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P4501A1基因Thr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体的构建
目的 构建P4501A1基因cDNA Thr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体,为进一步研究CYP1A1的功能和致癌机制奠定基础.方法 根据人CYP1A1基因(GeneBank NM-000499)cDNA序列设计通用引物Pm3/Pm4和突变引物Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,内含酶切位点和突变位点,先用Pm3/Pt16,Pm3/Pt18组成两对引物,以pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第一轮扩增,获得上游1397bp片断,再用Pt15/Pm4,Pt17/Pm4组成两对引物以10ng pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第二轮扩增,得到下游177bp片断.然后用Pm3/Pm4做引物以第一、第二轮扩增产物为模板进行第三轮扩增,获得的1.5kb扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离并回收纯化,将纯化的PCR产物与pMD-T载体连接后转化大肠埃希菌DHα5感受态细胞,挑单克隆扩增、质粒抽提后进行酶切和测序鉴定.结果 三轮PCR扩增得到的1.5kb片断,经内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化和T7p和SP6通用引物进行双向测序,证实克隆的目的片段与GeneBank中人CYP1A1基因cDNA的序列同源性为99.9%,且包含两个设计的突变位点Asn461、Val462.结论 本实验成功地构建了含突变位点Asn461、Val462的CYP1A1基因cDNA的片断.
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4株鸡马立克氏病病毒国内分离株Meq基因的克隆与序列分析
根据鸡马立克氏病病毒(MDV)GA株Meq基因序列,设计并合成一对用于扩增Meq基因的引物,利用这对引物通过PCR方法分别扩增4株东北地区分离的强毒株、国内标准强毒株J-1株、国内疫苗株814株的Meq基因片段,进行克隆测序,对4株MDV分离毒株Meq基因与国内传统毒株Meq基因及GenBank上收录的国内外9株毒株Meq基因序列进行比较分析.序列比较显示,不同的MDV株的Meq基因序列相对比较保守,它们相互间氨基酸序列的同源性在96.5%～99.7%之间.4株MDV分离毒株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变;3株分离毒株Meq基因上相同位置均存在两个定点突变,这两处点突变是国内近几年分离株所特有的,国外已发表的MDV毒株Meq序列中不存在这种变化.分离株Meq基因的这些突变和毒株毒力的关系具有一定的规律性,但是这些规律性还有待进一步研究.
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流感病毒的反向遗传学研究进展
反向遗传学是指对病原微生物的cDNA进行目的性修饰,以对其进行功能和表型的分析[1].它是相对于经典遗传学而言的,后者是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律.反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等,再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容.与之相关的研究技术称为反向遗传学技术.在病毒学研究中,反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒,从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响.早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统.将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞,可使RNA充任mRNA(s),从而可翻译出病毒蛋白;反过来,这些蛋白又有助于完整病毒的包装.
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感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建
在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8.按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆.利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性.结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒.这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础.
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狂犬病病毒反向遗传学及其应用
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的.经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律.反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰,如定点突变、基因插入缺失置换等,再按组成顺序构建含有生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构和功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容.
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PR8F/NS1不同位点突变株对小鼠致病性的比较研究
为了探索NS1不同位点突变对流感病毒毒力的影响以及NS1毒力相关位点的作用机制.分析流感病毒NS1蛋白的毒力相关关键基因区段和关键位点,以实验室保存的H1N1亚型流感病毒PR8F为模板,对其NS1基因的第42、81、149位氨基酸分别进行定点突变.利用反向遗传操作技术,成功拯救出突变毒株PR8F-42、PR8F-81、PR8F-149.将获救病毒接种SPF鸡胚,连续传代5代,至病毒能够稳定扩增后,通过血凝效价分析病毒复制效率.并将获救病毒与PR8F均以106 TCID50/100μL感染BALB/c小鼠,观察各组小鼠临床表现、体重变化及存活率.剖检攻毒后死亡小鼠,观察病理特征,制作肺组织病理切片.并提取小鼠肺脏RNA,通过qPCR检测各组小鼠肺脏的病毒载量.结果表明,PR8F的NS1蛋白第42位氨基酸由丝氨酸(Ser)改变为脯氨酸(Pro)对小鼠的致病性无明显改变.第81位、149位氨基酸突变则都能减弱突变株对小鼠的致病性,进而为研究NS1毒力相关位点的作用机制提供平台.
关键词： H1N1亚型流感病毒 定点突变 NS1蛋白 实时荧光定量PCR 致病性 -
硫氧还原蛋白突变基因用于鲑鱼降钙素的高效可溶性融合表达
为了化学裂解后重组多肽的分离纯化，用双引物定点突变的方法将表达质粒pTrx-sCT-Gly中硫氧还原蛋白(Trx)与鲑鱼降钙素(sCT)的融合基因的第38位Met突变为Ala，并将突变后的基因克隆到pET30a中，然后转入大肠杆菌BL21，以IPTG诱导，使降钙素与硫氧还原蛋白融合表达，融合蛋白占菌体总蛋白的56%左右。并发现本原核表达体系存在“表达渗漏”现象，此现象为在菌体的对数生长期中，外源蛋白极少表达，随着培养时间的延长，外源蛋白逐步积累，达到51%的高水平。该发现在基因工程生产重组蛋白工艺中具有应用价值。
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牛支原体新疆分离株重组P81膜蛋白的表达及鉴定
目的 重组表达牛支原体P81膜蛋白,为研制牛支原体疾病诊断试剂提供研究基础.方法 根据GenBank发表的牛支原体P81基因的编码序列,利用点突变试剂盒基于重叠延伸PCR原理设计5对引物,将P81基因的第165、690、1 455、1 674位编码色氨酸的TGA密码子分别突变为TGG,并连接到表达载体pET-32a(+),转化DH5α感受态细胞后经IPTG诱导表达目的蛋白,Western blot检测其反应原性.结果 成功扩增出4处TGA突变为TGG的牛支原体新疆分离株P81基因,大小与预期值2 112 bp一致.重组表达载体转化菌经IPTG 37℃诱导8h,表达分子质量单位(Mr)约94×10 3的目的蛋白,与预期相符.Western blot检测该蛋白能被抗P81多克隆抗体识别.结论 成功构建重组牛支原体P81膜蛋白基因表达载体,获得的目的蛋白具有良好反应原性,为研发牛支原体病免疫诊断试剂奠定了基础.
关键词： 牛支原体新疆分离株 定点突变 P81基因 Western blot -
催化甾体羟基化的P450氧化酶BM3的蛋白质工程的研究进展
甾体关键位点的羟基化在药用甾体的合成中发挥重要作用。为探究细胞色素 P450（CYP450）氧化酶 BM3在甾体羟基化合成中的潜在应用，基于细胞色素 P450 BM3的蛋白质工程逐渐发展起来。在取得的若干 P450 BM3突变酶的基础上，通过新一代测序技术和生物信息学分析等方法，筛选出催化甾体羟基化的相关 CYP450。根据易错 PCR等定向进化技术获得了突变位点信息，进一步采用（饱和）定点突变等进化技术对活性氨基酸位点进行分析，再经过筛选获得既高于亲本酶也高于易错 PCR技术得到的突变酶活力的新突变酶，并对突变体进行功能验证，进一步阐明甾体羟基化的可行性和重要性。此外，P450 BM3催化底物和生成产物的选择性可以通过迭代的组合活性位点突变而改变。本文旨在探究近年来科研人员在 P450氧化酶 BM3蛋白质工程催化甾体羟基化的改良领域中所做的尝试、获得的成果以及存在的问题，为 P450 BM3羟基化疏水性甾体的深入研究提供理论依据。
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CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶基因的定点突变研究
目的研究产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs)功能性基因片段的结构特征. 方法质粒电转移及质粒谱分析以定位CTX-M-14型基因;耐药质粒酶切基因文库(鸟枪法)技术及其计算机辅助在线分析以了解此酶功能性基因片段的分子结构特征;对Asn-104→Glu、Gly-232→Ala、Ser-237→Ala和Asp-240→Glu进行定点突变研究. 结果 CTX-M-14基因定位在85kb可转移多重耐药的质粒上;采用鸟枪法克隆到1.8 kb、2.4 kb、3.1 kb产CTX-M-14的功能性基因片段,序列分析显示其定位在耐药质粒上转座子基因结构中;Asn-104→Glu突变可显著降低CTX-M-14型ESBLs对头孢噻肟的水解能力. 结论 CTX-M-14基因定位在耐药质粒上转座子基因结构中;Asn-104可能是CTX-M型ESBLs重要的活性位点.
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炭疽保护性抗原受体结合区的关键氨基酸位点分析
目的分析炭疽毒素保护性抗原(PA)受体结合区与其功能相关的关键氨基酸位点.方法通过定点突变的方法将PA的Asp683分别突变成为一系列带有不同电荷以及不同长度侧链的氨基酸,通过细胞毒性实验分别探询电荷及立体结构对其活性的影响.同时对Asp683的一些邻近氨基酸进行了定点突变的研究.结果细胞毒性实验显示,不同的突变导致了PA活性不同程度的下降,其中Asp683电荷的改变对其活性的影响尤为明显,但当它突变为不带电荷的氨基酸时,PA仍然保留了一定的活性;而当Asp683突变为带正电的Lys后,PA却保留了相对较高的活性.结论 Asp683所带的负电荷在PA与其受体的相互作用中起着关键的作用,但PA与其受体之间的相互作用可能还通过一些其他方式进行.
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水痘-带状疱疹病毒疫苗株ORF62碱基突变及ORF62编码IE62反式激活力的分析
目的 分析水痘-带状疱疹病毒(VZV)疫苗株(vOka)ORF62碱基突变及ORF62编码即刻早期蛋白(IE62)对VZV基因启动子的反式激活力.方法 分别以vOka及其亲本株(pOka)基因组DNA为模板,PCR扩增获得ORF62全序列,克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建vOka和pOka ORF62表达质粒;采用双脱氧核苷酸链末端终止法对表达质粒中ORF62测序;应用基因转染瞬时表达技术比较vOka和pOka IE62在MeWo和CV1细胞中对VZV基因启动子的反式激活力差别.结果 成功构建vOka和pOka ORF62表达质粒pCAG-vOka62和pCAG-pOka62;测序结果发现,与pOka比较,vOka ORF62至少有9个碱基突变,其中106262、107136和107262位点碱基突变后分别产生Sma Ⅰ、BssH Ⅱ和Nae Ⅰ酶切位点.vOka IE62在MeWo细胞中对ORF4、ORF10和ORF61启动子的反式激活力低于pOka IE62,但在CV1细胞中对ORF9启动子的反式激活力高于poka IE62.结论 利用vOka ORF62碱基突变产生的酶切位点可鉴别vOka和pOka,vOka和poka IE62对VZV基因启动子的反式激活力差别可能与转染细胞类型有关.
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87位氨基酸在TM-TNF-α诱导靶细胞凋亡中的作用
目的研究TM-TNF-α分子结构与功能的关系,阐明其诱导靶细胞凋亡的分子机制. 方法构建定点突变的87/Phe TM-TNF-pcDNA3.0,并瞬时转染Cos-7细胞,利用MTT法,annexin Ⅴ,Western blot检测TM-TNF-α突变体的胞毒效应,对靶细胞死亡方式及对核转录因子NF-κB转位的影响. 结果 87位氨基酸置换后,TM-TNF-α对靶细胞的杀伤率无明显改变,但TM-TNF-α突变体通过促进NF-κB核转位,诱导靶细胞死亡的方式由凋亡转为坏死. 结论 87位氨基酸是TM-TNF-α诱导靶细胞凋亡的关键氨基酸残基,其所在的结构域可能是诱导凋亡的功能域.
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Ⅲ度房室传导阻滞与钠通道SCN5A基因相关分子遗传学机制研究
目的：探讨国人Ⅲ度房室传导阻滞患者与心脏钠离子通道编码基因SCN5A基因的相关性。
方法：收集我院Ⅲ度房室传导阻滞患者临床资料，并抽取外周血提取全基因组DNA。使用DNA直接测序法筛查SCN5A基因的外显子及外显子和内含子的交界区。如发现基因变异，通过对200位同种族的健康人群相对照，以鉴别基因变异类型。使用定点突变法对SCN5A质粒进行定点诱导突变，构建SCN5A-A1428S、SCN5A-S593G突变质粒，并通过DNA测序法验证突变成功后转染至人胚肾HEK293细胞。应用全细胞膜片钳技术检测野生型及突变型HEK293细胞的钠电流相关参数进行分析，探讨基因型及表型的关系。 -
先天性长QT综合征KCNQ1基因定点突变的研究
目的利用聚合酶链反应(PCR)技术对长QT综合征(LQTS)KCNQ1基因进行定点突变的研究.方法利用PCR定点突变技术,首先设计两对引物(包含预定的突变),通过3轮PCR扩增,扩增出含有所需突变位点的片段,然后将片段克隆入T载体中,通过酶切连接的方法将突变点引入到pIRES2-EGFP-KCNQ1中,随后用Effectene转染试剂介导转染HEK 293细胞.结果在真核表达载体pIRES2-EGFP-KCNQ1基础上获得了KCNQ1 cDNA C682T的突变体,测序结果表明在序列中发生了预期的突变.结论 KCNQ1定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础.
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SEDT-PA致病基因WISP3突变体的构建及在COS-7细胞中的表达定位
目的 通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(SEDT-PA)致病型(1000 T-C,840delT)Wnt诱导分泌蛋白3(WISP 3)与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体,观察其在COS-7细胞中的表达和亚细胞定位,为研究WISP 3突变致SEDT-PA的机理奠定基础.方法 从正常人软骨细胞获得野生型WISP 3基因的全长cDNA(WT-WISP 3);定点突变方法构建携带WISP 3基因致病型的重组真核表达质粒MUT1000 T/C/pEGFP-C 2和MUT840 delT/pEGFP-C 2;以空白载体pEGFP-C 2为对照,脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞,48 h后用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达;半定量RT-PCR法检测WISP 3基因的表达.结果 测序和酶切鉴定证实插入片段大小和序列的正确;突变体在COS-7细胞中均高效表达;荧光显微镜观察发现,转染野生型WISP 3基因的COS-7细胞中绿色荧光均匀分布在细胞浆和细胞膜,转染突变体的COS-7细胞中荧光呈斑点状染色和聚集现象.结论 成功构建了SEDT-PA致病基因WISP 3突变体,且发现野生型WISP 3蛋白定位于细胞浆和细胞膜,而突变型的WISP 3蛋白在细胞浆内异常聚集,为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造条件.
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HBV信号肽区热点变异真核表达载体的构建及对HBeAg表达的影响
采用分子生物学方法，设计引入KpnⅠ和HindⅢ酶切位点的引物扩增HBV 的Pre-C/C片段（1814～2452），经酶切后连于EBO真核表达载体，利用定点突变技术分别对连接载体进行T1862，A1896，A1899，A1896+A1899点的定点诱变。经错配PCR-RFLP和测序分析，确定突变的克隆。将突变前后的质粒以脂质体转染法转染HepG2细胞，检测不同点突变后HBeAg表达的改变。突变前后的质粒转染HepG2细胞经稳定表达，结果未突变的EBO-PreC/C重组质粒HBeAg表达为强阳性，A1899突变的重组质粒HBeAg表达比未突变的重组质粒稍弱，而转染EBO空载体和T1862，A1896，A1896+A1899重组质粒突变体的细胞培养上清HBeAg均为阴性。上述突变体的构建将为体外研究前C信号肽区热点变异对HBeAg在细胞中表达及对肝炎病毒基因组复制的影响奠定基础。
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利用Red重组系统在腺病毒大质粒上快速实现单碱基点突变
目的 在包含腺病毒全基因组40 kb的大质粒上快速实现单碱基突变.方法 通过重叠PCR方法扩增出含有突变位点的打靶DNA,将腺病毒大质粒和打靶DNA共同转化入Red高重组率大肠杆菌中,通过菌落PCR联合酶切鉴定的方法,筛选到携带突变位点大质粒的菌株.并将得到的突变大质粒再次转化入质粒高稳定菌株DH10B中,以保持质粒骨架的稳定性.结果 通过该法在腺病毒的9171位点和24410位点连续引入了2个单碱基突变.酶切鉴定了骨架质粒的稳定性,测序结果显示突变位点正确.结论 成功建立了一种快速在40 kb的腺病毒大质粒上实现单碱基突变的技术,阳性突变位点检出率在5%~15%,该法的建立为研究腺病毒的毒理作用提供了技术平台.
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人细胞周期相关激酶(CCRK)启动子的分析和特征研究
目的:分析人CCRK基因启动子、启动子的核心序列及与其表达相关的转录因子.方法:采用5′-RACE技术鉴定人CCRK基因的转录起始点;对启动子区3′端3个截短片段255 bp(-367/-128),210 bp(-322/-128)和160 bp(-272/-128)进行删除分析,双荧光素酶分析测出的小活性片段作为核心启动子的上游位点.通过生物软件MatInspector V2.2分析核心启动子区域,寻找并推测重要的转录因子,并对其核心序列进行定点突变分析,再通过电泳迁移率(EMSA)实验加以鉴定.结果:采用5′-RACE技术,得到的PCR产物直接测序,定位-242 "T"为转录起始点;通过启动子3′端小片段删除分析,255,210和160 bp均无活性,由此判断3′端255个核苷酸不存在核心启动子序列,并定位一段74 bp的区域为核心启动子(-441/-367)区域.通过MatInspector软件分析,发现在这段核心启动子区域内有3个重要的结合位点:Delta EF-1,NF-κB和Sp1.对这3个结合位点的核心序列进行定点突变后瞬时转染U373,经双荧光素酶分析发现Delta EF-1的活性明显升高,NF-κB没有变化,Sp1的活性降低但不太明显.进一步通过电泳迁移率(EMSA)实验鉴定,Delta EF-1和NF-κB能与U373核蛋白形成特异性的DNA-蛋白质复合体,表明Delta EF-1和NF-κB两个转录因子与人CCRK基因表达相关.结论:对人CCRK启动子的特性研究,为今后认识该基因的转录调控机制打下了基础,为揭示恶性神经胶质瘤的发生机制及防治措施的研究提供了新的思路.
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mpl/G-CSFR融合受体缺失体与突变体的构建
目的:构建mpl/G-CSF融合受体胞内区不同功能域缺失体以及酪氨酸点突变体,并获取稳定转染细胞株,用以研究受体不同区域以及不同酪氨酸的功能.方法:用普通PCR法扩增融合受体短截体,用重叠延伸PCR法和QickChange定点突变法获得融合受体酪氨酸点突变体,并将mpl/G-CSFR全长融合受体转染BaF3细胞.结果与结论:获得mpl/G-CSF融合受体3个短截体和4个点突变体,并筛选到全长融合受体的稳定转染细胞株,为深入研究受体的功能奠定了基础.
