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JNK信号通路在异烟肼诱导L-02细胞凋亡中的作用及槲皮素干预作用
目的 探讨JNK信号通路在INH诱导L-02细胞凋亡中的作用及槲皮素的干预作用.方法 建立INH肝细胞L-02损伤模型,实验分为未处理对照组、INH模型组、槲皮素低剂量及高剂量组.应用MTT法检测L-02细胞存活率,利用Hoechst 33258荧光染色法评价细胞凋亡情况,采用Western blot法检测细胞中Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9和JNK蛋白的表达.结果 与未处理对照组相比,INH模型组细胞存活率明显降低,细胞凋亡率明显增高,细胞中Bcl-2蛋白表达明显降低,而Bax、Caspase 3、Caspase 9和p-JNK蛋白表达明显增加.槲皮素能明显增加细胞存活率,明显降低了细胞的凋亡率,槲皮素高剂量组细胞Bcl-2蛋白表达明显增高,而Bax、Caspase 3、Caspase 9和p-JNK蛋白表达明显减少.结论 JNK信号通路在INH诱导L-02细胞凋亡中发挥了重要作用;槲皮素对INH诱导L-02细胞凋亡有保护作用,可能与其调节凋亡相关蛋白的表达,抑制JNK信号通路有关.
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蛋白激酶Cα对人正常肝和肝癌细胞周期及G1期相关调控因子cyclinD1、cyclinE的影响
目的探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对人正常肝和肝癌细胞周期的作用和对G1期相关调控因子的影响. 方法通过细胞转染技术将PKCα cDNA正向插入的真核表达质粒PXJ41-PKCα导入正常肝细胞(L-02),并利用本室已构建的表达反义PKCα的BEL-7402细胞(HT6)检测细胞的生长曲线,细胞周期以及细胞对G1期相关调控因子cylinD1和cyclinE的影响. 结果构建了稳定过表达PKCα的人正常肝细胞模型(LT3),过表达PKCα可促进L-02细胞增殖,促进细胞由G1期向S期的过渡;cyclinD1和cyclinE的蛋白水平上升,反之表达反义PKCα的BEL-7402细胞(HT6)增殖被抑制,阻抑细胞由G1期向S期的过渡,cyclinD1和cyclinE的蛋白水平下降. 结论从正反两个方面表明,PKCα可通过作用于G1期相关周期蛋白的水平影响G1/S期的进程.
关键词： 蛋白激酶Cα L-02细胞 Bel-7402细胞 细胞周期 G1期相关调控蛋白 -
软脂酸对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞的作用及机制
目的:探讨不同浓度的软脂酸对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞的作用及机制.方法:体外培养人正常肝细胞株L-02,设立空白对照组、酒精诱导组及软脂酸干预组.软脂酸干预组设6个浓度梯度(2.5、5、10、20、30、40 μmol/L),空白对照组用正常培基培养96 h,酒精诱导组和软脂酸干预组在细胞培养24 h后加入终浓度为60 mL/L的无水乙醇,继续培养24 h后,软脂酸干预组加入各浓度软脂酸.采用MTT法测细胞增殖,油红O染色观察细胞内脂滴形成情况,试剂盒检测细胞内三酰甘油的含量,Western blot法测定细胞核内成熟的固醇调节元件结合蛋白-1c(nSREBP-1c)的含量.结果:60 mL/L的无水乙醇培养L-02细胞72 h成功建立了脂肪变性模型,软脂酸干预后,软脂酸浓度≤10 μmol/L时,软脂酸明显地促进酒精诱导的脂肪变性肝细胞的增殖（P＜0.05）,并且明显地减轻细胞内脂滴的形成,减少细胞内三酰甘油的含量和细胞核内nSREBP-1c的含量,并呈现出剂量效应关系;而软脂酸浓度≥20 μmol/L时,明显地抑制酒精诱导的脂肪变性肝细胞的增殖（P＜0.05）,并且加重细胞内脂滴的形成,增加细胞内三酰甘油和细胞核内nSREBP-1的含量（P＜0.05）,呈现出对酒精诱导的脂肪变性肝细胞的损害作用.结论:在一定浓度范围内,软脂酸对酒精诱导的脂肪变性肝细胞有防治作用,但超过此范围时,却反过来加重肝细胞的脂肪变性.推测软脂酸对酒精诱导的脂肪变性肝细胞的影响与调节肝细胞核内nSREBP-1c有关.
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亚硝酸钠增强自噬减轻肝脂肪变性的细胞脂肪蓄积
近发现抑制自噬会加重肝细胞内脂肪蓄积,亚硝酸盐可以降低高脂饲养小鼠体内甘油三酯含量.因此,本实验目的在于观察亚硝酸盐对单纯性肝细胞脂肪变性的影响和自噬在其中的可能作用.首先用1.2 mmol.L-1油酸诱导人肝细胞系L-02细胞24 h建立肝细胞脂肪变性模型,再用0.2 mmol·L-1亚硝酸钠加或不加三甲基腺嘌呤(3-MA)或氯喹处理24 h.肝细胞脂质蓄积评价采用油红O染色和细胞内甘油三酯含量测定.1.2 mmol·L-1油酸诱导人肝细胞系L-02细胞24 h可以导致肝细胞明显的脂肪变性.用0.2 mmol·L-1亚硝酸钠处理L-02肝脂肪变性的细胞,可以明显减少肝细胞脂质蓄积,而3-MA可以减弱亚硝酸钠的这种效应;LC3-Ⅱ免疫荧光、Western blot结果显示,亚硝酸钠促进L-02脂肪变性细胞LC3-Ⅱ荧光颗粒和蛋白表达增加,氯喹同样可以增加这种现象;相差显微镜下显示细胞内空泡增多,溶酶体示踪剂荧光显微镜下发现,细胞溶酶体数量增多;电镜显示自噬溶酶体数量增加,氯喹可以减弱这种现象.这些结果表明,亚硝酸钠能够促进肝脂肪变性的L-02细胞自噬,促进脂质分解,减轻肝脂肪变性细胞脂质蓄积.
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L－02细胞中3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶 A还原酶活性检测方法的建立及应用
目的：建立L－02细胞中3－羟基－3－甲基戊二酰辅酶A（ HMG－CoA）还原酶活性的检测方法。方法色谱柱：C18色谱柱，流动相：甲醇－水（20μmol? L－1磷酸二氢钾，pH 7．2）＝6∶94，检测波长：340 nm，柱温：25℃，流速：1 mL? min－1。考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率、稳定性。结果还原型辅酶Ⅱ线性范围为2．5～1000μmol? L－1，定量下限为0．5μmol? L－1，日内、日间 RSD 分别在（5～6）％和（4～8）％内，相对回收率在（96．97～99．57）％内。结论建立的L－02细胞中HMG－CoA还原酶活性检测方法符合实验要求，且可用于测定氟伐他汀对L－02细胞HMG－CoA还原酶活性的抑制作用。
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柴胡皂苷b2通过抑制线粒体凋亡通路减轻过氧化氢诱导的L-02细胞损伤
目的 探讨柴胡皂苷b2(SS-b2)对过氧化氢(H2O2)诱导的L-02细胞损伤的保护作用及其可能的作用机制.方法 将L-02细胞分为正常对照组、模型组(H2O2100μmol·L-1孵育12 h)和SS-b2组(SS-b212.5,25,50和100 mg·L-1孵育24 h后,再加入H2O2继续孵育12 h).MTT法检测L-02细胞存活率;罗丹明123染色检测L-02细胞线粒体膜电位变化;Hoechst33258荧光染色法和流式细胞术检测L-02细胞凋亡;Western蛋白印迹法检测线粒体凋亡通路蛋白Bcl-2、Bax、细胞色素c(Cyt-c)、胱天蛋白酶9和3表达水平.结果 与正常对照组相比,模型组细胞存活率显著降低(P<0.01);细胞线粒体膜电位水平降低(P<0.01)且细胞凋亡率显著增加(P<0.01);Bax(P<0.01)、Cyt-c(P<0.01)、胱天蛋白酶9(P<0.05)和3(P<0.05)蛋白表达水平显著升高,而Bcl-2蛋白水平显著降低(P<0.01).与模型组相比,SS-b2各浓度组细胞存活率显著升高(P<0.05,P<0.01),且呈浓度依赖性(r=0.9804,P<0.05);线粒体膜电位水平升高(P<0.01);Hoechst染色和流式细胞检测结果均显示,细胞凋亡率明显降低(P<0.05,P<0.01);Bax、Cyt-c、胱天蛋白酶9和3蛋白水平显著下调(P<0.01),且Bcl-2蛋白水平上调(P<0.01).结论 SS-b2可减轻H2O2诱导的L-02细胞损伤,其机制与抑制线粒体凋亡有关.
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纳米锰锌铁氧体颗粒对L-02细胞的氧化损伤作用
目的 探讨磁性锰锌铁氧体纳米颗粒(Mn0.5Zn0.5Fe2O4)对人肝细胞株L-02的毒性作用机制.方法 Mn0.5Zn0.5Fe2O4 800 mg·L-1作用L-02细胞48 h,透射电镜观察细胞形态及超微结构的变化.Mn0.5Zn0.5Fe2O4200,400和800 mg·L-1作用48 h后,检测L-02细胞内丙二醛(MDA)的含量、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽( GSH)的活性；荧光染色观察凋亡细胞形态；流式细胞术检测细胞周期及凋亡；荧光定量PCR仪检测胱天蛋白酶3 mRNA表达.结果 Mn0.5Zn0.5Fe2O4 800 mg·L-1作用48 h后,纳米颗粒进入细胞内,细胞膜发生破损,细胞器消失,染色体异常聚集.与正常对照组比较,Mn0.5Zn0.5Fe2O4 200～800 mg·L-1使细胞内MDA含量逐渐升高,SOD与GSH活性逐渐降低(P＜0.05).Mn0.5Zn0.5Fe2O4可使细胞周期发生改变,G0/G1期细胞百分率有降低的趋势,S期和G2/M期细胞百分率有升高的趋势.Hoechst33258显示明显的细胞凋亡形态.Mn0.5Zn0.5Fe2O4可引起L-02细胞发生剂量依赖性的细胞凋亡,Mn0.5Zn0.5Fe2O4 800 mg·L-1作用48h后,细胞凋亡率达到30.3％,是对照组细胞凋亡率(2.4％)的12.6倍.胱天蛋白酶3 mRNA表达量先增加后降低,但都明显高于正常对照组(P＜0.05).结论 Mn0.5Zn0.5Fe2O4可破坏细胞膜完整性并进入细胞内,诱导细胞发生氧化应激,改变细胞周期,引发细胞凋亡,产生细胞毒性.
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二苯乙烯苷对正常人肝细胞增殖的抑制率及影响因素研究
目的：以L-02细胞为载体，考察不同因素（谷胱甘肽、过氧化氢、温度等）对不同质量浓度的二苯乙烯苷（300μg·mL-1、600μg·mL-1、1200μg·mL-1，分别相当于740μmol·L-1、1480μmol·L-1、2960μmol·L-1）肝细胞增殖抑制率的影响。方法培养的人肝L-02细胞分别给以经不同组合方式（与谷胱甘肽或H2O2组合给药）或不同处理方式（与H2O2组合于不同温度蒸干重溶）处理的二苯乙烯苷，采用MTS法检测二苯乙烯苷对人肝L-02细胞的吸光度，并通过公式计算抑制率，比较各组抑制率差异值。结果低浓度二苯乙烯苷（300μg·mL-1）对肝细胞增殖几乎无抑制作用；中浓度（600μg·mL-1）呈现一定抑制作用，加入谷胱甘肽（GSH）后抑制作用消失；高浓度二苯乙烯苷（1200μg·mL-1）随着GSH加入量的增加，抑制率显著下降，与阳性对照药野百合碱（MCT）（1600μg·mL-1，相当于4.92×103μmol·L-1）表现一致。二苯乙烯苷3个浓度对肝细胞增殖的抑制率（6%、25%和82%）有显著性差异，而加入不同体积分数的H2O2（0.5%和1%）对抑制率的影响变化不大。二苯乙烯苷经水溶解并于不同温度（常温、50℃和90℃）及pH 3条件下蒸干，所得样品对L-02细胞增殖的抑制率与未经处理的二苯乙烯苷组比较，没有明显变化。结论二苯乙烯苷在一定浓度范围内对肝细胞增殖有不同程度的抑制作用，且该作用与氧化或水解关系不大，具体机制有待进一步研究。
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细脚拟青霉多糖对乙醇诱导L-02细胞损伤的保护作用研究
目的 探讨细脚拟青霉多糖(PtPs)对乙醇诱导肝细胞损伤的体外保护作用.方法 采用RT-PCR分别检测乙醇诱导损伤的乙醇组、PtPs处理组(PtPs+乙醇)及正常对照组L-02细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA和热休克蛋白90(HSP90)mRNA的表达;检测细胞培养上清液中黄嘌呤氧化酶(XOD)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)活性及丙二醛(MDA)含量;检测细胞匀浆中三磷酸腺苷酶(ATPase)活性,并对各组细胞进行Annexin-FITC标记染色观察凋亡细胞情况.结果 与乙醇组比较,乙醇+PtPs组细胞内TNF-α mRNA表达下降(P＜0.01),HSP90 mRNA表达增加(P＜0.05或P＜0.01);细胞培养上清液中SOD活性升高、XOD及LDH活性下降、MDA含量下降(P＜0.05或P＜0.01);细胞匀浆中ATPase活性上升(P＜0.05或P＜0.01);PtPs处理后可见乙醇诱导的L-02细胞凋亡和坏死被明显抑制.结论 PtPs对乙醇诱导肝细胞的损伤具有保护作用.
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槟榔碱对L-02细胞损伤的研究
目的 探讨槟榔碱对L-02细胞损伤及其可能的作用机制.方法 将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、3、9、18、36、75、150、300 mg/L槟榔碱溶液培养24 h,检测细胞活性、乳酸脱氢酶(LDH)漏出情况和丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活力及线粒体膜电位.结果 与对照组比较,仅150、300 mg/L槟榔碱染毒L-02细胞存活率和线粒体膜电位均较低,而150、300 mg/L槟榔碱染毒L-02细胞的LDH漏出率和AST活力及300 mg/L槟榔碱染毒L-02细胞的ALT活力均较高,差异有统计学意义(P＜0.05);且随着槟榔碱染毒剂量的升高,L-02细胞存活率和线粒体膜电位呈下降趋势,而LDH漏出率及ALT、AST活力均呈上升趋势.结论 槟榔碱可能通过损伤细胞膜而对L-02细胞产生毒性.
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氧化应激在全氟辛烷磺酰基化合物诱导人胚胎肝细胞凋亡中的作用
目的 探讨全氟辛烷磺酰基化合物(PFOS)致人胚胎肝(L-02)细胞凋亡的作用及其机制.方法 将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、50、100、150、200 μmol/L的PFOS溶液培养24 h.采用MTT法检测细胞活性,采用流式细胞术检测细胞凋亡率,并测定细胞线粒体内活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的水平及线粒体膜电位,采用qRT-PCR法检测凋亡相关基因caspase-3、caspase-9、bax、bcl-2 mRNA的表达水平.结果 与对照组比较,150、200μmol/L PFOS染毒L-02细胞的存活率均降低,而100、150、200 μmol/L PFOS染毒组L-02细胞的凋亡率均增加,差异均有统计学意义(P＜0.05);且随着PFOS染毒浓度的升高,L-02细胞的存活率呈下降趋势,而凋亡率呈上升趋势.与对照组比较,各浓度PFOS染毒组L-02细胞内ROS和MDA水平均增加,而各浓度PFOS染毒组L-02细胞内SOD水平和100、150、200 μmol/L PFOS染毒组L-02细胞内GSH水平和线粒体膜电位均较低,差异均有统计学意义(P＜0.05);且随着PFOS染毒浓度的升高,L-02细胞内ROS和MDA水平均呈上升趋势,而SOD、GSH水平和线粒体膜电位均呈下降趋势.与对照组比较,各浓度PFOS染毒组L-02细胞中caspase-3、caspase-9、Bax mRNA的表达水平均较高,而bcl-2、bcl-2/bax值均较低,除50 μmol/L PFOS染毒组caspase-9外,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在本实验剂量下,PFOS暴露可引起L-02细胞凋亡,其机制与PFOS诱导的氧化损伤和线粒体凋亡途径有关.
关键词： 全氟辛烷磺酰基化合物 L-02细胞 细胞凋亡 氧化应激 -
c-jun末端激酶在亚砷酸钠致人胚胎肝细胞损伤中的表达
目的 探讨亚砷酸钠染毒对人胚胎肝(L-02)细胞中c-jun末端激酶(JNK)的变化.方法 将处于对数生长期的L-02细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、50、100、150 μmol/L的亚砷酸钠溶液中培养24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞生长情况,采用流式细胞术检测染毒24 h时的细胞周期及细胞凋亡率;采用蛋白杂交(Western-blot)法检测JNK及p-JNK的蛋白表达水平.结果 与对照组相比,各浓度亚砷酸钠染毒组L-02细胞的存活率及G0-G1期构成比均较低,JNK、p-JNK的蛋白表达水平和S期构成比及凋亡率均较高;而G2-M期构成比在50 μmol/L亚砷酸钠染毒组较低,在100、150 μmol/L亚砷酸钠染毒组均较高,差异均有统计学意义(P＜0.05).且随着亚砷酸钠染毒浓度的升高,L-02细胞凋亡率及JNK和p-JNK蛋白的表达水平均呈上升趋势,细胞存活率呈下降趋势.结论 亚砷酸钠诱导L-02细胞凋亡可能与JNK及p-JNK表达的增加有关.
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三氯乙酸对L-02细胞DNA甲基化转移酶1蛋白及mRNA表达的影响
目的 探讨三氯乙酸(TCA)染毒对L-02细胞DNA甲基化转移酶1(DNMT1)蛋白及mRNA表达的影响.方法 取处于对数生长期的正常肝细胞(L-02细胞),分别加入含0(对照)、0.1、0.3、0.9 mmo/L TCA的培养液继续培养24、48、72h,同时,设DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷(5-aza-dC,5μmol/L)处理组,TCA-re组(0.9 mmol/L TCA处理后换正常培养基继续培养24 h)和人肝癌(HepG2)细胞组作为对照.检测细胞DNMT1蛋白和mRNA的表达水平.结果 与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-dC处理组、TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,而HepG2细胞组DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异均有统计学意义(P＜0.05).与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均较低,除0.1、0.9 mmol/L TCA染毒48 h外,差异均有统计学意义(P＜0.05).且随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平均呈下降趋势.与0.9 mmol/LTCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1 mRNA的表达水平较高,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,各浓度TCA染毒组及5-aza-dC处理组L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,除0.1 mmol/L TCA染毒24、48 h及0.3mmol/L TCA染毒24 h外,差异均有统计学意义(P＜0.05);而TCA-re组L-02细胞和HepG2细胞组DNMT1蛋白的表达水平均无明显变化.与相同剂量TCA染毒24 h比较,各浓度TCA染毒48、72 h后L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平均较低,差异均有统计学意义(P＜0.05).除TCA染毒24 h时L-02细胞DNMT1蛋白的表达水平随染毒浓度的升高而呈先升高后下降的趋势外,随着TCA染毒浓度的升高和染毒时间的延长,L 02细胞DNMT1蛋白的表达水平均呈下降趋势.与0.9 mmol/L TCA染毒组比较,TCA-re组L-02细胞DNMT1蛋白表达水平较高,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TCA体外染毒可能通过抑制DNMT1的表达维持或者促进细胞的DNA低甲基化状态.
关键词： 三氯乙酸 L-02细胞 DNA甲基化转移酶1 低甲基化状态 -
富勒烯对人胚肝细胞L-02的损伤作用
目的 探讨富勒烯(C60)对人胚肝细胞(L-02)的毒性作用及其可能的作用机制.方法 将L-02细胞液分别暴露于0、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml的C60悬浊液中染毒24 h后,检测细胞内LDH、GSH含量和SOD活力,并比较不加和加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)条件下的细胞存活率.结果 与空白对照组相比,1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml C60单独染毒组细胞存活率较低,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01):且呈现明显的剂量-效应关系.加人抗氧化剂NAC后,1.25、2.5、5、10μg/ml联合染毒组细胞存活率有所上升,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).与空白对照组相比,1.25、5、10、20、40μg/ml C60染毒组LDH活力较高,5、20、40μg/ml C60染毒组SOD活力和10、20、40μg/ml C60染毒组GSH含量降低,差异均有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01).结论 氧化损伤可能是C60对L-02细胞毒性作用的机制之一.
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异甘草酸镁对雷公藤甲素损伤L-02细胞中UGT1A、MRP2蛋白及其mRNA表达的影响
目的 研究异甘草酸镁对雷公藤甲素损伤L-02细胞中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A(UGT1A)和多药耐药相关蛋白2(MRP2)蛋白及其mRNA表达的影响,从药物代谢学方面探讨异甘草酸镁的保肝作用机制.方法 L-02细胞分为空白对照组、雷公藤甲素组、异甘草酸镁组、利福平组,共4组(n=6),空白对照组和雷公藤甲素组仅加入培养基,异甘草酸每组和利福平组分别给予异甘草酸镁、利福平预处理24 h,后3组再加入雷公藤甲素18 h后,用MTT法测定细胞存活率,用Western blot及RT-PCR检测各组细胞中UGT1A、MRP2蛋白及其mRNA表达水平.结果 异甘草酸镁预保护24 h实验组的细胞存活率明显高于雷公藤甲素组(P<0.05);雷公藤甲素组UGT1A、MRP2蛋白及其mRNA表达水平显著低于空白对照组(P<0.05);异甘草酸镁组UGT1A、MRP2蛋白及mRNA表达水平较雷公藤甲素组显著升高(P<0.05);利福平组UGT1A蛋白及mRNA表达水平明显低于异甘草酸镁组(P<0.05),MRP2蛋白及mRNA表达水平与异甘草酸镁组差异无统计学意义.结论 异甘草酸镁可减轻雷公藤甲素对L-02细胞的损伤作用,其机制可能与诱导UGT1A、MRP2的表达有关.
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活性氧、线粒体膜电位在亚砷酸钠诱导凋亡中作用
有研究表明,砷可以引起机体内砷致机体脂质过氧化的产生及抗氧化能力降低,从而造成机体的氧化损伤[1-2].而肝脏是砷主要累及的靶组织[3],但砷对肝细胞的作用特点研究较少.研究提示,活性氧(ROS)和线粒体膜电位(△豰)在细胞凋亡中发挥着重要作用[4-5].为了进一步探讨砷对肝细胞的凋亡作用机制,本研究采用流式细胞仪检测细胞凋亡率和胞浆中ROS、△豰水平,并探讨ROs和△豰在NaAsO2诱导L-02肝细胞凋亡过程中的作用.
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亚砷酸钠对人正常肝细胞L-02活性氧含量和细胞凋亡的影响
目的 研究不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)对人正常肝细胞L-02存活情况、细胞内活性氧(ROS)水平及细胞凋亡的影响.方法 用0(对照组)、50、100、150 μmol/L NaAsO2作用L-02肝细胞24h后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTr)法检测L-02肝细胞存活率,流式细胞仪检测L-02肝细胞内ROS水平和细胞早期(Q4期)、晚期(Q2期)凋亡程度.结果 细胞存活率检测:不同浓度NaAsO2组细胞存活率比较,差异有统计学意义(F=350.51,P＜0.05),其中50、100、150μmol/L NaAsO2组细胞存活率[(87.30±3.74)％、(49.03±4.72)％、(13.44±4.01)％]显著低于对照组[(100.00±0.00)％,P均＜0.05];与50 μmol/L NaAsO2组比较,100、150μmol/L NaAsO2组细胞存活率显著下降(P均＜0.05);与100 μmol/L NaAsO2组比较,150 μmol/L NaAsO2组细胞存活率显著下降(P＜0.05).ROS水平检测:不同浓度NaAsO2组细胞内ROS水平比较,差异有统计学意义(F =407.78,P＜0.05),其中100、150 μmol/LNaAsO2组细胞内ROS水平(3 212.00±22193、5 521.33±179.63)显著高于对照组(1 691.67±73.98,P均＜0.05);与50 μmol/L NaAsO2组(1 927.67±62.45)比较,100、150μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平显著增加(P均＜0.05);与100 μmol/NaAsO2组比较,150 μmol/L NaAsO2组细胞内ROS水平显著增加(P＜0.05).细胞凋亡检测:不同浓度NaAsO2组Q2期(晚期凋亡细胞)、Q4期(早期凋亡细胞)、Q2+ Q4期(总凋亡细胞)细胞凋亡率比较,差异均有统计学意义(F=256.84、26.53、63.89,P均＜0.05),除50 μmol/L NaAsO2组Q4期[(5.43±0.57)％]外,50 μmol/LNaAsO2组[Q2期:(5.67±021)％,Q2+ Q4期:(11.10±0.40)％]、100 μmol/L NaAsO2组[Q2期:(13.60±0.79)％,Q4期:(7.37±2.01)％,Q2+Q4期:(20.97±2.38)％]、150 μmol/L NaAsO2组[Q2期:(13.47±0.78)％,Q4期:(16.97±3.45)％,Q2+Q4期:(30.43±3.84)％]细胞凋亡率均显著高于对照组[Q2期:(3.47±0.12)％,Q4期:(2.90±0.90)％,Q2+Q4期:(6.37±1.00)％,P均＜0.05];与50 μmol/L NaAsO2组比较,100、150 μmol/L NaAsO2组Q2、Q4、Q2+ Q4期凋亡细胞增加,除100 μmol/L NaAsO2组Q4期外,差异有统计学意义(P均＜0.05);与100 μmol/L NaAsO2组比较,150 μmol/L NaAsO2组Q4、Q2+Q4期凋亡细胞均显著增加,差异有统计学意义(P均＜0.05).结论 NaAsO2可以诱导L-02肝细胞内ROS含量增加,推测NaAsO2可通过氧化损伤作用进一步诱导L-02肝细胞发生早期和晚期凋亡,从而抑制L-02肝细胞的生长.
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亚砷酸钠对人正常肝细胞L-02细胞周期蛋白D1和细胞周期依赖激酶4的影响
目的 研究亚砷酸钠(NaAsO2)对人正常肝细胞L-02细胞周期蛋白D1 (Cyclin D1)和细胞周期依赖激酶4(CDK4)表达的影响.方法 以0(对照)、50、100、150 μmol/L NaAsO2处理L-02细胞24 h,采用流式细胞仪检测细胞周期变化,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹检测Cyclin D1、CDK4 mRNA和蛋白表达水平.结果 细胞周期检测:与对照组G0-G1期[(60.33±0.40)％]比较,除50 μmol/L NaAsO2组细胞比例[(54.58±0.40)％]减少外,100、150 μmol/L NaAsO2组细胞比例[(64.60±0.62)％、(83.13±0.25)％]显著增加,差异均有统计学意义(P均＜ 0.05);对照组,50、100、150 μmol/L NaAsO2组S期细胞比例逐渐减少[(34.35±0.30)％、(29.89±0.32)％、(29.50±0.44)％、(11.93±0.12)％],差异均有统计学意义(P均＜0.05);对照组,50、100、150 μmol/L NaAsO2组G2-M期细胞比例[(5.32±0.11)％、(15.54±0.14)％、(5.90±0.20)％、(4.93±0.15)％]比较,差异有统计学意义(F=908.359,P＜0.05).Cyclin D1和CDK4检测:对照组,50、100、150 μmol/NaAsO2组Cyclin D1 mRNA(0.48±0.17、1.00±0.31、1.00±0.21、2.06±0.53)和蛋白(0.65±0.02、0.64±0.05、0.71±0.10、0.84±0.05)表达水平比较,差异均有统计学意义(F=167.886、46.575,P均＜0.05);对照组,50、100、150 μmol/L NaAsO2组CDK4 mRNA(1.04±0.19、1.00±0.21、1.29±0.22、231±0.31)和蛋白(0.67±0.04、0.74±0.03、0.83±0.07、0.94±0.04)表达水平比较,差异均有统计学意义(F=95.171、145.848,P均＜0.05).结论 NaAsO2通过改变细胞周期调控因子Cyclin D1、CDK4 mRNA和蛋白表达水平,使L-02肝细胞的生长周期阻滞于G0-G1期,终导致细胞损害的发生.
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双酚A及纳米二氧化钛对人胚肝L-02细胞内活性氧含量及DNA损伤的联合作用
[目的]观察双酚A(BPA)、纳米二氧化钛(nano-TiO2)单独及联合作用对人胚肝L-02细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量及DNA损伤的影响. [方法] 生长良好的L-02细胞,分别单独加入0.1、1、10 μmol/L的BPA,1、5、10mg/L的nano-TiO2,以及上述各浓度的BPA和nano-TiO2混合染毒24 h;采用流式细胞仪检测各组L-02细胞内ROS含量,采用彗星试验观察各组DNA断裂损伤程度. [结果]10μmol/LBPA单独染毒组,1mg/Lnano-TiO2与1、10 μmol/L BPA,以及5、10 mg/L的nano-TiO2分别与0.1、1、10μmol/L BPA联合作用于L-02细胞后,均可引起ROS含量升高,DNA断裂损伤加重,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P＜0.001);而nano-TiO2单独染毒组对于L-02细胞ROS的升高、DNA损伤作用与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).析因分析结果显示两种受试物混合染毒存在协同作用.[结论]BPA和nano-TiO2联合作用可增加各自对L-02细胞内ROS水平和DNA损伤断裂水平的影响,对细胞的损伤作用增大.
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纳米二氧化钛对氯化镉所致人胚肝L-02细胞毒性作用的影响
[目的]研究纳米二氧化钛(nano-TiO2)对氯化镉(CdCl2)所致人胚肝细胞毒性作用的影响. [方法]不同浓度的CdCl2(0.001、0.01、0.1 μmol/L)单独或与0.01 mg/L nano-TiO2混合后,分别作用干人胚肝L-02细胞24h,观察各组L-02细胞的DNA损伤水平,以及hMsh2基因(hMsh2)、O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖蛋白激酶复合物催化亚基(DNA-PKcs)的mRNA表达水平. [结果]与相应剂量的CdCl2单独染毒组比较,nano-TiO2与各浓度的CdCl2混合染毒组L-02细胞的DNA损伤加重(P＜0.05),hMsh2表达水平明显上升(P＜0.05),MGMT表达水平无显著性变化,nano-TiO2与0.01、0.μmol/L的CdCl2混合染毒组DNA-PKcs的基因表达水平明显上升(P＜0.05).[结论]0.01mg/L的nano-TiO2可以加重各浓度CdCl2对L-02细胞的DNA单链损伤,从而使CdCl2对L-02细胞毒性作用增强.
