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番荔枝内酯单体89-2实验治疗KBv200及KB细胞移植瘤的作用
目的番荔枝内酯单体89-2是自阿蒂莫耶番荔枝植物分离获得.本研究旨在探讨89-2对MDR肿瘤的实验治疗作用.方法以MTT法测定细胞毒;KBv200及KB细胞裸鼠移植瘤模型研究89-2对MDR肿瘤的实验治疗作用;以Fura-2-AM法测定P-糖蛋白(P-gp)功能.结果 89-2对KBv200及KB细胞的IC50分别为48.7和64.6 nmol*L-1(P>0.05).89-2对KB及KBv200细胞裸鼠移植瘤具有相似的剂量依赖性抑制作用,而毒性可以耐受.89-2剂量依赖性地增加KBv200细胞的Fura-2积累.结论 89-2体内外均抑制KB和KBv200细胞生长,具有开发前景.
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离子影像系统测定分离的单个心肌细胞钙瞬变和收缩
目的建立一种单细胞钙瞬变的测定方法.方法选用正常和心肌肥厚Wistar大鼠,分离出心肌细胞,用新购进的离子影像分析系统进行钙瞬变和收缩的测定.结果和结论该系统可用于同步测定钙瞬变和细胞收缩.
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KCl和Iso对培养乳鼠单个心肌细胞游离钙浓度影响的研究
目的测定培养大鼠乳鼠心肌细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i),观察KCl、异丙肾上腺素(Iso)对心肌细胞[Ca2+]i的影响,初步探讨其作用机制.方法采用Fura-2作为细胞内钙离子的荧光探针负载培养的心肌细胞,结合阳离子测定系统检测心肌细胞[Ca2+]i.结果静息时,心肌细胞[Ca2+]i为83.3±11.67nmol/L,30mmol/L、50 mmol/L 、70 mmol/L KCl使心肌细胞[Ca2+]i升高,且呈剂量依赖性;同时10μmol/L异丙肾上腺素使心肌细胞[Ca2+]i 升高.结论 Fura-2/AM结合阳离子测定系统可以精确的反映细胞内游离钙离子浓度,KCl、异丙肾上腺素升高心肌细胞[Ca2+]i的作用机制不同.
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用Fura-2双波长荧光法测定小鼠海马细胞内游离钙
目的:探讨小鼠海马细胞分离及细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的测定.方法:低浓度胰蛋白酶消化、分离海马细胞,采用Ca2+荧光指示剂Fura-2双波长荧光法测定[Ca2+]i.结果:海马细胞存活率超过95%.细胞外Ca2+1.0 mmol/L时,静息状态下海马细胞[Ca2+]i为(210±10.7)nmol/L.30 mmol/L KCl可显著增加[Ca2+]i,并且KCl的这种效应呈一定的剂量依赖关系.结论:低浓度胰蛋白酶消化分离小鼠海马细胞简单、可靠;Fura-2建立的双波长荧光法灵敏、可靠.
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用Fura-2测定单个巨噬细胞内游离钙的条件的优化
Fura-2负载后用荧光显微镜成像系统研究单细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)应用已十分广泛,娄淑杰等[1]用此方法检测了PC12细胞内的[Ca2+]i,我们将娄淑杰等的方法应用于腹腔巨噬细胞(PEM),发现不尽理想,因此我们实验过程中对Fura-2的浓度进行了调整,另外PEM作为参与炎症的非兴奋细胞,其活化对[Ca2+]i有很大的影响,而细胞贴壁很可能导致活化,但测定方法又要求只能在贴壁细胞进行.因此,我们使用鼠尾胶缩短贴壁时间,并把检测用的PEM的贴壁时间控制在一定范围之内,取得了比较理想的结果.
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龙血素B诱导大鼠初级感觉神经元胞内Ca2+浓度缓慢上调
本研究采用Fura-2荧光染色的方法,在急性分离的背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)神经元细胞上,观察了由传统中药龙血竭活性成分龙血素B诱导的[Ca2+]i的变化.在DRG细胞上施加龙缸素B引起[Ca2+]i的上升,且存在剂量依赖效应.同样的结果出现在细胞外液无钙的情况,但此时[Ca2+]i上升幅度远远小于在标准细胞外液情况下出现的上升幅度.这表明DRG的[Ca2+]i的升高主要是由细胞外Ca2+内流而产生的,而不是由细胞器如线粒体和胞内钙库释放Ca2+产生的.另外,咖啡因和龙血素B 共孵育也可以诱导[Ca2+]i的升高,但是其上升幅度显著小于单独施加咖啡因时的幅度,说明龙血素B与咖啡因作用的通路或靶器有所重叠.与咖啡因、高钾和辣椒素诱导的瞬变相比,龙血素诱导的DRG的[Ca2+]i的上升更加缓慢且持续时间较长.这些结果提示,龙血素B诱发的初级感觉神经元[Ca2+]i的升高是稳定且独特的.
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氨甲酰胆碱通过M2胆碱能受体对大鼠心肌细胞发挥正性肌力作用
为研究氨甲酰胆碱(carbachol,CCh)对大鼠心肌细胞的正性肌力作用机制,利用电压钳方法观察CCh对急性分离的单个大鼠心肌细胞L-型钙电流(ICa,L)和钠/钙交换电流(INa/Ca)的影响.细胞负载Fura-2/AM后,用离子成像系统测定场刺激下单个大鼠心肌细胞的钙瞬变和细胞缩短.结果表明,100 μmol/L CCh使正向INa/Ca从(1.18±0.57)pA/pF增加到(1.65±0.52)pA/pF(P＜O.01),反向INa/Ca从(1.11±0.49)pA/pF增加到(1.53±0.52)pA/pF(P＜0.01),但不影响ICa,L.阿托品(非选择性M胆碱受体拮抗剂)和methoctramine(选择性M2胆碱受体拮抗剂)可阻断这种增加作用.100 μmol/L CCh使钙瞬变从对照组的203.8±50.0增加到234.8±64.3,使细胞缩短从对照组的(3.00±0.67)μm增加到(3.55±1.21)μm.KB-R7943(选择性反向INa/Ca抑制剂)不影响钙瞬变和细胞缩短的基础水平,却完全阻断CCh引起的钙瞬变和细胞缩短的增加.尼卡地平(ICa,L抑制剂)抑制钙瞬变和细胞缩短.CCh在尼卡地平存在下仍可增加钙瞬变和细胞缩短值,提示其正性肌力作用是通过刺激钠/钙交换实现的.CCh不改变钙敏感性.阿托品和methoctramine阻断CCh的这种激动作用,说明CCh的正性肌力作用是通过M2受体实现的.以上结果提示,CCh对大鼠心肌细胞有正性肌力作用,这种作用是通过激动反向钠/钙交换实现,由M2受体介导.
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MCI-154对大鼠心肌细胞的变力作用
钙增敏剂具有正性肌力作用,同时不增加细胞内钙浓度,因此可避免导致心律失常和终心肌细胞死亡的钙超载.然而大部分钙增敏剂对心肌舒张功能有损害作用.MCI-154是一种钙增敏剂,但不损害舒张功能.为阐明其变力作用机制,我们应用离子成像技术研究了MCI-154对分离的单个大鼠心室肌细胞钙瞬变和收缩的影响,利用膜片钳技术观察了MCI-154对大鼠心室肌细胞L-型钙电流和Na+/Ca2+交换电流的影响.结果表明:(1)MCI-154在lμmol/L至100μmol/L的浓度范围内对L-型钙电流(ICa-L)无直接影响;(2)MCI-154在轻微增加钙瞬变幅度和缩短心肌钙瞬变TR50和TR90的情况下,呈剂量依赖性地增加大鼠心室肌细胞的缩短;(3)MCI-154剂量依赖性地增加正常大鼠心室肌细胞的Na+/Ca2+交换电流.这些结果提示:MCI-154不仅剂量依赖性地发挥了正性变力作用,对舒张功能也没有损害作用,明显不同于其它钙增敏剂,而且还轻微改善了大鼠心室肌细胞的舒张.其对内向Na+/Ca2+交换电流的激动作用会加快钙内流,导致TR50和TR90的缩短,提示MCI-154是通过正向Na+/Ca2+交换改善舒张功能的.
关键词： MCI-154 钙增敏剂 Fura-2 钙瞬变 收缩 L-型钙电流(ICa-L) Na+/Ca2+交换 膜片钳 -
DMA增加正常大鼠心肌细胞钙瞬变和收缩
实验观察了钠氢交换或钠钙交换抑制剂5-(N,N-二甲基)氨氯吡咪(DMA)对正常和心肌肥厚大鼠分离心室肌细胞钙瞬变和细胞收缩的影响.通过负载荧光染料Fura-2/Am,应用离子影像分析系统(Ion Imaging System)同步测定离体大鼠心肌细胞钙瞬变和细胞长度.结果表明:DMA 10 μ,mol/L分别使钙瞬变和细胞缩短从对照组的209.60±54.96和3.07±0.971μm增加到238.50±80.41和4.07±1.02μmn(P＜0.05,n=7).应用特异性反向钠钙交换阻断剂KB-R7943可完全阻断DMA的激动作用.DMA还可使尼卡地平抑制L-型钙通道后的钙瞬变和细胞收缩增加.在肥厚心肌细胞,DMA表现出相同的药理作用,但对钙瞬变和细胞缩短的刺激作用更强.结果表明:DMA可通过反向钠钙交换途径增加正常和肥厚大鼠心肌细胞钙瞬变和细胞收缩,且对肥厚心肌细胞的影响比对正常心肌细胞大.
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小檗碱对豚鼠结肠平滑肌细胞内游离钙浓度的影响
采用Ca2+荧光示踪剂Fura 2-AM和双波长荧光分光光度法, 观察小檗碱(berberine, Ber)对酶法分离的豚鼠结肠平滑肌细胞内游离钙([Ca2+]i)的影响并探讨其机制.在含1.5 mmol/L CaCl2的HEPES-Ringer缓冲液中, 豚鼠结肠平滑肌细胞[Ca2+]i为108±9.4 nmol/L (n=7), Ber对静息[Ca2+]i无明显影响, Ber呈浓度依赖性抑制, 60 mmol/L KCl引起的[Ca2+]i增高, IC50值为34.09 μmol/L.在含1.5 mmol/L Ca2+和无Ca2+的缓冲液中, 30、100 μmol/L Ber均显著抑制10 μmol/L ACh所诱发的[Ca2+]i的增高, 且有浓度依赖性; 同样Ber对环匹阿尼酸(CPA)所致的[Ca2+]i增高也有浓度依赖性抑制作用, 有钙和无钙条件下IC50分别为37.97 μmol/L和49.70 μmol/L.结果提示, Ber对结肠平滑肌细胞外Ca2+内流和细胞内钙释放均有抑制作用.
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ACTH4-9类似物对小鼠海马突触体Ca2+水平的调节作用
本工作观察了Org2766(ACTH4-9的类似物)对海马突触体内游离Ca2+水平及对45Ca2+摄取的影响.采用细胞内钙离子荧光探针Fura-2,通过Spex-阳离子测定系统检测突触体内[Ca2+]i的动态变化,并用液闪光谱仪测定突触体对45Ca2+的摄取.结果表明:较低剂量的Org2766对突触体内[Ca2+]i的影响不明显,却显著降低突触体对45Ca2+的摄取;高剂量的Org2766增加突触体内[Ca2+]i,但对突触体的45Ca2+摄取无影响.较低剂量的Org2766可拮抗茴香霉素(ANI)升高突触体内[Ca2+]i和45Ca2+摄取量的作用,高剂量的Org2766无此效应.此结果提示,Org2766可通过抑制胞外钙内流和增加胞内钙库的释放来调节胞内钙水平.
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α1-肾上腺素受体亚型介导细胞内游离Ca2+增高的信号转导途径
本文探讨了α1a,α1b,α1d三种亚型肾上腺素受体(AR)激动时细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)升高的信号转导途径.在稳定表达三亚型α1-AR的HEK293细胞系中,用fura-2方法描记细胞内Ca2+信号强弱的变化.结果显示,百日咳毒素(PTX)对去甲肾上腺素激动三亚型α1-AR而引起的[Ca2+]i升高无影响,U-73122和PMA明显抑制[Ca2+]i升高;Calphostin C和PMA过夜预处理可翻转PMA的抑制作用;Forskolin和Rp-cAMPs对α1-AR介导的[Ca2+]i升高无影响,但Quercetin和Tyrphostin可抑制[Ca2+]i升高峰值,对平台期幅值则无影响.因此,在HEK293细胞,三亚型α1-AR可通过PTX非敏感G蛋白激活PLC而介导磷酸肌醇-Ca2+信号系统,PKC磷酸化系统既抑制α1-AR介导的细胞内贮存Ca2+释放,又抑制细胞外Ca2+内流;cAMP系统不参与α1-AR介导Ca2+信号的调节,酪氨酸激酶可能参与这一过程.
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马蔺子甲素抗多药抗药性肿瘤作用及其机制探讨
有报道马蔺子甲素（irisquinone，IR）能抑制肿瘤细胞DNA的合成及断裂后的修复，具抗肿瘤和放射增敏作用［1，2］。那么IR对多药抗药性(Multidrug Resistance, MDR)肿瘤是否有治疗作用或逆转肿瘤的MDR作用？本文拟通过测定马蔺子甲素对多药抗药性(MDR)肿瘤细胞的抑制作用及其对P-gp的影响，对这些问题进行探讨。1 材料与方法1.1 药物 IR由山东新华制药厂提供，以二甲基亚砜溶解，用生理盐水配成所需浓度。1.2 细胞培养 MCF-7和MCF-7/ADR细胞在含10％小牛血清的DMEM培养液37℃ 0.05 CO2的条件下培养。MCF-7/ADR稳定表达P-糖蛋白，具有典型的多药抗药性，对阿霉素（adriamycin，ADM）的抗药性是MCF-7的66倍。KB和KBv200细胞在含10％小牛血清的RPMI 1640培养液37℃ 0.05 CO2的条件下培养。KBv200对VCR较KB细胞耐药100倍。
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Fura-2荧光测定胞质Ca2+实验中注意Cd2+的荧光干扰作用
目的探讨Cd2+在Fura-2荧光测定胞质Ca2+过程中对荧光的干扰作用.方法培养的PC12细胞,在无钙溶液中利用Fura-2荧光探针测定胞质内Ca2+浓度.结果在thapsigargin诱导Fura-2荧光比值(F340/F380)上升后,CdCl2可以导致F340/F380进一步升高.将细胞膜破坏,Fura-2从胞质内溢出,CdCl2依然可以导致荧光比值明显上升.在无PC12细胞,无Ca2+的溶液中,加入Fura-2/AM,100 μmol·L-1 CdCl2可以导致F340/F380明显升高.结论 Cd2+对Fura-2及Fura-2/AM都存在荧光干扰现象,使荧光比值增加.
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急性分离大鼠心室肌细胞的Ca2+电流和细胞内Ca2+浓度
目的 在急性分离SD大鼠心室肌细胞上,检测Ca2+电流(Ica)和Ca2+浓度[Ca2+].的变化.方法 改良Langendroff法,用含胶原酶Ⅰ(1750 U/mL)和蛋白酶XⅣ(0.28 mg/mL)的无Ca2+台氏液经大鼠主动脉循环灌流法,急性分离大鼠心室肌细胞;采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞的Ica,动态细胞荧光成像技术检测心室肌细胞[Ca2+]i的变化.结果 在20 rmin内新鲜分离大鼠心室肌细胞,全细胞膜片钳技术可记录电刺激引起心室肌细胞Ica,1μmol/L异丙肾上腺素可显著增加Ica;并观察到心室肌细胞[Caa2+]i以及电刺激增强[Ca2+]i的效应.结论 大鼠心室肌细胞急性分离方法简便实用,所分离的心室肌细胞形态和功能正常,适用全细胞膜片钳和动态细胞荧光成像技术检测实验.
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如何测定心肌细胞内的钙瞬变
细胞内钙具有重要的生理学意义,心肌细胞内钙瞬变是触发心肌细胞收缩的必要条件.以fura-2为细胞内钙指示剂,用光谱荧光法测定心肌细胞内的钙瞬变是研究心肌细胞钙转运的重要指标.
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衰老与海马神经元细胞内钙离子水平升高和钙稳态改变的相关性
衰老与神经退行性疾病如帕金森综合征和阿尔茨海默征引起的神经易损性增高及中风和癫痫引起的神经元丧失相关联.一些研究揭示,细胞内钙离子浓度([Ca2+]I)升高引起神经元丧失与衰老相关疾病的发生有关.然而,以幼年和中年动物海马神经元为标本,直接进行[Ca2+]I和Ca2+稳态机制的比较研究尚未见报道.该研究应用Fura-2检测了幼年(4～5月)和中年(12～16月)SD大鼠快速分离的CA1区海马神经元[Ca2+]I.结果发现,中年大鼠神经元基础[Ca2+]I的水平明显高于幼年大鼠.用谷氨酸盐诱导胞内Ca2+超载,中年大鼠神经元转运多余Ca2+所需的时间比幼年大鼠长,这些研究结果为动物出现Ca2+稳态改变的年龄明显早于以往认为的老年阶段(≥24月)提供了直接的证据.Ca2+动力学的改变使衰老神经元对中风、癫痫或头部损伤相对于引起的神经元死亡更为敏感.阐明钙稳态机制不仅有助于理解衰老引起神经元丧失增多,而且也有助于开发靶向降低[Ca2+]I,进而维持衰老神经元正常钙稳态的临床药物.
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E-4031通过反向钠钙交换增加正常和心肌肥厚大鼠心肌细胞钙瞬变和收缩
目的:观察Ik阻断剂E一4031对正常和心肌肥厚大鼠钙瞬变和细胞收缩的影响.方法:应用带CCD Cam-era的离子影象分析系统(Ion Imaging System)测定离体大鼠心肌细胞钙瞬变和细胞长度.结果:E-4031(10Umol/L)分别使正常组钙瞬变和细胞缩短从对照组的(210±49)和(3.0±0.8)u皿增加到(245±47)和(3.6±1.0)um(P<0.05),使心肌肥厚组钙瞬变和细胞缩短分别从对照组的(196±54)和(3.0±1.3)um增加到(240±49)和(3.6±1.3)um(p<0.05),而对钙敏感性无显著影响.KB-R7943可完全阻断正常组和肥厚组心肌细胞由E-4031诱导的激动作用.尼卡地平不能阻断E-4031的增加作用.结论:E一4031可通过刺激反向钠钙交换增加正常和心肌肥厚大鼠心肌细胞钙瞬变和细胞收缩,同时并不影响钙敏感性.且对肥厚心肌细胞的影响大于正常心肌细胞.
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卡托普利和依那普利对血管平滑肌细胞内钙的影响
检测ACE抑制剂对主动脉平滑肌细胞内Ca2+的影响.方法:用荧光标计和图象处理技术结果:SHR细胞内Ca2+以及KCl,NE和Ang在SHR细胞引起的Ca2+增加多于WKY细胞.Cap和Ena不影响KCl和Ang在WKY细胞的作用,但Cap,Ena和Nif抑制KCl,NE和Ang在SHR细胞的作用.结论:Cap和Ena阻断功能和特异性已改变的电压依赖性钙通道.
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粉防己碱对培养大鼠心肌细胞胞内游离钙的影响
目的:研究粉防已碱对心肌的作用.方法:采用Fura-2和AR-CM-MIC阳离子测定系统测定培养大鼠单个心肌细胞胞内游离钙.结果:外钙1.3 mmol·L1时,细胞静息钙为90±12 nmol·L-1.粉防己碱不影响静息钙,但可明显抑制CaCl2,KCl,哇巴因引起的胞内钙增高;对于去甲肾上腺素引起的胞内钙增高,粉防己碱只有在外钙存在时,方对其有抑制作用.结论:粉防己碱抑制钙离子的跨膜运动,但在心肌细胞,它并非是选择性的钙通道阻滞剂.
