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氯化铝致神经母细胞瘤细胞不同死亡的方式及意义
目的 研究铝诱导的神经母细胞瘤细胞的死亡方式及途径,探讨其毒理学及在神经细胞退行性变中的意义.方法 用铝染毒神经母细胞瘤细胞株制作铝致神经细胞损伤模型,在铝和Nec-1处理后用光学显微镜观察细胞的生长状况,CCK-8法检测细胞的活力变化,流式细胞仪检测细胞的凋亡率、坏死率、线粒体膜电位和活性氧含量,电子显微镜观察细胞的超微结构变化.蛋白质印迹(Western blot)法检测LC3蛋白表达量.结果 铝染毒神经母细胞瘤细胞形态学观察结果 表明,凋亡与坏死并存于染铝细胞中;流式细胞术定量检测铝染毒后细胞的凋亡率和坏死率均显著升高(P<0.05,P<0.01).超微结构显示有凋亡早期和晚期典型的核凝聚和多量典型双层膜结构的自噬小体.铝染毒SH-SY5Y细胞中加入Nec-1后,可以有效地降低细胞的坏死率(P<0.05,P<0.01),显著降低线粒体的膜电位(P<0.05,P<0.01),有效减少自噬体的形成及发展,且与细胞的自噬过程有关.Western blot结果 显示LC3蛋白表达量随Nec-1(0～90 μmol/L)作用浓度的提高而显著下降(P<0.05,P<0.01).绪论铝诱导的神经母细胞瘤细胞的死亡方式不仅包括传统的凋亡和坏死,自噬和程序性坏死也存在于其中,这可能与铝致神经退行性变的细胞丢失方式有关.
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骨肉瘤干细胞的研究进展
肿瘤干细胞（ tumor／cancer stem cells ）理论认为是肿瘤组织中存在数量极少、具有干细胞特征的细胞亚群，该细胞亚群具有自我更新和分化潜能，可能是肿瘤启动、生长、转移和复发的根源。肿瘤干细胞可以自我克隆形成子代致瘤性干细胞，同时分化出具有不同表型、非致瘤性的肿瘤细胞，后者经过短暂分化终死亡［1］。40多年前，有学者提出组织特异性干细胞是肿瘤发生的起源细胞［2］。20世纪60年代，人们从体外克隆培养获得的具有不同筛选标志的骨髓瘤细胞中发现仅0.01％～1.00％的肿瘤细胞可以形成克隆集落［3］。1971年，Park 等［4］在体内利用脾脏进行骨髓瘤细胞培养时，其克隆集落形成概率也与之相当。20世纪70年代后期，Humburger等［5］发现只有0.02％～0.10％的肺肿瘤、卵巢肿瘤与神经母细胞瘤细胞具有在体外软琼脂培养基上形成克隆集落的能力，由此提出了“肿瘤干细胞”的概念。
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川芎嗪对神经母细胞株SH-SY5Y细胞L型钙通道电流的影响
目的研究川芎嗪对神经母细胞株SH-SY5Y细胞L型钙通道的影响.方法在SH-SY5Y细胞体外培养的基础上,采用全细胞膜片钳技术观察川芎嗪对SH-SY5Y细胞L型钙电流(ICa, L)的作用.结果 (1)川芎嗪能够明显抑制峰值ICa, L,且该作用具有浓度依赖性.(2)川芎嗪使ICa, L的I-V曲线上移,但对其形状无明显影响,并且大激活电位亦基本保持不变.结论川芎嗪对SH-SY5Y细胞L型钙通道具有明显的抑制作用.
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全反式维甲酸对神经母细胞瘤SY5Y细胞增殖的影响
[目的]研究全反式维甲酸(ATRA)对神经母细胞瘤细胞增殖的影响.[方法]神经母细胞瘤细胞SY5Y经全反式维甲酸(ATRA)处理不同时间后(2、4、6d)分别于显微镜下观察细胞形态学改变及使用MTS方法观察细胞增殖情况.对经ATRA处理4d的细胞进行溴脱氧尿苷(Brdu)染色观察DNA合成及利用流式细胞仪进行细胞周期分析.[结果]与对照组比较,SY5Y细胞经ATRA处理4d或6d后于显微镜下可见明显的轴突延伸,MTS方法显示细胞增殖明显降低.ATRA处理4d时Brdu染色显示DNA合成减少,利用流式细胞仪对细胞周期的分析表明细胞被阻滞在G1期.[结论]ATRA可抑制神经母细胞瘤细胞增殖.
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神经母细胞瘤细胞的细胞化学及免疫表型研究
神经母细胞瘤(Neuroblastoma NB)为儿科常见的一种恶性肿瘤,仅次于白血病,居第三位[1].为探讨该细胞的细胞化学和免疫学特征,我们对其进行了细胞化学方面和免疫表型方面的检测,现报告如下.
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不同价态锰对神经母细胞瘤细胞的氧化损伤作用
目的探讨不同价态、不同浓度锰引起神经细胞的脂质过氧化对细胞的损伤作用.方法分别用0,0.25,0.50,0.75 mmol/L二价锰、三价锰对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)染毒24 h,观察测定细胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)、 GSH-Px/MDA及细胞膜脂荧光各向异性的变化.结果二价锰、三价锰染毒各低、中、高剂量组细胞SOD活力[(522.12±57.74),(498.38±37.29),(464.86±24.09)和(499.79±30.86),(477.23±61.66),(435.95±74.04)NU/mg蛋白]与对照组[(861.24±35.74)NU/mg蛋白]比较明显降低,差异有显著性(P＜0.05); GSH-Px活力[(19.04±5.16),(17.74±5.91),(15.99±5.62)和(16.58±6.19),(15.79±7.29),(14.23±5.20)活力单位]均较对照组[(29.23±7.83)活力单位]降低,差异有非常显著性(P＜0.01); GSH-Px/MDA较对照组降低,差异有显著性(P＜0.05), 而MDA和细胞膜脂荧光各向异性有所升高(P＜0.05); 相同染毒剂量情况下,三价锰组上述指标的变化比二价锰组明显.结论锰通过抑制SOD、GSH-Px活力,降低细胞抗氧化能力,造成细胞膜功能的损伤.三价锰对细胞的氧化损伤比二价锰严重.
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活性氧对神经母细胞株SH-SY5Y细胞L型钙通道电流的影响
目的探讨氧自由基导致神经元钙超载的发生机制.方法在神经母细胞株SH-SY5Y细胞体外培养的基础上,采用全细胞膜片钳技术,观察H2O2对SH-SY5Y细胞L型钙电流(ICa,L)的影响.结果 (1)H2O2能够明显增加峰值ICa,L,且该作用具有浓度依赖性.(2)H2O2使ICa,L的I-V相关曲线下移,但对其形状和大激活电位无明显影响.结论 H2O2对L型钙通道有明显的增强作用,此可能是其导致神经元钙超载的机制之一.
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SH-SY5Y神经细胞APP高表达对胆碱酯酶活性影响
目的 研究类阿尔茨海默病(AD)神经细胞模型中APP异常代谢下胆碱酯酶活性变化,探讨AD的发病机制.方法 采用脂质体转染法将含有瑞典家族性AD双突变的淀粉样蛋白前体蛋白APP670/671基因(APP_(SWE))转染至神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中;利用实时荧光定量PCR方法和Western blotting的方法测定APP mRNA、可溶性APP(αAPPs)和总APP蛋白表达水平;采用改进的Ellman比色法测定细胞培养基中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BuChE)活性.结果 转染APP_(SWE)质粒的SHSY5Y细胞APP总mRNA和蛋白表达水平显著升高,αAPPs分泌量下降.转染组SH-SY5Y细胞与对照组相比,AChE和BuChE活性都升高.结论 体外神经细胞实验证明APP蛋白过度表达能升高AChE和BuChE的活性,其机制可能与APP蛋白代谢紊乱使A13升高及下调αAPPs分泌有关.
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维甲酸对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞形态结构和分化标志物表达的影响
目的:观察维甲酸对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞形态与超微结构及其相关标志物表达的影响,以鉴定其对神经母细胞瘤细胞终末分化的诱导作用.方法:1μmol/L维甲酸处理SK-N-SH细胞,光镜、电镜和免疫细胞化学检测研究SK-N-SH细胞处理前后细胞形态、超微结构变化和神经元相关标志物的表达变化.结果:光镜与电镜观察结果显示,SK-N-SH细胞经1μmol/LRA处理后,细胞形态和超微结构产生了细胞呈极性状、伸出多个轴突树突状突起、细胞逐渐变小变圆并融合在一起形成类似神经节样结构、细胞表面微绒毛减少、核仁变少变小、常染色质增多、细胞器丰富发达等显著变化;免疫细胞化学检测显示经RA处理后SK-N-SH细胞NSE,MAP2,Synaptophysin的表达较对照组细胞明显加强.结论:维甲酸能改变SK-N-SH细胞形态和超微结构恶性表型特征,并促进与神经细胞相关的终末分化指标的表达,从而对人神经母细胞瘤细胞的终末分化具有显著的诱导作用.
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脑源性神经营养因子对无血清培养的神经元保护机制的研究
目的 探讨在无血清培养条件下脑源性神经营养因子(BDNF)对神经元样细胞存活的影响及其作用机制.方法 在无血清条件下培养具有BDNF受体TrkB表达的神经母细胞瘤细胞SY5Y-TrkB,在培养液中单独加入BDNF,或联合加入磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂/丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂进行细胞培养,利用细胞活性测定法(MTS)检测活细胞活性.结果 与在10%胎牛血清(FBS)培养液中培养的细胞相比,无血清条件下培养24、48 72 h后,SY5Y-TrkB细胞的存活率分别为51%、38%、25%.若细胞在无血清条件下培养24 h,无处理因素的细胞存活率设定为100%,给予BDNF后的细胞存活率为154%;用10μmol/L PI3K抑制剂LY294002预处理1 h,再给予BDNF后的细胞存活率为100%;而应用80 tmol/LMAPK抑制剂PD98059预处理1 h,再给予BDNF后的细胞存活率为158%.结论 BDNF通过PI3K信号通路保护SY5Y-TrkB细胞免受无血清培养引起的细胞死亡.
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突变型人胰高血糖素样肽-1对神经细胞损伤的保护
目的 研究突变型人胰高血糖素样肽-1 (mutated human glucagon-like peptide-1,mGLP-1)对谷氨酸诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞损伤的影响.方法 环磷酸腺苷(cAMP)试剂盒检测细胞内cAMP含量,比较mGLP-1和天然人胰高血糖素样肽-1 (natural human glucagon-like peptide-1,nGLP-1)与GLP-1受体结合的能力;以谷氨酸诱导SH-SY5Y细胞损伤,同时用mGLP-1处理SH-SY5Y细胞,采用MTT法检测细胞存活率；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞LDH的释放量；DAPI染色法观察细胞凋亡形态学特征；钙流法检测胞内钙离子浓度变化；通过检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、总谷胱甘肽(total GS)含量的变化判断细胞氧化损伤程度.结果 mGLP-1与nGLP-1类似,都能提高细胞内cAMP水平；mGLP-1能缓解谷氨酸诱导的细胞损伤,增加细胞存活率,降低LDH释放量；mGLP-1对谷氨酸导致的细胞内钙离子变化没有修复作用；mGLP-1能抑制氧化损伤指标MDA含量升高,促进抗氧化系统指标SOD活性增强和total GS含量增加.结论 mGLP-1可导致细胞内cAMP含量增加.mGLP-1对谷氨酸所致神经细胞损伤具有保护作用,这可能是mGLP-1通过对神经细胞的抗氧化损伤作用实现的,而不是改善谷氨酸导致的钙稳态失衡.mGLP-1的保护作用与nGLP-1类似,而mGLP-1在体内稳定性更强,半衰期更长；提示mGLP-1可能对相关神经退行性疾病的治疗具有更佳的潜在价值.
关键词： 谷氨酸中毒 突变型人胰高血糖素样肽-1 胞内钙离子 氧化损伤 神经母细胞瘤细胞 -
人β3-AR和PPAR-γ2基因真核表达载体及β3-AR稳定表达细胞株的构建
目的 构建高效表达人β3-肾上腺素受体(hβ3-AR)的真核细胞表达载体,为进一步研究hβ3-AR的功能以及与过氧化物酶体增殖体激活受体-γ2 (PPAR-γ2)调控基因之间的相互影响奠定基础.方法 从人肾旁脂肪组织提取总RNA,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法扩增hPPAR-γ2、hβ3-AR cDNA全长序列.将EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后的hβ3-AR cDNA与同样进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切的pcDNA 3.1(+)载体连接形成重组载体pcDNA 3.1(+)/hβ3-AR.将XbaⅠ和AflⅡ双酶切后的hPPAR-γ2 cDNA与同样进行XbaⅠ和AflⅡ双酶切的pcDNA 3.1(+)载体连接形成重组载体pcDNA 3.1(+)/hPPAR-γ2.通过限制性内切酶酶切鉴定后对DNA序列进行测序,鉴定重组质粒中hβ3-AR和hPPAR-γ2基因的完整性和可靠性.运用定点诱变方法,对野生型hPPAR-γ2和hβ3-AR质粒进行定点诱变,构建Pro12Ala突变的hPPAR-γ2和Trp64Arg突变的hβ3-AR的pcDNA 3.1(+)载体,电穿孔法将人hβ3-AR重组表达载体pcDNA 3.1(+)/hβ3-AR(突变型和野生型) 转染到SH-SY5Y细胞中,用G418筛选获取稳定转染细胞株,并用RT-PCR、Western blot方法进行鉴定.结果 酶切和测序分析显示重组质粒构建正确,并在转染的SH-SY5Y细胞中获得hβ3-AR的高效表达.结论 成功克隆了人PPAR-γ2、β3-AR基因全长cDNA,并成功构建了人野生型和突变型的hPPAR-γ2和hβ3-AR的真核表达重组体[pcDNA 3.1(+)/hPPAR-γ2和pcDNA 3.1(+)/hβ3-AR].成功获得了稳定表达hβ3-AR基因的SH-SY5Y细胞株.
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人SUMO病毒载体构建及稳转神经母细胞瘤SHSY5Y细胞系的建立
目的 构建表达人小泛素化相关修饰蛋白(SUMO)基因的逆转录病毒载体,并观察其稳定感染神经母细胞瘤SHSY5Y细胞后SUMO蛋白的表达情况.方法 用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切peDNA 3.0-HA-SUMO1、pcDNA 3.0-HA-SUMO2、pcDNA3.0-HA-SUMO3质粒,得到3×Flag-SUMOs基因的编码序列,定向插入到pBabe-puro载体中,经扩增、筛选阳性克隆、酶切和测序验证后,转染293T细胞进行病毒包装、扩增、纯化获取逆转录病毒颗粒.将逆转录病毒颗粒感染SHSY5Y细胞,经嘌呤霉素筛选后抗性克隆集落长出.Western blot检测稳定转染的pBabe-3 ×Flag-SUMOs-SHSY5Y单克隆细胞SUMO1～3的表达.结果 pBabe-3×Flag-SUMOs-puro质粒构建正确.稳定转染的SHSY5Y细胞系3×Flag-SUMOs表达明显增强.结论 成功构建了稳定表达SUMO的pBabe-3 × Flag-SUMOs-SHSY5Y细胞系.
关键词： 小泛素化相关修饰蛋白 逆转录病毒 神经母细胞瘤细胞 -
化疗后原代神经母细胞瘤细胞对阿霉素敏感性的改变
随着阿霉素治疗神经母细胞瘤化疗的进行,疗效有所降低,是否产生耐药,报道甚少.本试验旨在探讨化疗前后神经母细胞瘤细胞对阿霉素敏感性的改变及维拉帕米对阿霉敏感性的影响.
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灯盏细辛活性部位对神经细胞α3尼古丁受体蛋白水平的影响
目的 研究灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同活性部位对神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中尼古丁乙酰胆碱能受体 (Nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)蛋白水平的影响及其对抗β-淀粉样蛋白(Aβ) 细胞毒性的作用机制,以探讨其在阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease,AD) 治疗中的作用.方法 选用一定浓度的灯盏细辛不同部位及Aβ_(25~35)处理SH-SY5Y细胞,用比色法测定培养细胞MTT还原率,蛋白质印迹法测定尼古丁受体α3亚单位蛋白水平.结果 灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物不同部位中,经凝胶柱分离的第一区段、该区段经反相硅胶柱分离的低极性部位及乙酸乙酯萃取后再以正丁醇获得的萃取物,经凝胶柱分离的第四区段经反相硅胶柱分离出的低极性部位能上调SH-SY5Y细胞中α3nAChR 蛋白水平;同时能减弱Aβ_(25~35)的细胞毒性作用.结论 灯盏细辛醇提取乙酸乙酯萃取物分离部位可能是中药灯盏细辛的重要的活性部位,在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用.
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p27KIP1基因表达对神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响及意义
细胞增殖失控或/和凋亡受抑与肿瘤的发生发展关系密切.
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人类神经母细胞瘤细胞的多药抗药性
神经母细胞瘤(NB)是小儿肿瘤中尚待解决的难题,尽管经手术加化疗后,能使65%患儿获得缓解,但仍因肿瘤复发、转移而死亡.问题之一是初期对化疗敏感的神经母细胞瘤在治疗期间产生抗药性,导致治疗失败.现已克隆出能导致瘤细胞对多种化疗药物抗药的"多药抗药性基因"(Multidrug-resistance gene).
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肉苁蓉对抗β-淀粉样肽神经细胞的毒性作用研究
目的:研究中药肉苁蓉对神经母细胞瘤细胞烟碱型乙酰胆碱受体表达的影响及其对抗β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制,以探讨其在阿尔茨海默病(alzheimer's disease,AD)治疗中的作用.方法:比色法测定细胞MTT还原率筛选肉苁蓉安全浓度范围,并用Aβ(25-35)处理细胞后,测定MTT还原率,蛋白质印迹法(Western blotting)测定烟碱型乙酰胆碱受体α3、α7蛋白表达的变化;TBA比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平.结果:肉苁蓉能提高细胞α3及α7烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白质表达水平;并能对抗Aβ(25-35)引起的α3和α7受体亚单位蛋白质水平降低;同时能减弱Aβ(25-35)引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高.这些作用随浓度的增加而增强.结论:肉苁蓉能上调烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白表达水平,且能对抗Aβ(25-35)的神经毒性作用,在AD的治疗中可能起到一定作用.
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海康灵各组分抗神经细胞损伤有效部位和有效剂量的研究
目的:通过比较海康灵复方中单味药对过氧化氢(H2O2)诱导SH-SY5Y神经细胞损伤的保护作用,筛选更为理想的量效关系.方法:采用体外细胞培养的方法,复制神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞H2O2损伤模型.通过MTT法测定细胞存活率,检测海康灵复方中单味药与复方对SH-SY5Y细胞损伤的保护作用.结果:根据佳有效剂量组建的海康灵新复方(浓度为0.159 g·mL-1)同单味药与原复方比较,能减轻H2)2引起的SH-SY5Y细胞的损伤,明显提高细胞的存活率.结论:海康灵新复方对H2O2诱导的sH-SY5Y细胞损伤具有明显的保护作用.
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灯盏乙素对神经母细胞瘤细胞中β-淀粉样蛋白生成的影响
目的 观察灯盏乙素(Scutellarin,Scu)对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞中β淀粉样蛋白(β-Amyloid peptide,Aβ)生成的影响,探讨其针对阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease,AD)发挥的防治作用.方法 将SH-SY5Y细胞分为对照组、Aβ处理组和Aβ+ Scu处理组,用CCK-8试剂盒测定细胞存活率;分别用免疫组织化学法、蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞Aβ1-42、β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)、APP切割酶1(β-Site APP-leavingnzymes1,BACE1)、APP切割酶2(β-Site APP-leavingnzymes2,BACE2)的表达.结果 与对照组相比,Aβ处理组的细胞存活率下降,Aβ1-APP、APP、BACE1蛋白和mRNA的表达水平增高,BACE2蛋白和mRNA的表达水平下降,Scu干预后,各检测指标的变化与Aβ处理组的结果正好相反.结论 Scu能够影响Aβ生成相关因子的表达,可能通过减少Aβ的沉积在AD防治中发挥积极作用.
