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高分辨熔解曲线基因分型技术检测尼古丁受体rs1051730和rs16969968单核苷酸多态性
目的 寻求费用低廉、简便、快速的方法检测广东地区汉族慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者尼古丁受体rs1051730和rs 16969968单核苷酸多态性.方法 收集2010年9月至2012年4月在广州医科大学附属市—人民医院、广州医科大学附属第一医院、广州医科大学附属第三医院住院及门诊受试者1 248例,从广州荔湾城区和韶关云岩、桂头农村流行病学调查的资料抽取533例,共计1 781例患者,分为COPD组1 013例,非COPD对照组768例.应用高分辨率熔解曲线(HRM)技术,对尼古丁受体基因rs1051730和rs16969968进行分型,并以焦磷酸测序法进行对照.Hardy-Weinberg定律检测rs1051730和rs16969968单核苷酸多态性(SNP)是否符合遗传平衡.结果 以HRM法能够较准确、快速区别出COPD与非COPD对照者尼古丁受体rs 16969968 A风险等位基因频率及基因型频率的差异,HRM分析显示rs 1051730分为3型,分别为CC、CT、TT型,rs 16969968也分为3型,分别为GG、AG、AA型,高分辨率熔解曲线可清楚的分辨rs 1051730基因型及rs 16969968基因型.rs 16969968风险等位基因A的基因频率在COPD患者中为4.3％,在对照组中为3.0％ (P=0.043).杂合基因型AG在COPD的基因型频率为8.6％,对照组为5.7％(P=0.025),突变型AA罕见(仅0.1％).rs1051730风险等位基因T和等位基因频率及基因型频率与rs 16969968完全相同,连锁性分析发现两位点完全相关.200例标本测序结果显示,199例HRM基因分型结果与测序相同,仅1例结果不同,与测序符合率达98％以上,两位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律(x2=0.178,P＞0.05).结论 HRM费用低廉、简便、快速,能准确对尼古受体rs1051730和rs 16969968基因分型.
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洛伐他汀对PC12神经细胞中α7尼古丁受体的上调作用及其神经保护作用
目的 研究洛伐他汀(Lovastatin)对PC12神经细胞中α7尼古丁受体的调节作用.方法 体外培养用PC12神经细胞,加入不同浓度的洛伐他汀培养48 h,或与β淀粉样蛋白、自由基诱导剂同时处理,然后测定细胞MTT水平、α7尼古丁受体密度及mRNA水平、细胞脂质过氧化水平.结果 适量浓度的洛伐他汀(100 nmol/L以下)使细胞中[125I]标记α金蛇环毒素配体与α7尼古丁受体结合密度升高,并使α7尼古丁受体mRNA表达水平增强;洛伐他汀可对抗β淀粉样蛋白或自由基诱导剂引起的脂质过氧化.结论 洛伐他汀可增强α7尼古丁受体与配体的结合和上调该受体的基因表水平达,并有一定的神经保护作用.
关键词： 洛伐他汀 尼古丁受体 嗜铬细胞瘤株(PC12) β淀粉样蛋白 脂质过氧化 -
燃煤型氟中毒大鼠脑组织神经型尼古丁受体mRNA及蛋白表达水平改变
目的 观察燃煤型氟中毒大鼠学习记忆能力变化,测定大鼠脑组织神经型尼古丁受体(nAChR)mRNA和蛋白表达水平,探讨大鼠学习记忆能力改变的发生机制.方法 健康SD大鼠24只,体质量100～120 g,按体质量随机分为3组,每组8只.对照组饲以常规饲料,低氟组和高氟组以燃煤型氟中毒重病区燃煤烘烤的当地玉米为主要饲料(含氟量分别为11.30、104.20 mg/kg)来复制慢性氟中毒大鼠模型,染氟时间为6个月.染氟结束后,用Morris水迷宫方法检测大鼠行为学变化,处死动物取脑,用匀浆-氟离子选择电极法测定脑组织含氟量,实时荧光定量PCR法检测nAChR mRNA水平,蛋白印迹法测定nAChR蛋白表达水平.结果 低氟组和高氟组大鼠逃避潜伏期时间[(12.42±8.03)、(17.48±8.05)s]较对照组[(7.04±3.29)s]显著延长(P均<0.05),高氟组第7天穿过平台次数[(1.62±0.87)次]和逗留平台象限时间[(16.70±5.02)s]较对照组[(3.53±1.67)次、(23.33±5.35)s]降低(P均<0.05).低氟组和高氟组大鼠脑组织含氟量[(1.14±0.04)、(1.79±0.04)mg/kg]显著高于对照组[(0.52±0.05)mg/kg,P均<0.05],且高氟组大鼠脑组织含氟量高于低氟组(P<0.05).高氟组大鼠脑组织nAChR α3、α4、α7亚单位mRNA水平(1.51±0.20、1.45±0.06、1.63±0.08)较对照组(1.79±0.11、1.66±0.14、1.83±0.06)显著降低(P均<0.05),而低氟组(1.65±0.17、1.59±0.09、1.71±0.03)与对照组比较无明显改变(P均>0.05).低氟组和高氟组大鼠脑组织nAChR α3、α4、α7亚单位蛋白表达水平(0.58±0.13、0.16±0.03、1.41±0.38和0.56±0.23、0.08±0.02、0.51±0.16)较对照组(1.48±0.42、0.57±0.21、2.56±0.26)显著降低(P<0.05或<0.01).结论 燃煤型氟中毒大鼠学习记忆能力降低可能与脑组织nAChR蛋白表达及mRNA水平降低有关,nAChR表达改变可能是引起动物学习记忆能力降低的主要机制.
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氟中毒大鼠脑组织和PC12细胞中脂质和尼古丁受体的改变
目的观察氟中毒对大鼠脑组织和神经细胞中细胞膜性脂质和神经型尼古丁受体的影响,探讨氟中毒引起神经系统功能紊乱的分子作用机制.方法用不同剂量氟饲养大鼠和处理体外培养的大鼠嗜铬神经细胞瘤细胞株(PC12神经细胞),用生物化学方法测定细胞3-4,5-二甲基噻唑-2,5-二酚基四唑溴化物(MTT)还原能力、脂质过氧化和蛋白氧化水平,用高效液相色谱方法测定细胞膜性脂质,用放射核素标记放射性配体-受体实验方法测定不同的尼古丁受体类型,用蛋白印迹方法测定α3、α4、α7和β2尼古丁受体亚单位蛋白水平.结果经氟处理的神经细胞中MTT水平降低36%,氟中毒大鼠和高浓度氟处理的神经细胞中氧化应激水平升高55%～89%,细胞膜性磷脂减少24%～34%,辅酶Q减少13%～30%,含α3、α4和α7亚单位的尼古丁受体类型在受体-配体结合率和蛋白水平均降低20%～44%,用抗氧化剂处理可减弱氟中毒对受体的损害作用.结论氟中毒导致神经型尼古丁受体水平降低,其原因可能与氟中毒时氧化应激水平升高及所引起的细胞膜性脂质结构异常改变有关,这些可能是氟中毒时神经系统功能紊乱的重要发生机制.
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松果菊苷及异麦角甾苷对神经细胞尼古丁受体表达的影响
目的 研究肉苁蓉活性成分松果菊苷及异麦角甾苷对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制,以了解其神经保护作用机制.方法 比色法测定细胞MTT还原率筛选松果菊苷及异麦角甾苷安全浓度范围,并用Aβ<,25-35>处理细胞后,测定MTT还原率,蛋白质印迹法(Western blot)测定尼古丁受体α3、α7蛋白表达的变化.结果 松果菊苷及异麦角甾苷能提高细胞α3及α7神经型尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平,呈剂量依赖关系;并能对抗Aβ<,25-35>引起的α3和α7受体亚单位蛋白质水平降低,减弱Aβ<,25-35>引起的细胞损伤.结论 松果菊苷及异麦角甾苷可能通过上调神经型尼古丁受体亚单位蛋白来发挥神经保护作用,在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用.
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灯盏细辛对神经细胞尼古丁受体表达的影响及其神经保护作用研究
目的 研究中药灯盏细辛对神经母细胞瘤 (SH-SY5Y) 细胞神经型尼古丁受体表达的影响及其对抗β淀粉样蛋白 (Aβ)神经毒性作用机制.方法采用比色法测定细胞 MTT 还原率筛选药物浓度安全范围,选取一定浓度的灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位处理 SH-SY5Y 细胞后,再加入 Aβ1-42 处理,测定 MTT 还原率,蛋白质印迹法(Western blotting )方法测定神经型尼古丁受体α3、α7 蛋白表达的变化;采用改进的Ellman比色法测定细胞培养基中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)及丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase,BuChE)活性.结果灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能提高细胞α3 及α7 尼古丁受体亚单位蛋白质表达水平;降低细胞乙酰胆碱酯酶活性;并能对抗 Aβ引起的MTT还原率降低.结论灯盏细辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能上调尼古丁受体亚单位蛋白表达水平,降低细胞乙酰胆碱酯酶活性,且能对抗 Aβ的神经毒性作用,在阿尔茨海默氏病的治疗中可能起到一定作用.
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当归抗β-淀粉样蛋白所引起的神经细胞毒性作用研究
目的 研究当归对β-淀粉样蛋白引起的SH-SY5Y神经细胞中尼古丁受体亚单位在蛋白质水平降低、细胞损伤及脂质过氧化的拮抗作用,了解其神经保护作用的可能机制.方法 选取一定浓度的当归预处理SH-SY5Y细胞后,再加入β-淀粉样蛋白处理,用比色法测定细胞MTT还原率,从细胞整体水平了解当归对细胞活性的影响;用Western blotting方法测定神经型尼古丁受体亚单位(α3和α7)蛋白表达水平的变化;用TBA比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平,以了解当归的抗氧化能力.结果 安全浓度的当归提取物能减弱β-淀粉样蛋白引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高,对抗β-淀粉样蛋白引起的α3和α7尼古丁受体亚单位蛋白质水平降低.结论 当归有一定的神经保护作用.
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肉苁蓉对抗β-淀粉样肽神经细胞的毒性作用研究
目的:研究中药肉苁蓉对神经母细胞瘤细胞烟碱型乙酰胆碱受体表达的影响及其对抗β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性作用机制,以探讨其在阿尔茨海默病(alzheimer's disease,AD)治疗中的作用.方法:比色法测定细胞MTT还原率筛选肉苁蓉安全浓度范围,并用Aβ(25-35)处理细胞后,测定MTT还原率,蛋白质印迹法(Western blotting)测定烟碱型乙酰胆碱受体α3、α7蛋白表达的变化;TBA比色法测定脂质过氧化产物(丙二醛)的水平.结果:肉苁蓉能提高细胞α3及α7烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白质表达水平;并能对抗Aβ(25-35)引起的α3和α7受体亚单位蛋白质水平降低;同时能减弱Aβ(25-35)引起的细胞损伤和脂质过氧化水平升高.这些作用随浓度的增加而增强.结论:肉苁蓉能上调烟碱型乙酰胆碱受体亚单位蛋白表达水平,且能对抗Aβ(25-35)的神经毒性作用,在AD的治疗中可能起到一定作用.
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尼古丁受体对尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响
目的 探讨尼古丁受体在尼古丁刺激大鼠气道平滑肌细胞(RASMCs)增殖中的作用.方法 分别设计相应的RNA引物,应用RT-PCR实验,观察RASMCs上存在的尼古丁受体(nAchRs)亚单位情况;应用细胞计数法检测尼古丁受体非特异性拮抗剂MCA和α7尼古丁受体特异性拮抗剂MG624对尼古丁作用的RASMCs增殖作用的影响;EDU掺入法测定应用尼古丁受体拮抗剂MCA和MG624对尼古丁作用的RASMCs DNA复制活性的影响.结果 RT-PCR实验证实大鼠气道平滑肌细胞上存在nAchRs亚单位,分别是α1、4、7、9、10,β1、2、4.细胞计数法检测发现尼古丁受体拮抗剂MCA、MG624均可以抑制尼古丁的促增殖作用,细胞数量明显下降,与尼古丁单独作用组比较差异有统计学意义(P＜0.05);EDU检测显示尼古丁受体拮抗剂MCA和MG624均可以抑制尼古丁的作用,使DNA复制活性降低,细胞复制水平下降,与尼古丁单独作用组比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 尼古丁能够通过尼古丁受体介导促进大鼠气道平滑肌细胞的增殖.
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定点突变法构建人尼古丁受体α5亚单位突变体(Asn398)慢病毒表达载体
目的:克隆人尼古丁受体α5亚单位(CHRNA5),以野生型CHRNA5为模板,通过定点突变法构建CHRNA5突变体(Asn398)慢病毒真核表达载体,为Asn398功能研究提供基础.方法:RT-PCR克隆CHRNA5基因片段,运用重叠延伸PCR法进行定点突变,定向克隆至EX-Q0146-LV201,序列分析鉴定野生及突变重组子,将CHRNA5突变体Asn398及未突变体定向克隆到EX-Q0146-LV201慢病病毒表达质粒上.并转染至HEK293T细胞中,RT-PCR检CHRNA5 mRNA表达,Westernblot检测其蛋白表达.结果:重组子目的基因的序列分析结果显示成功克隆CHRNA5 cDNA基因,并成功将CHRNA5第398位氨基酸天冬氨酸(Asp)转变为天冬酰胺(Asn),突变体及未突变在转染细胞中均获得CHRNA5 mRNA及蛋白表达.结论:成功构建CHRNA5突变体Asn398慢病毒表达载体,证实其在293细胞中有mRNA转录及其蛋白表达,为下一步进行功能研究奠定基础.
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测序法筛选慢性阻塞性肺疾病尼古丁受体 CHRNB4基因外显子单核苷酸多态性
目的：寻找中国南方汉族人群尼古丁受体（CHRNB4）基因功能区与慢性阻塞性肺疾病（COPD）疾病相关的单核苷酸多态性位点（SNP）。方法：在广州地区抽取按照慢性阻塞性肺疾病全球创议（GOLD）诊断标准（扩张后FEV1／FVC＜70％）确诊的汉族COPD患者120例，按年龄（±3岁）与病例频数匹配原则选取非COPD对照者120例，病例组来自广州医科大学附属市一人民医院住院及门诊患者，对照组来自门诊志愿者。抽取受试者外周血提取基因组 DNA，利用 Pubmed（http：／／www．ncbi．nlm．nih． gov／gene／）查寻 CHRNB4的全基因组序列，以Oligo6引物设计软件设计包括全外显子序列在内的测序引物5对，焦磷酸法 DNA测序，Bio Edit分析软件对测序序列进行比对及基因分型分析。结果：通过第一代测序，快速筛选出中国汉族人群CHRNB4外显子区3个SNP ，分别为 rs56218866、rs6743072、rs1948。其中rs56218866可引起氨基酸位点改变。结论：通过第一代测序，可以简单、快速筛选出中国南方汉族人群与尼古丁受体CHRNB4外显子功能区和COPD易感性相关的SNP位点。
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海马脑片CA1中间神经元α7尼古丁受体亚型的功能研究
目的 利用膜片钳全细胞记录方法研究α7尼古丁受体亚型的功能特点.方法 实验在急性制备的海马脑片CA1中间神经元上进行;α7尼古丁受体亚型可被局部高压微量喷射的高浓度的胆碱特异性激活,膜片钳全细胞记录方法用于判断神经元类型并记录膜电流变化.结果 中间神经元的动作电位发放频率较均匀,基本无适应性;其膜上的α7尼古丁受体亚型可被胆碱特异性激活,产生强大的持续时间短暂的内向离子流,该离子流可被MLA(一种α7尼古丁受体亚型的抑制剂)完全阻断.结论 采用药理学和膜片钳技术相结合的方法可对α7尼古丁受体亚型的功能特点进行有效研究.
关键词： α7-subunit 尼古丁受体 中间神经元 海马 脑片 -
辛伐他汀对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经系统的刺激作用
目的:研究胆固醇降解药辛伐他汀(Simivastatin)对SH-SY5Y神经细胞中胆碱能神经的刺激作用,探讨史他汀类药物在神经退变性疾病中的神经性保护机制.方法:体外培养SH-SY5Y神经细胞(源于人神经母细胞瘤细胞),在培养液中加入辛伐他汀培养48 h,然后用比色法测定细胞MTT还原率及胆碱酯酶活性,用蛋白印迹方法测定尼古丁受体α7和α3蛋白水平,RT-PCR方法测定该类受体mRNA表达水平.结果:辛伐他汀能降低培养细胞中乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性(分别降低41.9%和18.1%);增强尼古丁受体α7亚单位的蛋白和mRNA表达水平(分别升高23%和32%),但对α3无明显影响.结论:辛伐他汀可以刺激胆碱能神经系统,可能具有神经性保护作用.
关键词： 辛伐他汀 胆碱酯酶类 尼古丁受体 SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞 -
高浓度氟引起SH-SY5Y神经细胞中α7尼古丁受体水平降低
目的:观察氟中毒对神经细胞中α7尼古丁受体的影响.方法:体外培养SH-SY5Y神经细胞,在培养液中加人不同浓度的氟化物,培养48 h后测定细胞MTT水平;用放射配体结合实验测定α7尼古丁受体亚型含量;用Western Blotting方法测定α7尼古丁受体亚单位蛋白水平.结果:经氟处理的神经细胞中MTT水平降低,α7尼古丁受体大结合容量降低,α7尼古丁受体亚单位蛋白含量减少.结论:氟中毒可引起SH-SY5Y神经细胞中α7尼古丁受体表达降低.
关键词： 氟化物中毒 神经元 尼古丁受体 SH-SY5Y神经细胞 -
精神分裂症患者大脑皮质尼古丁受体亚单位蛋白质水平的改变
目的:研究精神分裂症与尼古丁受体的关系.方法:用Western Blotting方法测定患者大脑皮质组织中主要的尼古丁受体亚单位蛋白质水平,并与同龄对照组相比较.结果:精神分裂症患者大脑皮质前叶组织中α7亚单位蛋白质含量较对照组减少,但在大脑皮质顶叶组织中未见明显变化.在精神分裂症患者与同龄对照组之间没有发现尼古丁受体α3,α4和β2亚单位蛋白质表达有明显区别.结论:α7尼古丁受体亚型在精神分裂症发病机制中具有特殊意义和重要作用.
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灯盏细辛不同溶剂部位对神经细胞尼古丁受体水平影响比较研究
目的:研究中药灯盏细辛不同部位对神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞神经型尼古丁受体水平的影响及其对抗β淀粉样蛋白(AB)细胞毒性作用机制.方法:比色法测定细胞MTT还原率筛选药物浓度安全范围,选取一定浓度的不同部位灯盏细辛处理SH-SY5Y细胞后,再加入Aβ1-42处理,测定MTT还原率,Western blotting(蛋白质印迹法)方法测定神经型尼古丁受体α3、α7蛋白水平的变化.结果:不同部位灯盏细辛能提高细胞α3及α7尼古丁受体亚单位蛋白水平;对抗Aβ引起的MTT还原率降低,其中以乙醇提取物乙酸乙酯部位及正丁醇部位为明显.结论:灯盏细辛乙醇提取物中乙酸乙酯及正丁醇部位能明显上调细胞尼古丁受体亚单位蛋白水平,对抗AB引起的神经细胞存活率降低,对于进一步筛选具有神经保护作用的灯盏细辛有效成分提供一定的依据.
