H2AX的机制及其与DNA双链断裂之间的关系的研究进展.
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DNA双链断裂修复基因多态与肺癌易感性研究进展
DNA双链断裂(double-strand breaks,DSBs)是严重的DNA损伤,可导致基因组不稳定和肿瘤.DNA双链断裂修复基因多态性能改变DNA损伤的修复能力,影响肺癌的易感性.本文就xrcc2、xrcc3、xrcc4、rad,brca1和brca2基因的结构、功能和与肺癌的易感性关系作一综述.
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DNA双链断裂损伤修复系统研究进展
多种内源或外源因素都能造成细胞基因组DNA损伤,细胞内建立了复杂的修复系统来应对不同形式的损伤.其中DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSBs)作为严重的损伤形式,主要激活同源重组修复(Homologous recombination repair)和非同源末端连接(Non-homologous end joining)通路.这两条通路都是由多个修复元件参与、经过多步反应的复杂过程.两者各具特点、协同作用,共同维护细胞基因组的稳定性.对其分子机制的阐明为肿瘤放化疗的辅助治疗提供了潜在的作用靶点.
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hMRE11在依托泊甙所致U937细胞DNA双链断裂后的修复中发挥重要作用
MRE11在DNA损伤反应的信号转导通路中起着重要的作用.本研究查明hMRE11与依托泊甙所致人单核细胞白血病细胞株U937 DNA双链断裂的关系.在依托泊甙(VP-16)处理U937细胞后,运用脉冲凝胶电泳(PFGE)检测DNA双链断裂,采用RT-PCR技术检测MRE11的转录水平,借助免疫荧光技术检测hMRE11蛋白的分布改变,并通过流式细胞术检测其细胞周期.结果表明:VP-16诱导U937细胞DNA双链断裂的发生率与其剂量高度相关,从2μg/ml时的(13.0±2.3)%增至20μg/ml时的(32.0±4.3)%(P＜0.01).但VP-16诱导U937细胞前后不同时间内hMRE11 mRNA水平未见变化(P＞0.05).hMRE11蛋白丰富而均匀分布于核仁外的细胞核中,但经VP-16处理后则形成独立的核灶(nuclear focus),并且存在这种核灶的细胞数和细胞中的核灶数量随VP-16的剂量增加而增多.经100μg/ml VP-16处理(2小时)后8小时形成hMRE11蛋白灶的U937细胞数达到(61.54±3.6)%[对照组为(0.47±1.17)%,P＜0.01],而且47.55±2.35%的U937细胞[对照组(21.95±2.91)%,P＜0.05]停滞于S期,然后逐渐下降.结论:hMRE11蛋白核灶形成可能参与VP-16所致人单核白血病细胞株U937的DNA损伤修复过程.
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Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症易感基因UNC13D参与同源重组修复
本研究从DNA双链断裂同源重组修复角度探讨UNC13D(秀丽新小杆线虫)基因参与Ⅲ型家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 3,FHL3)的发病机制.利用DNA同源重组修复方法,检测正常对照组及UNC13D基因下调后DR-U2OS细胞同源重组修复率的变化情况,并研究此基因的相关功能.结果表明:下调DR-U2OS细胞的UNC13D基因表达后,同源重组修复率较正常对照组明显下降,且差异有统计学意义(P＜0.05),提示UNC13D编码蛋白Munc13-4不仅参与到细胞毒颗粒的胞吐过程中,而且在DNA双链断裂修复中也起作用.结论:UNC13D基因突变可能通过抑制细胞毒颗粒的胞吐和降低DNA双链断裂后的同源重组修复率参与FHL3发病过程,这一研究结果为揭示FHL3的发病机制提供新的理论基础.
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脑缺血/再灌注后神经元Ku蛋白的表达与DNA双链损伤的变化
目的:探讨脑缺血/再灌注后早期神经元Ku蛋白的表达与DNA双链损伤的变化及其与神经元转归的关系.方法:56只大鼠随机分为脑缺血/再灌注组(大脑中动脉线栓法制备缺血/再灌注模型)和假手术组,分别于术后1、6、12、24、48、72 h 6个时相点取脑组织,免疫组化法测定缺血/再灌注区Ku异二聚体的成分之一Ku70的表达,原位末端标记法(TUNEL法)观察脑缺血/再灌注后不同时相点缺血/再灌注区神经元DNA双链损伤的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测缺血/再灌注区细胞凋亡.结果:脑缺血/再灌注1 h时,缺血侧Ku70阳性细胞数即开始减少,缺血/再灌注24 h降至低水平;缺血/再灌注6 h,缺血区TUNEL细胞数量开始升高,于24 hTUNEL阳性细胞数均达到高峰,其后逐渐减少;24 h后细胞DNA琼脂糖凝胶电泳始见凋亡特有的阶梯状(Ladder)条带.结论:脑缺血/再灌注早期,神经元Ku蛋白表达下降,可能是导致双链断裂的DNA无法得到修复造成神经元DNA不可逆性损伤,进而引起神经元死亡的原因.
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人骨肉瘤细胞DNA双链断裂修复γH2AX分析
目的:探讨人骨肉瘤细胞U2OS中利用γH2AX分析评价细胞DNA双链断裂(DNA Double-Strand Breaks,DS-Bs)损伤反应动力学过程.方法:用免疫荧光和蛋白质印迹法结合DNA损伤应答通路抑制剂及siRNA基因沉默技术分析U2OS细胞在遭受DSBs损伤处理前后γH2AX foci和其表达水平的动力学变化,并通过流式细胞术定量分析γH2AX的变化情况.结果:在细胞未经损伤处理时,U2OS细胞仅有极少量的γH2AX foci,而在遭受电离辐射(ionizingradiation,IR)后,γH2AX在损伤部位的募集和表达水平快速升高,1h内达峰值,该过程可被ATM抑制剂和磷酸肌醇激酶3相关激酶抑制剂Wortmannin抑制;而后随着时间的推移,γH2AX表达又逐渐消退,反映了细胞DSBs损伤应答的动力学过程.利用小分子RNA敲除参与DSBs损伤修复的关键因子Mre11表达的细胞及对照siRNA转染细胞,IR处理4h后γH2AXfoci数分别为31.68±4.59和21.33±2.08,处理8h分别为21.85±2.49和12.02±4.13,处理12h分别为19.65±2.34和8.51±2.17),处理16 h分别为18.05±1.75和6.94±3.19,各时间点Mre11沉默组细胞的γH2AXfoci数显著多于对照siRNA处理组细胞,P=0.013,反映了延长的DSBs损伤修复动力学(减缓的γH2AXfoci消退).经γH2AX和PI双染色流式细胞术发现,不同细胞分期γH2AX阳性率差异有统计学意义,G1期细胞在IR处理前为(1.34±0.28)％,处理后为(20.25±3.56)％,P＜0.001;S期细胞在IR处理前为(1.26±0.19)％,处理后为(79.48±5.72)％,P＜0.001;G2/M期细胞在IR处理前为(8.84±1.25)％处理后为(29.49±4.36)％,P＜0.001.结论:γH2AX分析可有效分析U2OS细胞的DSBs损伤应答反应动力学,U2OS细胞具有低γH2AX背景、易于传代培养等优点,可作为研究细胞DSBs损伤应答反应的模式细胞.
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鼻咽癌组织DNA-PKcs和BRCA1蛋白表达临床意义分析
目的:研究鼻咽癌组织中DNA依赖蛋白激酶催化亚基(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)和乳腺癌基因1 (breast cancer 1,BRCA1)的蛋白表达及其临床意义.方法:收集2007-05-07-2011-11-23广西壮族自治区人民医院病理学确诊为鼻咽癌且应用调强放射治疗(intensity modulated radiation therapy,IMRT)的患者71例.采用免疫组化SP法检测71例患者中DNA-PKcs及BRCA1在鼻咽癌组织中的表达.阳性细胞计数≥50％分别定义为DNA-PKcs或BRCA1高表达组;阳性细胞计数＜50％及不表达者分别定义为DNA-PKcs或BRCA1低表达组.并结合其临床资料,分析2种蛋白的表达与患者的急性放射反应、临床分期、肿瘤消退及生存时间的关系.结果:DNA-PKcs的表达与患者的AJCC分期(P=0.560)、皮肤(P=0.314)、黏膜(P=0.509)、涎腺急性放射损伤(P=0.403)及肿瘤消退情况(P=0.480)无显著相关性.BRCA1的表达与患者的AJCC分期(P=0.537)、皮肤(P=0.943)、黏膜(P=0.466)、涎腺急性放射损伤(P=0.651)及肿瘤消退情况(P=0.540)无显著相关性.DNA-PKcs表达与患者的生存时间呈正相关,r=0.234,P=0.048.结论:鼻咽癌组织中DNA-PKcs和BRCA1的表达与患者的临床分期、放射性损伤以及肿瘤的消退情况无关.DNA-PKcs低表达可能成为预测鼻咽癌患者预后较差的一个指标.
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小鼠DNA双链断裂修复缺陷细胞的γ射线剂量率效应
目的探讨γ射线照射后小鼠DNA双链断裂修复缺陷细胞(SCID)的剂量率效应和潜在致死性损伤的修复.方法采用低剂量率和高剂量率以及间隔24h的2次γ射线照射正常细胞(CB.17+/+)和SCID细胞,通过成克隆分析法观察被照射细胞的存活分数.结果应用间隔24h的2次γ射线照射CB.17+/+细胞时,其存活分数明显高于相同剂量的单次照射,而SCID细胞二者无明显差异.在高剂量率单次和2次γ射线照射时,SCID细胞均比CB.17+/+细胞更敏感.在低剂量率γ射线照射时,SCID细胞亦显示比CB.17+/+细胞更敏感.低剂量率γ射线照射CB.17+/+细胞和SCID细胞后,二者的存活分数均明显高于高剂量率照射.结论 SCID细胞不具有DNA双链断裂的修复能力.SCID细胞和CB.17+/+细胞均具有剂量率效应.
关键词： DNA双链断裂 剂量率效应 DNA双链断裂修复缺陷细胞系 纤维母细胞系 -
Ku70蛋白在鼻咽癌中的表达及其临床意义
目的 探讨Ku70在鼻咽癌中的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化SP法检测223例鼻咽癌石蜡标本中Ku70的表达情况,根据免疫反应强弱将其分为高表达和低表达两组(阴性表达归入低表达组),并结合临床资料分析Ku70表达高低与患者的临床病理特征及预后的关系.结果 Ku70在鼻咽癌组织中的高表达率为63.7%.单因素生存分析显示Ku70高表达组总生存率低于低表达组(x2=7.88,P=0.005),多因素分析显示性别、年龄、病理分型不是预后独立影响因素(x2=0.08、1.04、2.34,P=0.780、0.308、0.126),T、N、M分期是预后独立影响因素(x2=8.02、7.22、36.86,P=0.005、0.007、0.000),Ku70对鼻咽癌预后的独立影响接近临界值(x2=2.94,P=0.085).结论 初步研究发现Ku70对评价鼻咽痛的预后有参考价值,对患者预后的判断有一定的指导意义.
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宫颈癌组织ATM和DNA-PKcs表达与放疗敏感性及预后关系研究
放射线是通过导致细胞DNA双链断裂(DNA-double strand breaks,DSB)来起到杀死肿瘤细胞的作用,细胞被照射后DNA损伤修复能力是影响肿瘤放射敏感性的主要因素.笔者选择DSB修复通路中毛细血管扩张性共济失调症突变(ataxia telangiectasia mutated,ATM)、DNA依赖蛋白激酶催化亚单位(DNA dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs)两个主要蛋白分析在不同放疗敏感性宫颈癌中的表达差异,初步探明其与宫颈癌放疗敏感性的关系.
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蛋白激酶CK2抑制剂对H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂影响
目的：观察蛋白激酶CK2抑制剂对人肺癌细胞系H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂损伤的影响。方法使用终浓度为0、12?5、25?0、50?0μmol／L的蛋白激酶CK2抑制剂醌茜素分别作用H460细胞24 h，检测CK2各亚基蛋白及mRNA水平变化。不同浓度梯度醌茜素作用4、24 h后，采用流式细胞仪检测H460细胞内活性氧水平变化。通过免疫荧光法检测CK2抑制剂对H460细胞γ?H2 AX表达的影响，并计算细胞内γ?H2 AX焦点的平均值。采用方差分析和t检验。结果醌茜素对H460细胞 CK2各亚基蛋白或 mRNA 水平无明显影响（ CK2α，0μmol ∶12?5μmol／L， P＝0?966；0μmol／L ∶25μmol／L，P＝0?355；0μmol／L ∶50μmol／L，P＝0?864， CK2α’，0μmol／L ∶12?5μmol／L，P＝0?409；0μmol／L ∶25μmol／L， P＝0?833；0μmol／L ∶50μmol／L， P＝0?0．746， CK2β，0μmol／L ∶12?5μmol／L， P＝0?532；0μmol／L ∶25μmol／L， P＝0?830；0μmol／L ∶50μmol／L， P＝0?061）。随着醌茜素浓度增加及作用时间延长，H460细胞内活性氧水平明显升高。不同浓度醌茜素可增加细胞内γ?H2 AX焦点数，并呈剂量和时间依赖性（醌茜素作用时间4 h或24 h，0μmol／L ∶12?5μmol／L，12?5μmol／L ∶25μmol／L，25μmol／L ∶50μmol／L，P均＝0?000，浓度为12?5μmol／L，25μmol／L或50μmol／L，4 h ∶24 h，P均＝0?000）。结论醌茜素可通过抑制蛋白激酶CK2活性增加肺癌H460细胞内活性氧水平及DNA双链断裂损伤，该研究为醌茜素作为一种有潜力的肺癌放射增敏剂提供了理论基础。
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鼠脑缺血神经元DNA单链断裂和双链断裂的比较性研究
目的研究类缺血再灌注不同时间点神经元DNA单链和双链断裂的损伤情况.判断早期DNA损伤形式并讨论其意义.方法以培养的皮质神经元类缺血再灌注模型,采用TUNEL法和Klenow法对缺血再灌注各时间点培养的神经元进行检测,并应用图像分析仪对Klenow法检测结果进行平均灰度检测.结果 TUNEL法检测发现,未经缺血处理的对照组神经元阳性细胞比率为(10.5±1.29)%,随缺血时间延长,其阳性细胞比率明显增加,在6 h时阳性细胞数达高峰[(86.5±4.72)%];Klenow法检测发现,未经缺血处理的对照组神经元平均灰度为72.4±1.00,在2 h达高峰为135.5±1.3l,之后又逐渐降低.结论在培养的皮质神经元缺血再灌注模型中发现,DNA早期损伤以DNA单链断裂为主,大约在再灌注2 h达高峰,再灌注6 h则为DNA双链断裂的高峰.
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DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射敏感性研究
目的 了解不同组织来源癌细胞株和人体肿瘤组织原代细胞的DNA双链断裂损伤修复的个体差异性,探寻预测癌细胞辐射敏感性的生物指标.方法 60Coγ射线照射诱发DNA损伤,脉冲电场凝胶电泳检测DNA双链断裂损伤修复,细胞克隆形成能力法检测细胞辐射敏感性.结果 8个不同组织来源癌细胞株的辐射敏感性有较大的差异(D0为0.65～2.15 Gy),不同细胞株20 Gyγ射线照射诱发产生的DNA双链断裂原初损伤有一定的差别,但与细胞辐射抗性无相关性.辐射敏感细胞SX-10的DNA双链断裂修复缺陷发生在早期快速修复相,而A2780细胞的修复缺陷是发生在晚期慢速修复相.20 Gy照射修复2 h后DNA双链断裂残留量与细胞辐射敏感性指标D0或SF2值有显著的相关性.不同个体患者脑肿瘤组织原代细胞之间,辐射诱发DNA双链断裂的修复反应存在明显差异,修复2 h后残留损伤的个体差异性分布类似于癌细胞株.结论 DNA双链断裂残留损伤与癌细胞辐射抗性有显著相关性,可作生物指标预测肿瘤组织细胞对放射治疗的反应性.
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X线照射后A549肺癌细胞Ku80 mRNA及其蛋白表达的变化
Ku蛋白参与放射损伤修复,并与肿瘤的放射耐受密切相关[1-3].非小细胞肺癌尤其是肺腺癌细胞对射线不敏感.作为DNA损伤修复的主要成分之一,Ku蛋白在细胞受到照射后其含量是相对恒定,还是代偿性增加以对放射所致的DNA双链断裂进行修复,有关这个问题目前还鲜有报道.
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淋巴细胞DNA双链断裂用于放射损伤检测的可行性研究
目的探讨受照后淋巴细胞DNA双链断裂和凋亡作为放射损伤生物学检测指标的可行性.方法采用pH值中性彗星电泳方法,检测人外周血离体照射0.1～4 Gy后6 h和24 h淋巴细胞彗星率和彗星尾长,并观察其量效关系.结果照后6 h和24 h彗星率呈剂量依赖性上升,反应剂量阈值分别为0.6 Gy和0.1 Gy,r分别为0.967和0.927;照后6 h彗星尾长亦呈剂量依赖性上升,r为0.847.结论中性彗星电泳法结果提示在照射剂量和淋巴细胞彗星率及彗星尾长间存在较紧密的相关性.
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γ-H2AX分析电离辐射诱发小鼠神经元DNA双链断裂及修复
目的 观察临床剂量的电离辐射后小鼠神经元DNA双链的断裂及修复,探讨γ-H2AX是否能作为衡量体内正常脑组织神经元DNA双链断裂(DSB)形成和修复的指标.方法 电离辐射诱导DSB形成试验,C57BL/6小鼠行0.1、O.5和1.0 Gy全身照射后10 win,收集脑组织进行分析;DSB修复试验,修复功能正常小鼠(C57BL/6)和修复缺陷鼠(BALB/c,A-T和SCID)在全身照射2 Gy后0.5、2.5、5、24和48 h收集脑组织进行分析.未照射的小鼠作为对照组.γ-H2AX和NeuN免疫荧光双重染色和免疫组织化学染色分析脑组织神经元DSB形成和修复.结果 DSB形成试验,在对照组脑组织皮质区神经元的细胞核内仅有数目很少的γ-H2AX焦点,而受照射后细胞核内γ-H2AX焦点数目显著增加,并显示出明显的剂量相关.通过分析不同放射敏感性的小鼠电离辐射后脑组织皮质区神经元的DSB修复动力学,发现C57BL/6小鼠细胞核内γ-H2AX焦点随时间的延长迅速减少,在照射后24和48 h仅有很低水平DSB未修复;而免疫缺陷SCID鼠在照射后所有的时间点都显示出γ-H2AX焦点的明显增加,A-T小鼠表现出较低的修复缺陷.主要表现在较晚的时间点(≥5 h)γ-H2AX焦点的中度增加;放射敏感的BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠相比γ-H2AX焦点数量轻度增加.结论 γ-H2AX焦点分析可以作为一项精确的量化指标,在体内衡量临床相关剂量电离辐射诱导的DSB形成和修复.
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单细胞凝胶电泳检测DNA辐射损伤的剂量-效应关系研究
目的 探索新的简便、快捷的辐射生物剂量学方法,用于急性辐射事故早期生物剂量估算.方法 用中性单细胞凝胶电泳技术检测辐射诱导的DNA双链断裂,CASP软件分析彗星图像,主要观察彗星头部DNA%(HDNA%)、尾部DNA%(TDNA%)、彗星全长(CL)、尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)等指标,SPSS 12.0软件拟合剂量-效应曲线.结果 上述指标均呈显著剂量-效应关系,以OTM指标的拟合优度佳.结论 中性单细胞凝胶电泳技术结合CASP软件的应用,有望成为新一代辐射生物剂量计.
