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ACTD处理对旁观者V79细胞ROS和细胞色素C分布的影响
目的 观察放线菌素D(actinomycin D,ACTD)处理V79靶细胞获得的条件培养液(conditioned medium,CM)对V79旁观者细胞ROS水平和细胞色素C(Cytochorome C,Cyt C)分布的影响,以研究ACTD诱导旁观者效应发生的可能机制.方法 4.0 mg/L ACTD处理V79靶细胞1h,磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,加入新鲜培养液开始计时,分别在4、8、12和24 h获取靶细胞条件培养液CM.用不同时段CM培养正常V79细胞24 h后,流式细胞仪观察旁观者细胞ROS水平；比色法测定胞浆和线粒体细胞色素C含量.结果 CM处理组旁观者细胞ROS水平均高于对照组,随着时段的延后,ROS水平逐渐降低(P＜0.01),24 h又增加(P＜0.01).对照组线粒体内Cyt C含量高,在各CM处理组旁观者细胞线粒体Cyt C含量均有不同程度下降,4hCM组含量低,随着时段延后,线粒体Cyt C含量增加,但没达到对照组水平,24 h又趋下降.胞浆内Cyt C含量变化趋势与之相反,对照组Cyt C含量低,CM处理组胞浆Cyt C含量增加,4h高随后下降,24 h又明显增加.结论 ACTD诱导旁观者效应可能通过靶细胞的CM影响旁观者细胞ROS的产生,并造成细胞色素C从线粒体释放而引起的.
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放线菌素D对V79靶细胞和旁观者细胞凋亡的影响
目的 用放线菌素D( actinomycin D,ACTD)处理V79细胞后,获取处理后不同时段去细胞培养液( conditioned medium,CM)培养细胞,观察ACTD对靶细胞和旁观者细胞的细胞活力和凋亡的影响,研究ACTD能否诱导旁观者效应的发生,为研究化学物所致的旁观者效应及其机制提供实验依据.方法 用不同剂量ACTD(0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2和6.4 μmol/L)处理V79靶细胞1和4h；选择3.2 μmol/L ACTD作用1h开始计时,分别在4、8、12和24h取靶细胞去细胞培养液(CM),培养正常细胞24 h后,进行旁观者效应的观察.MTT法测定细胞活力；流式细胞仪检测细胞凋亡、坏死率.结果 随着ACTD剂量的增加,靶细胞的活力下降,存在明显的剂量-效应关系(P＜0.05).3.2 μmol/L作用1h细胞活力接近50％且稳定.凋亡率随剂量增加而增加,而作用4h各剂量组凋亡率下降坏死率升高,考虑到足够高的凋亡率又避免损失过多的旁观者因子,故选择3.2 μmol/L作用1h作为处理因素来获取CM.旁观者细胞存活率随着时段的延后增加而凋亡率逐渐下降(P＜0.05),在24 h时段均有一个反弹,但均以4hCM诱导的旁观者效应强.旁观者细胞主要死亡类型是凋亡.结论 ACTD可以诱导旁观者效应的发生,4h无细胞培养液(CM)诱导旁观者细胞损伤的作用强.旁观者细胞死亡以凋亡为主.
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大鼠脑微血管内皮细胞条件培养液对皮层神经元活性的影响以及通络救脑注射液的干预作用
目的:探讨脑微血管内皮细胞条件培养液对神经元活性的影响,以及通络救脑注射液对此过程的干预作用.方法:制备正常、正常用药、拟缺血损伤、拟缺血损伤用药4种脑微血管内皮细胞条件培养液(N-CM、NT-CM、I-CM、IT-CM),分别作用于培养的皮层正常神经元和拟缺血损伤神经元,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法、乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测分析各个条件培养液对神经元活性的影响特征.结果:①N-CM对正常神经元无明显影响,但对拟缺血损伤的神经元表现出一定的保护作用,尤其是NT-CM可明显提高受损的神经元活性;②I-CM可降低正常神经元活性,对已受损的神经元则进一步加重损伤,IT-CM可明显改善这种损伤状态.结论:脑微血管内皮细胞的旁分泌作用可能在中枢系统缺血性损伤中起重要作用,有可能是不能透过血脑屏障的中药成分发挥治疗作用的靶点.
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曲妥珠单抗降低乳腺癌细胞条件培养液促血管内皮细胞增殖
目的 观察表皮生长因子受体-2(HER-2)的特异阻断剂曲妥珠单抗对乳腺癌细胞条件培养液促内皮细胞增殖、抗凋亡效应的影响.方法 培养并收集乳腺癌细胞MDA-MB-231条件培养液作用于内皮细胞,并用曲妥珠单抗进行干预,然后用MTT、流式细胞仪检测细胞的增殖和凋亡;免疫组化检测乳腺癌组织微血管密度与HER-2表达.结果 MDA-MB-231 的条件培养液可显著促进脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和抗凋亡(P<0.05);曲妥珠单抗显著减弱上述作用(P<0.05),但对内皮细胞的增殖、凋亡无直接影响.35例乳腺浸润性导管癌病理中,19例HER-2(-),16例HER-2(+).微血管的面积密度分别为(0.72±0.77,0.74±0.11)和数密度分别为(33.83±3.89/mm2,36.42±5.65/mm2),2组之间均无差异.结论 曲妥珠单抗可显著降低乳腺癌细胞条件培养液的促内皮细胞增殖和抗凋亡效应.
关键词： 曲妥珠单抗 表皮生长因子受体-2 条件培养液 内皮细胞 -
寡聚态β-淀粉样肽1～42可通过胶质-炎症反应损伤神经元
目的 观察寡聚态β-淀粉样肽1～42(Oligo-Aβ1～42)诱导的小胶质细胞条件培养液对Neuro-2A神经元细胞的影响,探讨炎症介质在胶质介导的神经元损伤中的作用.方法 以Oligo-Aβ1～42诱导BV-2细胞,制备小胶质细胞条件培养液,四甲基偶氮唑蓝法(MTT)测定Neuro-2A神经细胞的活力,AO-EB染色荧光显微镜观察计数细胞凋亡和坏死率;酶联免疫吸附试验(ELISA法)测定小胶质细胞培养上清中的肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)及前列腺素E2(PGE2)水平;Griess法检测上清NO水平;免疫印迹法测定小胶质细胞胞质环氧合酶2(COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达水平.结果 Oligo-Aβ1～42诱导的小胶质细胞条件培养液(Aβ-CM)明显引起Neuro-2A神经细胞损伤,MTF法显示神经元活力随Aβ诱导剂量的增加而逐渐下降(P<0.01),并且浓度为1.0μmol/L和5.0μmol/L的Aβ-CM组比同浓度Aβ单纯组神经细胞的存活率更低,分别为(53.75±3.95)%和(34.61±2.72)%(Aβ-CM组与Aβ单纯组相比P<0.05,P<0.01);联合作用组(Aβ-CM+Aβ)神经细胞存活率下降更明显,两因素方差分析显示,Aβ诱导的小胶质细胞条件培养液与单纯Aβ(1.0μmol/L)有协同作用[F(3.39)=53.16,P<0.001].AO-EB荧光观察计数显示,低浓度(0.2μmol/L)Oligo-Aβ1～42诱导的小胶质细胞条件培养液可引起神经细胞发生凋亡性损伤,较高浓度(1.0～5.0μmol/L)Oligo-Aβ1～42诱导不仅引起神经细胞凋亡,还引起细胞发生坏死性改变.进一步研究显示,低浓度(0.2～5.0μmol/L)的Oligo-Aβ1～42明显增加小胶质细胞培养上清中TNF-α、PGE2、NO的产量及胞质COX-2和iNOS蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),呈现一定的量效关系.结论 低浓度Oligo-Aβ1～42可通过胶质-炎症反应加剧神经元损伤,其作用可能与Oligo-Aβ1～42诱导小胶质细胞产生炎症介质及胞质内COX-2、iNOS蛋白表达水平增高有关.
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骨髓基质细胞条件培养液调节神经干细胞分化有效成分的蛋白质微阵列分析
目的 检测骨髓基质细胞条件培养液(N-CM)中诱导神经干细胞(NSCs)向神经元方向分化的细胞因子,探讨骨髓基质细胞(BMSCs)调节NSCs分化的机制. 方法 将收集到的N-CM混匀后经超滤浓缩分为大于5kD和小于5kD两部分,用这两部分培养液分别培养NSCs,确定其中能促进NSCs分化为高比例神经元的部分并进行大鼠蛋白质微阵列检测. 结果 N-CM分子量大于5kD的部分可以促进NSCs分化为高比例神经元,并通过蛋白质微阵列检测,与单纯骨髓基质培养液相比,有7种细胞因子的表达量卜调了1.5倍,分别是CINC-3、CNTF、IFN-γ、IL-1α、MCP-1、TIMP-1和VEGF. 结论 BMSCs分泌的可溶性分子对NSCs分化为神经元有促进作用,其中某些分子大于5KD的细胞因子可能存这一调节作用中发挥效应.
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一种诱导神经干细胞向神经元定向分化的方法
目的 介绍一种诱导神经干细胞向神经元定向分化的方法 . 方法 采用选择性无血清培养液培养大鼠神经干细胞.纯化培养2或3代后,将其接种于条件培养液中,诱导其向神经元定向分化.用倒置显微镜观察形态学变化,用NSE免疫细胞化学法检测其向神经元分化情况. 结果 条件培养液可有效诱导神经干细胞向神经元定向分化.将神经球消化成单细胞后接种,不但分化过程比神经球接种更同步,而且可提高其向神经元分化的比例. 结论 本方法 可稳定高效地诱导神经干细胞向神经元定向分化.
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间充质干细胞条件培养液对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和黏附的影响
本研究探索间充质干细胞(MSC)条件培养液对人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和黏附能力的影响及其可能的机制.采用经典全骨髓贴壁法培养MSC,用流式细胞术鉴定MSC表面标志特征.收集MSC条件培养液(MSC-CM),过表达基质细胞细胞衍生因子1(SDF-1)的MSC条件培养液(Ad-SDF-1 -MSC-CM),以2％ FBS-DMEM、15％ FBS-DMEM培养液为对照,将MSC-CM、Ad-SDF-1 -MSC-CM等条件培养液加入人脐静脉内皮细胞株( CRL1730)作用24 h后,用MTT法检测CRL1730细胞的增殖情况,利用划痕法和黏附模型评价MSC-CM对CRL1730细胞迁移能力和黏附能力的影响.结果表明,与MSC-CM相比,Ad-SDF-1-MSC-CM处理的CRL1730细胞表现出更强的增殖能力,加入阻断剂AMD3100后,MSC-CM所介导的促增殖效应明显降低.MSC-CM、Ad-SDF-1-MSC-CM促进CRL1730细胞的迁移,AMD3100明显抑制其所介导的CRL1730细胞迁移.与MSC-CM相比,Ad-SDF-1 -MSC-CM处理的CRL1730细胞黏附能力明显增强,AMD3100能显著降低其增强CRL1730黏附能力的作用.结论:MSC-CM对CRL1730细胞的促增殖、迁移和黏附能力与其分泌的细胞因子SDF-1密切相关.
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BxPC-3条件培养液对PC12细胞株DA和NE代谢的影响
目的:探讨BxPC-3条件培养液影响分化的PCI2细胞神经递质代谢的机制.方法:用去除IL-6的BxPC-3条件培养液处理分化的PC12细胞,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率、HPLC检测上清和细胞裂解液中DA、5-HT和NE的含量.在不合血清的条件培养液中加入 IL-6(0.01 mg/L,0.1 mg/L,0.25mg/L,0.5 mg/L,1 mg/L,1.5 mg/L,2 mg/L),分别收集上清和细胞裂解液,采用HPLC检测DA和NE的含量.结果:各组细胞凋亡率之间差别无统计学意义,条件培养液中加入IL-6抗体后,上清中DA和NE的含量明显增加,而细胞内DA和NE代谢差异无统计学意义,在加入不同剂量IL-6后,随着浓度的增加,DA和NE的代谢近似呈现剂量依赖性降低,当IL-6浓度为1 mg/L时DA和NE的变化有统计学意义.结论:BxPC-3条件培养液主要通过IL-6影响分化的PC12神经递质代谢.
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三氧化二砷对肝癌诱导血管内皮细胞相关基因蛋白表达的影响
目的:研究三氧化二砷(As2O3)注射液对肝癌诱导血管内皮细胞相关基因蛋白表达的影响.方法:构建了人肝癌SMMC-7721细胞株诱导人脐静脉内皮细胞ECV304增殖的实验模型,应用免疫组织化学方法,严密观察了As2O3注射液对SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞,有关基因蛋白表达的影响.结果:2 mg/L的As2O3注射液,对SMMC-7721细胞、ECV304细胞及SMMC-7721细胞条件培养液培养的ECV304细胞表达肿瘤相关基因蛋白,均有一定的调节作用;可下调VFGF、整合素β1和EGFR的表达;上调E-钙粘连蛋白的表达.结论:As2O3注射液抗原发性肝癌及防治肝癌复发和转移的作用机制,可能与其能调节肝癌细胞及血管内皮细胞VEGF、整合素β1、E-钙粘连蛋白和EGFR等基因蛋白的表达,干预细胞的信号转导,抑制肿瘤血管形成有关.
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骨髓间质干细胞移植对心衰大鼠心肌组织中MMP-2、MMP-9和TIMP-1的影响
目的：探讨骨髓间质干细胞（BMSCs）移植对心衰大鼠心肌组织中基质金属蛋白酶-2（ MMP-2）、基质金属蛋白酶-9( MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-1）的影响及机制。
方法：采用异丙肾上腺素(ISO)皮下注射的方法建立大鼠的心力衰竭模型，随机分成3组，每组8只，心肌内分别注射BMSCs（简称BMSCs组）、BMSCs条件培养液（简称BMSCs-CM组）及生理盐水（Saline）（简称NS组）。RT-PCR检测3组心肌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1mRNA的表达，Western-bloting检测心肌组织MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白的表达及胞浆内及胞核内p65和p50以及总蛋白中IкB、p-IκB蛋白表达水平。 -
旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用
目的：探讨旁分泌机制在脂肪间充质干细胞（ADSC）移植治疗心肌梗死中的作用。
方法：原代分离和培养人ADSC，将经鉴定的第3~5代的ADSC用于实验。①用8~10周龄（20~24 g）的雄性C57B/L小鼠，结扎左前降支建立心肌梗死（MI）损伤模型，实验分假手术组，MI+DMEM/F12组和MI+ADSC-CM（条件培养液）组（n=12）。在MI处理的小鼠心肌梗死边缘区分别注射DMEM/F12和ADSC-CM，观察动物生存率、TTC染色测量心肌梗死面积、超声评价心功能变化、TUNEL染色检测心肌细胞凋亡等方法评价心肌梗死的治疗效果。②用H2O2建立乳鼠心肌细胞（NRVM）体外损伤模型，观察ADSC-CM对心肌细胞的保护作用。实验分对照组，H2O2+DMEM/F12组和H2O2+ADSC-CM组（n=5）。分别用caspase-3蛋白定量和TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。 -
星形胶质细胞培养液及抗呆Ⅰ号对模拟损伤神经元的影响
目的探讨体外模拟脑缺血再灌注损伤条件下星形胶质细胞条件培养液(ACM)、经抗呆Ⅰ号作用的星形胶质细胞条件培养液(ACMK)及ACM与抗呆Ⅰ号联合应用(ACM+K)对损伤神经元的影响.方法先分别进行大鼠大脑皮质星形胶质细胞(Ast)和神经元的分离纯化培养及体外模拟脑缺血再灌注损伤模型的建立,然后用再灌18 h后收集的ACM、ACMK和ACM+K以1:5的浓度来培养损伤后的神经元,后测定其神经元的活性、存活率、死亡率、培养液乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率和NOS强阳性细胞的表达量.结果 ACM、ACMK和ACM+K均能使脑缺血再灌注损伤后神经元的活性和存活率明显提高,使死亡率、细胞培养液LDH的漏出率和NOS强阳性细胞的表达量显著降低,其作用 ACMK>ACM+K>ACM.结论①经体外模拟脑缺血再灌注损伤的神经元呈损伤→代偿→再损伤→恢复的时相变化;②ACM对受损的神经元具有重要的保护和修复作用;③Ast在脑缺血预适应(BIP)中发挥重要的作用;④抗呆Ⅰ号可通过Ast间接地保护和修复受损的神经元.
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海参皂苷对小鼠造血调控因子的影响
目的 探讨革皮氏海参皂苷(saponin of Pearsonothuria graeffei,PGS)对骨髓抑制模型小鼠造血调控因子的影响.方法 雄性ICR小鼠随机分为正常对照组、模型对照组和PGS低、高剂量组.剂量组小鼠灌胃不同浓度PGS(10和30 mg/kg),正常和模型对照组灌胃生理盐水,连续16d.除正常对照组外,其余小鼠均于首次PGS后第7d,连续3d腹腔注射环磷酰胺(100 mg/kg),建立骨髓抑制小鼠模型.于末次给药后,分别制备小鼠肺条件培养液(LCM)、脾条件培养液(SCM)和腹腔巨噬细胞条件培养液(PMΦ CM),采用MTT法检测其对正常大鼠骨髓细胞增殖的影响；采用单层半固体培养法检测对粒单系祖细胞(CFU-GM)、红系祖细胞(CFU-E)和巨核系祖细胞(CFU-Meg)集落形成的影响；采用RT-PCR法检测粒/单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素受体(EPOR)和血小板生成素(TPO) mRNA的表达.结果 经PGS体内诱导所制备的LCM、SCM、PMΦ CM条件培养液能显著促进正常小鼠骨髓细胞增殖,增加CFU-GM、CFU-E和CFU-Meg祖细胞的集落形成,上调骨髓细胞GM-CSF、EPOR和TPO mRNA的表达量.结论 PGS通过诱导造血细胞因子的分泌促进骨髓粒单系、红系与巨核系造血的恢复.
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骨骼肌条件培养液对恶性肿瘤抑制作用的初步研究
目的:研究骨骼肌微环境因素对恶性肿瘤细胞增殖的影响,评价其在骨骼肌转移瘤罕见性中的意义.方法:原代培养新生Wistar大鼠骨骼肌细胞,用MTT法分析、比较其条件性上清液(MMCM)对恶性肿瘤细胞(小鼠实体瘤-肉瘤、细胞株S180-V、小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0、人食管癌细胞Eca109)及正常非肿瘤细胞(金黄地鼠肾细胞株BHK-21)的体外抑瘤作用.结果:MMCM与S180-V、SP2/0、Eca109及BHK-21共同培养后,三株恶性肿瘤细胞株的增殖均显著受抑,而正常非肿瘤细胞株则不受影响.结论:新生大鼠骨骼肌细胞可产生选择性抑制恶性肿瘤细胞增殖的抑瘤物质,这种抑瘤物质可能是临床上骨骼肌内罕见转移瘤现象的生物学基础.
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条件培养液体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究
[目的]观察乳鼠心室肌成纤维细胞条件培养液干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制.[方法]分离培养及鉴定大鼠MSCs,对其进行分组诱导:单纯条件培养液组(TJ)、条件培养液1组(TJ-ZY)、条件培养液2(TJ-XFK),诱导,24h后继续培养4周,免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T(cTnT)的表达,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和α-actin mRNA的表达.[结果]免疫细胞化学结果显示单纯条件培养液诱导后的MSCs不表达心肌特异性蛋白cTnT,心复康参与组则表达.实时荧光定量(RT-PCR)结果显示各组均表达心肌分化早期基因,心复康参与组诱导后的MSCs的心肌分化早期基因表达明显高于单纯条件培养液组.[结论]微环境在MSCs向心肌样细胞的分化过程中起了重要作用,心复康能够提高MSCs向心肌样细胞的分化和特化作用.
关键词： 条件培养液 心复康 骨髓间充质干细胞 免疫细胞化学 实时荧光定量RT-PCR -
ACTD的CM对旁观者V79细胞△ψm和胞质内细胞色素C的影响
目的 观察放线菌素D (actinomycin D,ACTD)处理中国仓鼠成纤维靶细胞(the Chinese hamster fibroblast V79-C3 cell line,V79细胞)获得的条件培养液(conditioned medium,CM)对V79旁观者细胞线粒体膜电位(△ψm)和胞质内细胞色素C(cytochrome C,Cyt C)含量的影响,以研究ACTD诱导旁观者效应发生的可能机制.方法 用4.0 mg/L ACTD处理V79靶细胞1h,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS)漂洗3次,加入新鲜培养液开始计时,分别在第4、8、12和24 h获取靶细胞条件培养液CM.不同时段CM培养正常V79细胞24 h后,采用罗丹明123(Rhodamine 123,Rh123)荧光染色流式细胞仪法检测旁观者细胞的线粒体膜电位(△ψm);比色法测定胞质内Cyt C的含量.结果 各CM处理组旁观者细胞△ψm均比对照组下降(P＜0.01).随着时段的延后,△ψm平均荧光强度在逐渐增加,24 h又减少(P＜0.01).胞质内Cyt C含量以对照组低,CM处理组胞质内Cyt C含量增加(P＜0.01),4h高,随后下降,24 h又明显增加(P＜0.01).结论 ACTD诱导旁观者效应可能通过靶细胞的CM影响旁观者细胞线粒体膜电位下降和胞质内Cyt C含量增加,进而引起旁观者细胞凋亡.
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条件培养液对Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆增殖的影响
目的 探讨神经干细胞(NSCs)条件培养液对其单细胞克隆增殖的影响.方法 采用无血清培养法体外培养Wistar大鼠海马神经干细胞并进行传代培养,然后收集神经干细胞条件培养液.第四代细胞进行单细胞克隆,并将单细胞克隆细胞分为条件培养液组、无血清培养液对照组.通过MTT去比较两组细胞的增殖情况.单克隆培养细胞行巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色,诱导分化后细胞行神经元特异性烯醇化酶(NSE )、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Galc)免疫细胞化学染色.结果 单克隆培养后克隆球表达nestin,诱导分化后细胞表达NSE、GFAP、Galc,条件培养液组细胞增殖速度高于对照组.结论 条件培养液能提高Wistar大鼠海马神经干细胞单细胞克隆的增殖速度.
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应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液诱导胚胎干细胞的分化
目的:为克服类胚体和视黄酸诱导体系的不足,实验使用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液定向诱导分化胚胎干细胞,观察是否可以获得大量具有高度增殖和进一步分化能力的神经干/祖细胞.方法:实验于2005-06/2006-09在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.①取孕12.5d的C57BL/6J小鼠胚胎脑组织,放入含有神经干细胞培养液(含B27、肝素5 mg/L、碱性成纤维细胞生长因子20 μg/L、表皮生长因子20 μg/L、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素的DMEM/F12)的离心管内,接种后37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中饱和湿度培养.3～5 d后可见团状细胞球出现,即为原代的神经干细胞.取P5～10代神经干细胞消化成单细胞悬液,以5×104/cm2密度接种于神经干细胞培养液中,4～5 d离心后收集上清液,即为胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液.②P30代SC1002鼠胚胎干细胞消化成单个细胞后,移入上述制备的条件培养液中,5 d后消化细胞,再重新接种于条件培养液中培养5 d.常规消化后接种于神经干细胞培养液中,培养4～5 d,即得到胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞.对照组用神经干细胞培养液代替条件培养液.③所得细胞进行特异性抗原免疫细胞化学染色,并计数免疫染色阳性细胞率.RT-PCR检测标志性基因的表达.结果:①胚胎干细胞分化为神经干/祖细胞的比例:当消化成单个细胞的胚胎干细胞接种到神经干细胞条件培养液后,24 h内聚集成细胞球并悬浮生长.免疫细胞化学检测少部分细胞表达nestin,在随后的培养过程中nestin阳性细胞逐渐增多.第4天细胞球周围的细胞几乎全部呈nestin阳性.当消化后重新接种于神经干细胞条件培养液中,可见部分细胞贴壁生长,10 d后再常规消化接种于神经干细胞培养液中,呈典型的双极外形,nestin及RC2检测均呈阳性.RT-PCR检测显示Oct-4不再表达,而sox2,sox3,nestin,fabp7及bHLH转录因子均有显著表达.另一方面,当单个胚胎干细胞直接培养在神经干细胞培养液中,大量细胞死亡,仅10%存活,存活细胞表达Oct-4和nestin.②胚胎干细胞来源的神经干/祖细胞向神经元和胶质细胞的分化:经过10～12 d的诱导分化,微管相关蛋白2和胶质纤维酸性蛋白细胞阳性率分别为(27.6±9.2)%和(29.7±11.6)%.结论:不需要共培养或添加诱导因子,应用胎鼠脑源性神经干细胞条件培养液成功地将胚胎干细胞定向诱导分化为大量高纯度的神经前体细胞,并进一步得到神经元和神经胶质细胞.
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脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白修复小鼠皮肤损伤
背景:富血小板纤维蛋白可促进软组织愈合,间充质干细胞分泌的可溶性因子具有促进皮肤再生的作用,两者联合应用促进皮肤损伤修复尚未见报道.目的:探讨脂肪间充质干细胞条件培养液联合富血小板纤维蛋白对小鼠皮肤创伤愈合的影响.方法:制作C57/BL6小鼠(西南医科大学实验动物中心提供)全层皮肤损伤模型,随机分为4组,每组10只.自造模后即开始治疗,各组分别涂抹脂肪间充质干细胞专用培养基、脂肪间充质干细胞条件培养液、富血小板纤维蛋白、脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白,3次/d,连续7 d.在治疗后的1,3,7,10 d测量创面大小并计算治疗后3,7 d的创面愈合率;治疗后第14天进行创面愈合的组织学分析.结果与结论:①与脂肪间充质干细胞专用培养基组相比,其他3组创面愈合时间缩短;②治疗后3,7 d,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于其他3组,脂肪间充质干细胞条件培养液组和富血小板纤维蛋白组的创面愈合率高于脂肪间充质干细胞专用培养基组,差异有显著性意义(P<0.05);③组织学分析显示,脂肪间充质干细胞条件培养液+富血小板纤维蛋白组小鼠创面白细胞及成纤维细胞聚集、血管新生、肉芽组织重塑、上皮化均比其他3组明显,伤口愈合效果好;④结果表明,脂肪间充质干细胞条件培养液与富血小板纤维蛋白联合应用能有效促进小鼠皮肤损伤的修复,效果优于单独应用脂肪间充质干细胞条件培养液或富血小板纤维蛋白.
