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山楂叶原花青素对血管内皮细胞钙活化作用的研究
山楂叶具有活血化瘀,理气通脉,化浊降脂的功效.原花青素是其主要活性成分之一,具有调节血管活性的重要作用.以往研究表明,原花青素的调节作用与其诱导血管内皮细胞分泌一氧化氮有关,且这一作用还依赖于细胞外钙的存在,提示血管内皮细胞内部钙离子的浓度变化可能在此过程中发挥关键作用.然而,迄今为止,对于这一问题还缺乏研究.该实验探讨山楂叶原花青素(hawthorn leaf procyanidins,HLP)对血管内皮细胞钙浓度的影响,从而推测HLP血管活性的可能机制.体外培养人脐静脉内皮细胞;使用Fura-2作为探针,HLP加入细胞孵育液,以活细胞工作站观察胞内钙离子浓度30 min.6.25 ～ 50 mg· L-1 HLP浓度依赖地升高细胞内钙离子浓度,其中25,50 mg·L-1HLP组较正常组,差异明显.使用无钙孵育液、在孵育液内加入钙螯合剂EGTA或使用钠钙交换体的抑制剂,均可以显著抑制HLP的作用;而抑制胞内钙库释放钙离子,也可显著抑制HLP的作用.综上,该实验首次观察了HLP对血管内皮细胞钙离子浓度的影响;结果提示,HLP具有血管内皮细胞钙活化的作用,这可能是其血管活性作用的机制之一;这一钙活化作用与HLP促进血管内皮细胞胞外钙内流和胞内钙释放有关,而前者又可能与激活胞膜上钠钙交换体的逆向转运有关.
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用共聚集显微镜测量细胞内游离钙
钙离子是细胞内的第二信使， 在细胞的生命活动中起着重要作用， 它参与调节细胞功能， 如肌肉收缩、细胞运动、信息传递、物质代谢等。胞内钙离子大部分为结合钙， 主要贮存于肌浆网、内质网和线粒体等细胞器的钙库内。 胞浆内的游离钙作为第二信使，广泛参与、调节多种生理和病理过程，测定胞浆内游离钙在生理、病理和药理学上均具有重要意义。 用共聚焦显微镜可以对胞内游离钙进行定位、定量分析， 并能监测其动态变化。 本文主要介绍用共聚焦显微镜测量细胞内游离钙的原理、方法和意义。
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线粒体钙离子转运抑制对心力衰竭兔细胞电生理的影响
目的：在心力衰竭的各种病理改变中，线粒体的功能异常处于中心地位；近期研究发现线粒体自身具备钙储存与释放功能，其不仅参与胞内钙离子启动的级联信号过程，还可感受其周围含钙细胞器（如肌浆网）的存在从而摄取钙，二者内游离钙离子浓度紧密相联且处于动态平衡。而心肌细胞钙离子转运功能的改变与心力衰竭心律失常的发生关系极为密切。目前对于线粒体功能对此类心律失常的影响还不得而知。本研究旨在通过观察线粒体钙离子转运体抑制剂Ru360对心力衰竭心肌细胞钙浓度、钙瞬变、肌浆网钙浓度与线粒体钙浓度的影响。
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心力衰竭细胞钙瞬变交替现象与恢复性质研究
目的：胞浆钙离子浓度波动是心力衰竭细胞胞内钙离子操控失调的表现，是心肌自律性改变的物质基础，也是引起触发活动、室性心律失常的重要原因之一。既往研究发现动作电位恢复性质与电交替现象与室性心律失常的发生具有一定的相关性，但是对于其微观组成-钙瞬变的联系还不得而知。本研究旨在观察在稳定电场刺激下心力衰竭心室肌细胞钙瞬变瞬变幅值交替现象及恢复性质。
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牛磺酸对海马神经细胞的营养和保护作用
目的:利用无血清培养的新生大鼠原代海马神经细胞,观察牛磺酸,谷氨酸和过氧化氢对神经细胞损伤的保护作用.方法:用含不同剂量牛磺酸的培养基培养神经元,动态观察神经细胞的生长情况以了解牛磺酸对神经细胞的营养作用;不同剂量牛磺酸与神经细胞预孵育24 h后,分别加入损伤剂(谷氨酸和过氧化氢),观察神经细胞存活数及乳酸脱氢酶的漏出率的变化;并且利用双波长荧光分光光度计观察谷氨酸对神经细胞内钙稳态的改变及牛磺酸的拮抗作用.结果:牛磺酸能促进体外培养的海马神经元的生长,并延长其存活时间;而且能剂量依赖性地拮抗过氧化氢和谷氨酸引起的神经细胞存活数下降及乳酸脱氢酶漏出率增高;牛磺酸还可抑制谷氨酸引起的升钙作用.结论:牛磺酸能促进神经细胞的生长,对谷氨酸和过氧化氢引起的细胞损伤均有明显的保护作用.
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Ca2+调控的胰岛素分泌
胰岛β细胞内胰岛素分泌颗粒胞裂外排,从而分泌胰岛素.该过程是由胰岛素分泌颗粒局部Ca2+浓度的迅速升高而触发的.胰岛β细胞内Ca2+浓度的迅速升高主要源于经质膜上钙通道的Ca2+内流和胞内钙库Ca2+释放.细胞外钙内流主要通过电压依赖型钙通道,而胞内Ca2+释放可能来自三磷酸肌醇敏感钙库、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)敏感钙库、ryanodine敏感钙库及线粒体钙库等.不同情况下的胰岛素分泌或胰岛素分泌的不同阶段可能由不同来源的Ca2+触发或增强,两者相互协调,在胰岛素分泌中起重要作用.因此,对β细胞内钙信号的产生及调控途径的深入研究有利于进一步阐明糖尿病的发病机制,并为糖尿病的治疗提供新思路.
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钙离子信号对胰岛素分泌的调控
胰岛素的分泌及其分泌的调控是维持机体内葡萄糖平衡的重要机制,胰岛素分泌量的不足会导致非胰岛素依赖的糖尿病的发生.胰岛素包裹在致密核心大囊泡中,胰腺β细胞通过调控致密核心大囊泡的胞吐过程来调节胰岛素的分泌.胞内Ca2+浓度是影响胰岛素分泌的重要因素.胰腺β细胞主要通过质膜上的ATP敏感的钾通道、钙通道和胞内钙库的活动改变胞内Ca2+浓度,从而调控β细胞胰岛素的分泌活动.
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Humanin拮抗Aβ31-35引起的培养皮层神经元胞内Ca2+浓度升高
β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)在脑组织中的过多沉积与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的发病密切相关.Aβ的毒性作用机制目前尚不明确,有研究认为扰乱细胞内钙稳态是其重要机制之一.Aβ31-35是一个小的Aβ活性片段,具有与完整肽链相同的神经毒作用.Humanin(HN)是一种存在于AD患者脑组织中具有神经保护作用的多肽,它能有效抑制Aβ诱发的神经元死亡.本研究应用Ca2+荧光成像技术,检测不同时间给予不同浓度的HN对Aβ31-35引起的培养皮层神经元[Ca2+]i升高的影响,探讨HN对Aβ31-35神经毒的抑制作用是否通过抑制Aβ31-35所致的细胞内钙稳态紊乱而实现.结果显示:HN(10 μmol/L)预孵育10 min部分抑制Aβ31-35(25 μmol/L)所致的神经元[Ca2+]i的升高.当HN与Aβ31-35(25 μmol/L)同时加入时,10μmol/L HN未能改变Aβ31-35(25 μmol/L)引起的神经元[Ca2+]i升高的幅度,但可延迟[Ca2+]i的升高;而20μmol/L HN明显抑制了Aβ31-35(25 μmol/L)引起的神元[Ca2+]i的升高.以上实验结果提示,Aβ31-35引起神经细胞内钙稳态的紊乱是其神经毒作用机制之一;HN抑制Aβ31-35引起的神经元[Ca2+]i升高具有时间和剂量依赖性.
关键词： 阿尔茨海默病 β-淀粉样蛋白31-35 Humanin 胞内钙离子 -
龙血素B诱导大鼠初级感觉神经元胞内Ca2+浓度缓慢上调
本研究采用Fura-2荧光染色的方法,在急性分离的背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)神经元细胞上,观察了由传统中药龙血竭活性成分龙血素B诱导的[Ca2+]i的变化.在DRG细胞上施加龙缸素B引起[Ca2+]i的上升,且存在剂量依赖效应.同样的结果出现在细胞外液无钙的情况,但此时[Ca2+]i上升幅度远远小于在标准细胞外液情况下出现的上升幅度.这表明DRG的[Ca2+]i的升高主要是由细胞外Ca2+内流而产生的,而不是由细胞器如线粒体和胞内钙库释放Ca2+产生的.另外,咖啡因和龙血素B 共孵育也可以诱导[Ca2+]i的升高,但是其上升幅度显著小于单独施加咖啡因时的幅度,说明龙血素B与咖啡因作用的通路或靶器有所重叠.与咖啡因、高钾和辣椒素诱导的瞬变相比,龙血素诱导的DRG的[Ca2+]i的上升更加缓慢且持续时间较长.这些结果提示,龙血素B诱发的初级感觉神经元[Ca2+]i的升高是稳定且独特的.
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突变型人胰高血糖素样肽-1对神经细胞损伤的保护
目的 研究突变型人胰高血糖素样肽-1 (mutated human glucagon-like peptide-1,mGLP-1)对谷氨酸诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞损伤的影响.方法 环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒检测细胞内cAMP含量,比较mGLP-1和天然人胰高血糖素样肽-1 (natural human glucagon-like peptide-1,nGLP-1)与GLP-1受体结合的能力;以谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞损伤,同时用mGLP-1处理SH-SY5Y细胞,采用MTT法检测细胞存活率；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞LDH的释放量；DAPI染色法观察细胞凋亡形态学特征；钙流法检测胞内钙离子浓度变化；通过检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、总谷胱甘肽(total GS)含量的变化判断细胞氧化损伤程度.结果 mGLP-1与nGLP-1类似,都能提高细胞内cAMP水平；mGLP-1能缓解谷氨酸诱导的细胞损伤,增加细胞存活率,降低LDH释放量；mGLP-1对谷氨酸导致的细胞内钙离子变化没有修复作用；mGLP-1能抑制氧化损伤指标MDA含量升高,促进抗氧化系统指标SOD活性增强和total GS含量增加.结论 mGLP-1可导致细胞内cAMP含量增加.mGLP-1对谷氨酸所致神经细胞损伤具有保护作用,这可能是mGLP-1通过对神经细胞的抗氧化损伤作用实现的,而不是改善谷氨酸导致的钙稳态失衡.mGLP-1的保护作用与nGLP-1类似,而mGLP-1在体内稳定性更强,半衰期更长；提示mGLP-1可能对相关神经退行性疾病的治疗具有更佳的潜在价值.
关键词： 谷氨酸中毒 突变型人胰高血糖素样肽-1 胞内钙离子 氧化损伤 神经母细胞瘤细胞 -
段树民院士团队在《自然》子刊发文阐述小胶质细胞迁移方法
近日，浙江大学医神经医学研究所段树民院士团队在《自然：科学实验报告》（ Nature Protocols ）上发表了题为“Analysis of microglial migration by a micropipette assay”的论文（ http：／／www．nature．com／nprot／journal／v9／n2／full／nprot．2014．015．html），阐述了离体培养小胶质细胞的迁移方法。
小胶质细胞是中枢神经系统中固有的免疫细胞，在维持大脑微环境的稳定中发挥重要作用。当大脑出现病变或损伤时，病灶周围的小胶质细胞会迅速活化，并快速向病损区迁移，及时吞噬清除坏死组织或病原体。小胶质细胞的趋向性迁移是它们产生免疫反应及行使功能的重要基础和前提。为了建立一套简便可行、适用于体外小胶质细胞迁移的方法，课题组成员借鉴了神经元轴突转向实验的方法，应用特制玻璃电极向体外培养的小胶质细胞脉冲式注射趋化因子，模拟大脑病损时的释放状态，在短时间内形成一定浓度梯度，进而诱导周围小胶质细胞向趋化因子释放中心迁移。结合显微实时成像，该法不仅可直接记录细胞迁移的动态过程，而且还可用于观察细胞迁移过程中亚细胞器、胞内钙离子等的同步变化。该法无需复杂仪器系统和昂贵耗材，且适用于研究其他细胞类型如肿瘤细胞、淋巴细胞等的迁移活动。 -
植物雌激素α-玉米赤霉醇对(-)BayK8644诱发的兔主动脉平滑肌细胞胞内游离钙离子浓度升高的抑制作用
α-玉米赤霉醇(α-Zearalanol,α-ZAL)是冬小麦春化的关键物质并是植物中普遍存在的内源性激素玉米赤霉烯酮(zearanone,ZEN)的还原产物,具有类雌激素样效应[1],并比雌激素安全[2].本课题组于1996年首次将其作为植物雌激素引进医学研究领域并开始α-ZAL防治动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的研究.
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黄芩苷诱导Jurkat T细胞凋亡的体外研究
目的:研究黄芩苷(BA)抑制Jurkat T细胞(人T淋巴细胞白血病细胞株)的生长和诱导其凋亡的作用及机制.方法:以噻唑兰(MTF)比色法测定BA对细胞生长的抑制率;胞内[Ca2+];和线粒体跨膜电势(△ψm)分别用Fluo-4/AM和ViOC6(3)荧光探针标记,流式细胞仪检测;PI染色流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率;凋亡细胞形态以Hoechst33342/PI染色后荧光显微镜观察.结果:BA明显抑制Judmt细胞增殖(P<0.01),并呈时间、浓度依赖性;BA可浓度依赖的诱导Jurkat细胞[Ca2+];浓度上升、线粒体膜电势△ψm降低,将细胞周期阻滞在S期,凋亡率增加,荧光显微镜下可见经BA(100 mg/L)作用的细胞呈现典型的凋亡校圊缩表现,胞核呈致密浓染的颗粒状荧光.结论:BA体外显著抑制Jurkat T细胞增殖及诱导其凋亡,其机制可能与胞内[Ca2+].及线粒体依赖的凋亡通路有关.
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N-型神经系统电压依赖性钙通道在脊髓痛觉传递及调控中的作用研究
钙离子作为机体内重要的信使物质,广泛参与各种生命活动的调节.胞内钙离子浓度的升高在神经系统的很多过程中都发挥着重要的作用,例如递质在突触部位的释放、神经元兴奋性的调节、激素的分泌及突触可塑性和基因转录[1]等过程.神经系统电压依赖性钙通道(Volrage-dependent calcium chan-nels,VDCCs)是胞内钙离子浓度升高的途径之一,根据药理和生理特性分为L-、N-、T-、P/Q-及R-型等,各自有其不同的生物学功能.
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Ryanodine受体活性的蛋白质调控研究新进展
钙离子是细胞内重要的第二信使之一,机体的每种活动都与钙离子息息相关,如神经肌肉兴奋性的维持、心脏跳动、大脑信息的处理等.正常情况下,胞内钙离子是处于稳态平衡的,一旦严重失去平衡,机体就会趋向死亡,所以钙信号是生存和死亡的信号.胞内钙离子的平衡是胞内钙库对钙离子释放和摄取保持平衡的结果.Ryanodine受体(RYR)是一类主要的钙离子释放通道,至少有三种亚型:RYR1(骨骼肌中)、RYR2(心肌中)、RYR3(非肌细胞中).RYR介导的胞内钙库释放钙离子对保持胞内钙的平衡起着重要作用.自从RYR发现以来,其性质和功能的研究一直是生命科学研究的热点.研究发现:RYR的活性受到多种物质的调控,诱导胞内钙库释放、升高胞内钙浓度、激发钙火花,对钙激活钾通道的开放、兴奋收缩藕联等多种生理功能的完成有重要意义.RYR的活性受到许多小分子物质(如[Ca2+]、[Mg+]、NO、咖啡因等)和一些大分子物质如蛋白质的调控.而蛋白质对RYR调控的研究是目前研究的热点.本文就与RYR活性调控相关的几种蛋白的研究进展作一综述.
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整合素VLA-5介导人精子激活作用的研究
目的探讨人精子膜上的整合素VLA-5是否参与了人精子的激活.方法采用整合素VLA-5的特异性配体纤连蛋白(Fn)作用于生育组和不育组人精子,以三色法染色观察Fn作用前后顶体反应(AR)率的变化;预先用Fluo-3/AM负载人精子,用流式细胞仪检测Fn作用前后精子[Ca2+]i荧光强度的变化.结果生育组100 nmol/L的Fn作用于人精子后AR率由8.64%±2.56%增高到16.09%±3.18%(P<0.01),钙离子的荧光强度值由静息状态的5.73±2.45升高到6.61±2.40(P<0.01).不育组Fn作用前后AR率由7.09%±0.94%增高到10.44%±2.30%(P<0.05),钙离子的荧光强度值无显著改变.结论人精子膜上的整合素VLA-5参与了人精子的激活过程.
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血管紧张素Ⅱ对人精子获能的影响
目的:探讨血管紧张素H(angiotensinⅡ,AngⅡ)对不育症精子获能的影响及其可能的作用方式.方法:不同浓度AngⅡ与精子悬液共同孵育,以孕酮诱发顶体反应,采用FITC-PSA法测定细胞内Ca2+荧光强度来检测.结果:在未获能的精子悬液中AngⅡ在10 nmol/L和100 nmol/L时均可明显加速精子获能和增强孕酮诱发的顶体反应(P＜0.05),并可使细胞内Ca2+浓度升高(P＜0.001),Losartan[AngⅡ受体AT1(angiotensinⅡtype 1 receptor)拮抗剂]、EGTA可明显阻断和抑制这些过程.结论:AngⅡ可以促进不育症精子获能,其结果可能是通过AT1受体介导,经改变精子细胞内Ca2+的浓度来实现.
关键词： 血管紧张素Ⅱ(AngⅡ) 不育症 精子 获能 胞内钙离子 -
血管紧张素Ⅱ对人精子顶体反应的影响
目的:探讨血管紧张素II(angiotensinⅡ,AngⅡ)对人精子顶体反应的影响及其可能机制.方法:检测不同浓度AngⅡ诱发的人精子顶体反应率和AngⅡ引起的精子胞内钙离子的变化,以及血管紧张素受体ATl拮抗剂Losartan对其的抑制作用.结果:AngⅡ在l0 nmol/L和l00nmol/L时均可显著增加人精子顶体反应率,并引起精子胞内钙离子短暂快速升高,Losartan可以明显抑制这些过程.结论:AngⅡ可以诱发人精子顶体反应,这一作用可能经ATl受体介导,通过引起精子胞内钙离子升高而实现.
