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铅对小鼠海马[Ca2+]的影响及L型钙通道的作用
目的探讨铅对分离的小鼠海马细胞内游离钙的影响及其及L型钙通道的作用.方法采用低浓度胰蛋白酶消化法分离小鼠海马细胞,并以莹光指标剂(Fura-2)作Ca2+荧光探针,用双波长荧光法测定海马细胞[Ca2+]i.结果铅可致分离的小鼠海马细胞[Ca2+]i升高[由静息时的(203.4±10.86)nmol/L升至(423.3±19.26)nmol/L],而不论胞外是否有钙;铅可抑制钾诱发海马细胞[Ca2+]i升高,尼莫地平可加强这种抑制作用,而BayK8644则可部分消除这种抑制作用.结论铅可致分离的小鼠海马细胞[Ca2+]i升高作用与胞内钙库释放有关;铅的抑制钾诱发海马细胞[Ca2+]i升高作用与其抑制L型钙通道有关.
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铅对小鼠学习记忆及脑海马细胞内钙库释放的影响
目的探讨铅对小鼠学习记忆和海马细胞内钙库Ca2+释放的影响.方法用水迷宫实验测定小鼠的空间学习记忆能力;采用低浓度胰蛋白酶消化法分离小鼠海马细胞,用IP3敏感钙库和IP3非敏感钙库的特异性拮抗剂肝素和普鲁卡因刺激海马细胞,以弗拉吐(Fura-2)作Ca2+荧光探针测定铅对海马细胞[Ca2+]i的影响.结果在水迷宫实验中,结果表明慢性铅暴露可明显损伤仔鼠的空间定位航行能力,损伤程度与饮用铅的浓度成正相关.与对照组比较,25μmol·L-1铅可致分离的小鼠海马细胞在胞外无钙静息状态下[Ca2+]i显著性增高(P＜0.05);而30μg·ml-1的三磷酸肌醇(IP3)敏感钙库特异性拮抗剂Heparin和0.1mg·ml-1的非IP3敏感钙库的特异性拮抗剂procaine可拮抗铅引起的海马细胞[Ca2+]i增高.结论慢性铅暴露可致小鼠空间学习记忆能力下降;高水平的铅可促进小鼠海马细胞内IP3敏感和非IP3敏感的两种内质网钙库释放,致海马细胞在胞外无钙静息状态下[Ca2+]i升高.
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砷对原代培养海马细胞形态学影响及酶活力研究
研究不同剂量亚砷酸钠对海马细胞活力、形态学改变以及生化指标的影响.采用0、0.08、0.40、2.00和10.00mg/L亚砷酸钠处理海马细胞6h和24h后,观察到海马神经元活力降低;细胞浆、核界限不清,细胞浆空泡变性,细胞突起变细、减少以至消失,神经细胞之间网络疏松;核染色质凝集、浓缩,核边移;胞浆内尼氏体减少;且呈剂量和时间依赖关系;培养上清中乳酸脱氢酶活性增高,胆碱酯酶活性降低.实验结果表明不同剂量亚砷酸钠对大鼠海马细胞产生不同程度的毒性作用,包括变性、凋亡和坏死.
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氟对原代培养大鼠海马细胞NCAM mRNA和蛋白表达的影响
目的 探讨氟对原代大鼠海马细胞生长发育、神经细胞黏附分子(NCAM)mRNA及蛋白表达的影响.方法 原代培养大鼠海马细胞暴露于20、40和80 μg/ml氟化钠24 h后,观察染氟前后海马细胞生长情况,采用噻唑蓝比色试验、逆转录-聚合酶链反应和蛋白印迹技术分别检测大鼠海马细胞存活情况、NCAM mRNA和蛋白表达水平.结果 与对照组相比,80 μg/ml剂量组海马细胞数量减少,突起减少、变短,细胞存活率下降.40、80 μg/ml剂量组NCAM mRNA水平均显著低于对照组,20 μg/ml剂量组NCAM mRNA水平虽与对照组之间差异无统计学意义,但存在下降的趋势,NCAM mRNA水平与氟浓度呈现一定的剂量效应关系,且随染氟浓度升高而降低.40、80 μmg/ml剂量组细胞NCAM-180蛋白表达水平显著低于对照组,各染氟组细胞NCAM-140蛋白表达水平显著低于对照组,80 μg/ml剂量组细胞NCAM-120蛋白表达水平显著低于对照组.结论 氟可抑制海马细胞生长和存活,并使NCAM mRNA和蛋白表达水平下降,氟对发育中海马损伤可能是其神经毒性的作用位点之一.
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单味中药及中药单体成分对海马细胞作用研究进展
海马结构(hippocampal formation)由海马(hippocampus)、齿状回(dentate gyrus)和下托(subiculum)等相关的皮质区构成.海马结构的神经活性物质有乙酰胆碱(Ach)、氨基酸包括谷氨酸和门冬氨酸、强啡肽(dynorphin,DYN)、单胺类(儿茶酚胺、5-HT、组胺)、神经肽[1].作为大脑边缘系统的主要组成部分,与学习记忆密切相关,因此海马结构在阿尔兹海默病(Alzheimer's disease,AD)、血管性痴呆(vascular dementia,VD)、糖尿病认知功能损害等疾病发病过程中的作用也日益受到学者的重视.本文综述了近年来单味中药及中药单体对海马细胞作用机制的研究进展情况.
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右美托咪定混合氯胺酮对新生大鼠离体海马细胞凋亡的影响
目的：探讨右美托咪定(Dex)混合氯胺酮对新生大鼠离体海马细胞凋亡的影响。方法SD新生大鼠(出生7 d)海马神经元体外培养6 d,采用随机数字表法分为对照组(C组),100μmol/L氯胺酮组(K组),10μg/ml Dex组(D组),10μg/ml Dex 混合100μmol/L氯胺酮组(DK组),各6只。孵育24 h后采用免疫组化法检测Caspase-3蛋白的表达,双染法检测神经元凋亡。结果与C组比较, K组的海马细胞凋亡率和Caspase-3表达水平升高(P<0.05)；与C组比较, D组海马细胞凋亡率和Caspase-3表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；与K组比较, DK组和D组的海马细胞凋亡率和Caspase-3表达水平降低(P<0.05)。结论 Dex能减轻氯胺酮诱导的新生大鼠离体海马细胞凋亡。
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β-淀粉样蛋白对大鼠海马细胞内质网钙库的影响
目的 研究β-淀粉样蛋白(Aβ25-35)对大鼠海马细胞内质网钙库的影响.方法 将40只成年清洁级雄性SD大鼠按体重随机分为4组,分别为Aβ 25-35染毒组(每测一次性注射2.5 μg/μl凝聚态Aβ22.溶液2μl)、假手术组、生理盐水组,正常对照组(不进行任何处理),每组10只.于手术后14d,检测海马细胞内游离钙离子浓度和内质网IP3、RYR、PSmRNA的表达水平.结果 与正常对照组、假手术组和生理盐水组相比,Aβ25-35染毒组海马细胞内质网肿胀肥大,扩张明显,且大多内质网膜破裂,游离钙浓度明显增高,内质网IP3、PSmRNA的表达水平升高,RYR mRNA的表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Aβ25-35可以通过破坏大鼠海马细胞内质网钙稳态而发挥神经毒性作用.
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海马内注射淀粉样蛋白对大鼠海马细胞内钙稳态的影响
目的 研究海马内注射β-淀粉样蛋白(Aβ)对大鼠海马细胞内钙稳态的影响.方法 将30只成年清洁级SD雄性大鼠按体重随机分为6组,每组5只.采用海马内注射方式染毒Aβ25～35,剂量分别为10、5、lμg/只,设立生理盐水组、假手术组和正常对照组.于术后14d,检测大鼠海马Ca2+-ATPase的活力及海马细胞内游离钙离子的浓度和海马内Sorcin、Ryr2 mRNA的表达水平.结果 与生理盐水组相比,各Aβ25～35染毒组大鼠海马Ca2+-ATPase活力均降低,5、10μg Aβ25～35染毒组大鼠海马细胞内游离钙离子浓度和各Aβ25～35染毒组大鼠海马细胞内Sorcin、Ryr2 mRNA的表达水平均下降,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01)；且随着Aβ25～35染毒量的升高,大鼠海马Ca2+-ATPase活力呈下降趋势,海马细胞内游离钙离子的浓度和海马内Sorcin、Ryr2 mRNA的表达水平均呈上升趋势.而假手术组、生理盐水组与正常对照组大鼠海马以上4个指标间比较,差异均无统计学意义.结论 Aβ25～35可以通过破坏大鼠海马细胞内钙稳态而发挥神经毒性作用.
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1 800 MHz电磁波辐射对大鼠海马细胞DNA的损伤作用
目的 探讨1 800 MHz电磁波照射大鼠后对其海马细胞DNA的损伤效应.方法 72只Wistar大鼠随机分为4组(2个暴露组及各自的平行对照组).暴露组大鼠在功率密度分别为0.5和1.0mW/cm2的1 800 MHz连续电磁场条件下照射;对照组进行虚拟暴露,每天12 h,连续21 d后,用单细胞凝胶电泳试验检测大鼠海马细胞DNA的损伤情况.结果 照射后,1.0mW/cm2组大鼠海马细胞拖尾率高于对照组(P＜0.05);0.5、1.0mW/m2组大鼠海马细胞拖尾面积均高于对照组(均P＜0.05);1.0mW/cm2组大鼠海马细胞拖尾率和拖尾面积均高于0.5mW/cm2组(均P＜0.05).结论 大鼠经模拟手机辐射强度的1 800 MHz电磁波辐射后,海马细胞DNA有一定的损伤.
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甲醛和二甲苯联合染毒对小鼠的神经毒性研究
目的 研究甲醛和二甲苯联合染毒对小鼠神经系统的毒性作用及其机制,为综合评价室内装修材料中甲醛和二甲苯对人体健康的危害提供科学依据.方法 选用健康清洁级昆明小鼠72只,按完全随机设计,将小鼠随机分为12组,每组6只,雌雄各半,分别为低剂量(5mg/kg)、中剂量(10mg/kg)、高剂量甲醛染毒组(20mg/kg)和生理盐水对照组,低剂量(50mg/kg)、中剂量(100mg/kg)、高剂量二甲苯染毒组(150mg/kg)和花生油对照组以及低剂量(2.5mg/kg甲醛+25mg/kg二甲苯)、中剂量(5mg/kg甲醛+50mg/kg二甲苯)、高剂量联合染毒组(10mg/kg甲醛+75mg/kg二甲苯)以及生理盐水+花生油(体积比1:1)对照组；采用腹腔注射染毒,连续7d.染毒结束后,采用Morris水迷宫实验和流式细胞凋亡对小鼠进行神经毒性的研究.结果 与相应对照组相比,中、高剂量甲醛、二甲苯以及联合染毒组小鼠逃避潜伏期延长,差异均有统计学意义(P＜0.05)；与相同剂量联合染毒组比较,中、高剂量甲醛、二甲苯联合染毒组雌性小鼠逃避潜伏期缩短,差异均有统计学意义(P＜0.05)；随着染毒时间的延长,各染毒组小鼠总体逃避潜伏期呈缩短趋势.在空间探索实验中,与相应对照组相比,中、高剂量甲醛、二甲苯染毒组以及各剂量联合染毒组小鼠找到平台的时间延长,在原平台象限游泳时间缩短,原平台象限游泳距离占总距离百分比下降,差异均有统计学意义(P＜0.05)；与相同剂量联合染毒组比较,各剂量甲醛染毒组和中、高剂量二甲苯染毒组小鼠找到平台的时间缩短,高剂量甲醛染毒组和二甲苯染毒组雌性小鼠、雄性小鼠以及小鼠总体在原平台象限游泳时间延长,原平台象限游泳距离占总距离百分比上升,差异有统计学意义(P＜0.05).与相应对照组相比,各剂量甲醛、二甲苯以及联合染毒组小鼠海马细胞早期凋亡率以及高剂量甲醛、二甲苯以及联合染毒组晚期凋亡率均升高,差异均有统计学意义(P＜0.05)；且随着染毒剂量的升高,小鼠海马细胞早期、晚期凋亡率呈上升趋势.与相同剂量联合染毒组比较,中、高剂量甲醛、二甲苯染毒组小鼠早期凋亡率均下降,高剂量甲醛、二甲苯染毒组雌性小鼠、雄性小鼠和小鼠总体晚期凋亡率均下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 甲醛和二甲苯联合染毒能降低小鼠的学习记忆能力,对神经系统具有一定毒性作用,且二者联合染毒具有一定的协同作用.
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氟对原代培养大鼠海马细胞周期及细胞凋亡和核因子-κB表达的影响
目的 探讨氟对原代大鼠海马细胞存活、细胞周期、凋亡和核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法 原代培养大鼠海马细胞分别暴露于20、40和80μg/ml氟化钠24 h后,采用噻唑蓝(MTT)、流式细胞术(FCM)、逆转录PCR(RT-PCR)分别检测大鼠海马细胞存活情况、细胞周期分布、凋亡率、NF-κB表达水平.结果 与对照组比较,80 μg/ml剂量组海马细胞存活率下降(P＜0.05);40、80 μg/ml剂量组凋亡率和S期细胞百分率皆显著高于对照组(P＜0.05),各剂量组NF-κB mRNA显著高于对照组(P＜0.05).结论 一定剂量氟可抑制海马细胞存活,诱导NF-κB mRNA表达和凋亡发生.氟对发育中海马细胞NF-κB表达水平的影响可能是氟神经毒性的机制之一.
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同型半胱氨酸对Aβ经毒性促进作用
目的 研究同型半胱氨酸是否促进β淀粉样肽(β-amyloid,Aβ)对体外培养海马细胞的神经毒性.方法 用同型半胱氨酸和/或Aβ42处理体外培养的海马细胞,观察神经细胞的凋亡情况以及神经细胞内的游离钙浓度的改变、DNA损伤和氧化损伤.结果 同型半胱氨酸(250μmol/L)和Aβ42(10μmol/L)同时作用海马细胞的凋亡率显著高于Hcy或Aβ42单独作用,甚至高于两者单独作用之和.Hcy没有促进Aβ42对DNA的作用;在神经兴奋毒和氧化损伤作用方面,同型半胱氨酸(250 μmol/L)和Aβ42 (10 μmol/L)产生了协同作用,同型半胱氨酸可促进Aβ42引发海马细胞内游离钙浓度升高和MDA的产生增多.结论 同型半胱氨酸可通过神经兴奋毒作用、氧化损伤和引发凋亡等机制促进Aβ42对体外培养海马细胞的神经毒性作用.
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S-腺苷蛋氨酸和叶酸抑制同型半胱氨酸诱导的海马神经细胞凋亡
目的 研究S-腺苷蛋氨酸和叶酸抑制同型半胱氨酸诱导的海马神经细胞凋亡作用及其相关机制.方法 用同型半胱氨酸、S-腺苷蛋氨酸和叶酸处理体外培养的海马神经细胞,观察神经细胞的凋亡情况,以及凋亡相关蛋白的表达变化.结果 用250μmol/L同型半胱氨酸作用4h可使神经细胞凋亡率显著升高,并呈时间依赖性.甲基供体S-腺苷蛋氨酸和叶酸可显著抑制同型半胱氨酸引起的神经细胞凋亡.同型半胱氨酸可显著促进凋亡相关蛋白P53、Bax的表达,抑制Bcl-2的表达.S-腺苷蛋氨酸和叶酸可抑制同型半胱氨酸引起的凋亡相关蛋白表达的改变.结论 S-腺苷蛋氨酸和叶酸可显著抑制同型半胱氨酸引起的神经细胞凋亡,凋亡相关蛋白表达的变化可能是S-腺苷蛋氨酸和叶酸作用的分子机制之一.
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异丙酚麻醉对新生小鼠海马c-fos表达和caspase-3激活的影响
全麻药可影响中枢神经的发育,导致婴幼儿或幼龄动物发育期后认知功能下降[1-7].异丙酚在小儿和产科麻醉中的应用日益广泛.研究表明,异丙酚麻醉可影响发育期啮齿类动物中枢神经发育[8],还可引起患儿共济失调、幻觉等神经系统损害[9].在中枢神经发育高峰期,阻断NMDA受体或过度激活γ-氨基丁酸A型( GABAA)受体诱发的神经细胞凋亡可影响长期学习记忆功能[10-11].异丙酚可通过激动GABAA受体,直接或间接阻断NMDA受体发挥麻醉效应[12-13],异丙酚对发育期中枢神经功能的影响是否与神经细胞凋亡有关尚有待研究.本研究拟探讨异丙酚麻醉对新生小鼠海马细胞凋亡相关蛋白c-fos表达和caspase-3激活的影响.
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铅对原代培养海马细胞形态及酶活力的影响
目的 观察铅对原代培养海马神经元形态及酶活力的影响.方法 原代培养乳大鼠海马神经元,经不同浓度醋酸铅(50、100、200 μg/ml)作用1～8 d.用活细胞倒置相差显微镜、HE染色和尼氏体染色观察细胞形态改变;光密度法检测细胞外液中的乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)和胆碱酯酶(cholesterase,CHE)活力;激光扫描共聚焦显微镜定量分析神经元胞浆中游离Ca2+的平均荧光强度.结果 形态学观察发现,低醋酸铅(50、100 μg/ml)组海马神经元表面粗糙,胞体变小,突起细小,细胞间网络疏松,胞体与胞浆之间界限逐渐模糊不清,核仁不清晰;200 μg/ml组,神经元数量减少,细胞之间聚集呈团簇状,可见细胞膜损伤破裂,即神经元解体坏死.HE染色观察低浓度醋酸铅作用24 h后,可见散在单个细胞核回缩,胞浆、突起着色不均,甚至有的出现染色质凝集、核边移,但核膜完整;高浓度醋酸铅则使细胞质空泡变性,突起减少,核边移呈半月形,甚至细胞出现解体坏死,细胞之间聚集成团.尼氏体染色显示醋酸铅能使海马神经元的尼氏体减少,着色浅淡,且有剂量依赖关系.另外,醋酸铅作用于海马神经元24 h后,培养上清中LDH释放增加(P<0.01),CHE活力明显下降(P<0.01).激光共聚焦显微镜检测结果显示,随着醋酸铅浓度的增大,细胞内液Ca2+浓度也随着增大,醋酸铅3个浓度组的平均荧光强度均显著高于正常对照组(P<0.01),并有剂量一反应关系.结论 原代培养的海马神经元随着醋酸铅浓度的加大,呈现不同程度的损伤.
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用Fura-2双波长荧光法测定小鼠海马细胞内游离钙
目的:探讨小鼠海马细胞分离及细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的测定.方法:低浓度胰蛋白酶消化、分离海马细胞,采用Ca2+荧光指示剂Fura-2双波长荧光法测定[Ca2+]i.结果:海马细胞存活率超过95%.细胞外Ca2+1.0 mmol/L时,静息状态下海马细胞[Ca2+]i为(210±10.7)nmol/L.30 mmol/L KCl可显著增加[Ca2+]i,并且KCl的这种效应呈一定的剂量依赖关系.结论:低浓度胰蛋白酶消化分离小鼠海马细胞简单、可靠;Fura-2建立的双波长荧光法灵敏、可靠.
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CNQX在小鼠脑不同类型突触分泌中的作用
目的:探讨6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX)在小鼠脑不同类型突触分泌中的作用.方法:体外培养新生小鼠大脑皮层神经细胞与海马神经细胞,在加有不同浓度的CNQX的细胞外液中对细胞进行电生理记录,分别记录mEPSC的频率和eEPSC的幅值.结果:CNQX作用于诱发性神经递质释放的半抑制浓度(IC50)显著大于自发性神经递质释放的半抑制浓度,CNQX对自发性神经递质的释放作用效果更加明显.但对于不同脑区,CNQX的作用效果差异并不明显.结论:CNQX在阻断兴奋性神经递质自发释放和诱发释放时可能有不同的机制,但是并不具有脑区特异性.
关键词： 6-氰基-7-硝基喹喔啉-2 3-二酮 大脑皮层细胞 海马细胞 神经递质释放 -
大鼠前脑不同缺血时间后再灌注损伤模型的构建与评价
目的：建立缺血再灌注损伤wistar大鼠模型。方法本实验将50只wistar大鼠随机平分成正常组，假手术组，缺血10 min组，缺血20 min组，缺血30 min组。采用双侧颈总动脉夹闭法，夹闭一定时间后再通，重复3天。通过HE染色技术观察大鼠海马组织的损伤情况，计数400倍光镜视野下的海马组织细胞数目以及脑重量和脑系数进行比较分析。结果缺血20 min组大鼠的海马变性坏死明显，缺血10 min组变性程度较轻微，缺血30 min组细胞溶解，结构不清，正常组和假手术组均无上述改变。结论双侧颈总动脉夹闭法有效地构建不同缺血时间后再灌注损伤模型，具有操作简单，安全性大，重复性高的优点，为今后缺血再灌注损伤的实验研究提供有效的方法及病理形态学依据。
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葡萄籽原花青素对过氧化氢致大鼠海马神经元损伤的保护作用
[目的]观察葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin,GSP)对过氧化氢(H2O2)致大鼠海马神经元损伤的保护作用. [方法]实验分为5组:阴性对照组(A组)、H2O2模型组(B组)、GSP低剂量组(C组,1.25mg/L)、GSP中剂量组(D组,2.50mg/L)和GSP高剂量组(E组,5.00mg/L).采用原代细胞培养的方法,建立H2O2致海马细胞氧化损伤模型.观察各组细胞形态和超微结构;采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞存活率;化学比色法检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)含量;TdT介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL法)检测细胞凋亡率.[结果]形态学观察C、D、E组均可减轻H2O2诱导的海马细胞氧化损伤.与B组相比,C、D、E组细胞存活率由31.97%分别上升到61.42%、68.47%和80.04%(P＜0.01);细胞凋亡率由8.83%分别降低到3.50%、2.83%和2.00%(P＜0.01);D、E组细胞内SOD含量明显增加(P＜0.05或P＜0.01),C、D、E组抑制ROS能力和减少MDA含量明显增加(P＜0.01). [结论]GSP对H2O2诱导的海马细胞氧化损伤有明显的保护作用,其作用机制可能与提高海马细胞的抗氧化能力以及减少凋亡率有关.
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新生大鼠海马细胞原代培养及缺氧缺血模型建立
目的 探讨体外培养海马细胞的生物学特性及缺氧缺血模型建立的方法.方法 无菌手术剥离、收集24 h新生大鼠海马,胰酶消化后行Neurobasal无血清培养基培养.相差显微镜下观察细胞形态,采用CCK-8法检测细胞活力,神经元特异性烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白2(MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色鉴定海马细胞,氧糖剥夺法建立体外缺氧缺血模型.结果 细胞接种后,细胞开始呈对数生长趋势,7d后呈现平台期.NSE和MAP-2在细胞中均呈阳性表达,而GFAP为阴性表达.氧糖剥夺严重损伤海马细胞;随着剥夺时间的延长,细胞活性呈进行性下降.结论 体外培养可获得生长旺盛的海马细胞;氧糖剥夺实验可作为体外缺氧缺血模型建立的方法.
