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ret基因体外定点突变及其突变效应分析
目的 体外完成ret基因cDNA 2 753处T→C定点突变,并理论分析突变后效应.方法 采用PCR诱导突变完成ret体外定点突变;利用OMIGA2.0蛋白分析软件,通过分析突变前后ret基因cDNA序列变化,预测RET蛋白构象、结构域及理化性质改变.结果 PCR筛选突变序列佳复性温度为61℃;DNA序列分析提示ret基因cDNA 2 753处碱基由T变为C;软件分析后发现,点突变导致相应位置处蛋白质二级结构折叠方向改变,且增添一个新的磷酸化位点.结论 ret基因体外定点突变完成;cDNA 2 753处T→C单点突变可能是MEN2B发生的分子机制.
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基于酶催化抗体药物偶联物中抗体的定点突变及鉴定
谷氨酰胺转移酶催化谷氨酰胺与赖氨酸及其衍生物形成异肽键,可用于抗体与小分子药物的定点偶联.本文在构建的抗人CD24嵌合抗体cG7的基础上,定点突变cG7获得具有4个可催化的谷氨酰胺位点的嵌合抗体cG7Q.本研究采用overlap PCR技术将抗体重链CH段第297位天冬酰胺突变成谷氨酰胺,构建含突变重链的真核表达载体.将含突变重链与轻链的载体共转染CHO-s细胞,筛选稳定高产单克隆细胞株,表达及鉴定目的蛋白cG7Q,表面等离子共振法与流式细胞术分析cG7Q与人CD24分子的结合能力,乳酸脱氢酶释放实验鉴定定点突变对抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响,结果显示,经改造的cG7Q保持母体单抗的结构和特异性结合能力及部分ADCC效应,为后续制备靶向CD24定点偶联药物奠定基础.
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蝎毒活性肽BmK AngM1的定点突变及其抗炎活性研究
蝎毒活性肽BmK AngM1具有良好的镇痛活性,但目前对其抗炎活性的研究尚未有报道.本研究利用Escherichia coli BL21 trxB (DE3)对BmK AngM1进行了重组表达,利用IMPACTTM-TWIN系统建立了重组BmK AngM1 (rBmK AngM1)的纯化方法,并对rBmK AngM1进行了抗炎活性检测.为了进一步提高其抗炎活性,本研究对BmK AngM1功能结构域中可能的活性位点(Y5、Y42和R58)进行了定点突变.结果表明,rBmK AngM1及其突变体均具有显著的抗炎活性,其中单突变体R58N及双突变体Y5F/R58N、Y42F/R58N与野生型蛋白相比,抗炎活性均有明显提高.由此推测,58位残基在BmK AngM1的抗炎活性中起重要作用.本研究为通过蛋白质工程设计改造BmK AngM1以提高其药理活性奠定了基础.
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定点突变对BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白表达和复性率的影响
为提高BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白在原核表达系统中的表达和复性率,采用定点突变法改造pBV-BPI600-Fcγ1700重组表达载体,转化E.coli DH5α后,通过温控诱导表达.结果表明:①突变后BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白表达量比突变前提高约10%;②表达时间提前约1 h;③抗菌活性未受影响;④复性率未见显著提高.
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Bβ448野生型及突变型纤维蛋白原稳定转染细胞系的建立
目的 构建野生型(BβArg448)和突变型(BβLys448)纤维蛋白原稳定表达细胞系,为进一步研究BβArg448Lys基因多态性的病理生理学意义及相关蛋白功能研究提供实验基础.方法 以含纤维蛋白原野生型Bβ链cDNA全长的表达载体pMLP-FGB(448G)为模板,采用PCR定点突变技术构建BβLys448表达载体,即突变型质粒pMLP-FGB(448A).应用脂质体转染及药物加压筛选的方法,将纤维蛋白原Aα链、野生型/突变型Bβ链、γ链表达载体共同转染至CHO-K1细胞,RT-PCR检测各条链mRNA的表达.结果 野生型及突变型纤维蛋白原稳定转染细胞系在转录水平构建成功.结论 野生型及突变型纤维蛋白原稳定转染细胞等在转录水平构建成功,为进一步体外研究BβArg448Lys所致纤维蛋白原的结构与功能异常奠定了基础.
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应用改良PCR法构建高GC含量启动子多位点定点突变载体
目的 利用StrataGene公司的QuickChangeTM定点突变试剂盒对高GC含量的人肝刺激因子启动子进行多位点定点突变.方法 采用含有多位点突变的引物扩增启动子片段,通过加入不同浓度的DMSO, 降低高GC含量模板及引物的解链温度,利用乙醇沉淀提高酶切产物的浓度.结果 经测序鉴定成功构建5个含有不同突变位点的hHSS启动子突变载体.结论 这种改良的PCR方法提高了对高GC含量启动子进行扩增的效率,具有快速、简便、经济、成功率高的特点,是值得推广的多位点定点突变载体构建方法.
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注射用重组人新型白介素-2(欣吉尔)研制和应用
本项目是用基因工程的方法生产新型白介素-2(125A1a),属生物技术领域.产品是肾癌、恶性黑色素瘤、癌性胸腺水等恶性肿瘤的生物治疗制剂.白介素-2作为一种淋巴因子,可提高人体对肿瘤细胞、病毒和细菌等感染的免疫应答,是一种免疫增强剂.项目包括几个部分:①定点突变的基因克隆及高表达菌株的构建;②中试及生产工艺的研究;③临床前药理、药效、毒理学评价;④临床多中心评价;⑤项目的推广应用.项目主要技术关键是克隆125位Cys突变成A1a的人IL-2基因并在大肠杆菌中获稳定、高效表达,特点和技术创新在于菌株125A1a IL-2表达率达30%～50%,定点突变后产品更易于复性且活性蛋白回收率高,比活性、热稳定性增加,体内半衰期延长.
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野生型及突变型α-synuclein转基因表达载体的构建
目的构建中枢神经系统特异表达的野生型及突变型α-synuclein转基因表达载体.方法通过PCR方法扩增α-synuclein基因,产物亚克隆到pGEM-T载体,经测序无误后克隆到pCEP4载体,并用神经特异的PDGF启动子替代pCEP4载体的CMV启动子构建野生型转基因表达载体.利用大引物突变法构建A53T和A30P的转基因表达载体.结果通过限制性内切酶及DNA测序证实野生型及突变型α-synuclein均成功的克隆到所需要的载体中.结论该转基因表达载体的成功构建为帕金森氏病转基因动物的构建及帕金森氏病发病机制的研究奠定基础.
关键词： α-synuclein 定点突变 -
酵母单一亚单位NADH-泛醌氧化还原酶定点突变对酶活性及泛醌结合部位的影响
目的：采用定点突变方法探讨突变体对酵母Ndi1的NADH-泛醌氧化还原酶活性及泛醌结合部位的影响。方法定点突变方法将Ndi1的His残基（His193、His252、His301）突变为丙氨酸，转染大肠杆菌后表达蛋白，测定光谱特性，NADH-泛醌氧化还原酶活性和米氏常数Km及大反应速度Vmax。结果各突变体蛋白H193A、H252A、H301A吸收光谱显示均在383nm和448nm处出现两个FAD峰与野生型一致；各突变体酶活性显示，突变体对UQ1的Vmax均明显减小，但仅H301A对UQ1的Km增加约3倍，对UQ亲和力明显减小。各突变体蛋白对NADH的Km未见明显增大，但Vmax均出现明显减小。结论酵母Ndi1中H301点突变可能是参与形成UQ结合位点所需的氨基酸残基之一，该位点突变影响了UQ与酶的结合及电子向UQ的传递。
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大鼠血红素加氧酶-1变异体对血清胆红素水平的影响
新生儿高胆红素血症是临床常见病症，传统疗法只能清除已经形成的胆红素，至今尚无一条有效途径能起到早期预防和治疗的作用。微粒体血红素加氧酶-1 (Heme Oxygenase-1, HO-1) 是血红素氧化降解为胆绿素的限速酶，抑制HO-1活力则能有效降低血清胆红素水平。本实验采用定点突变法以构建变异体大鼠HO-1 cDNA（25位组氨酸→丙氨酸，His25Ala），检测变异体HO-1活力，并在酶促反应系统内加入与野生型HO-1等量的变异体HO-1，测定胆红素含量，以评价变异体HO-1的抑制作用，为临床防治新生儿高胆红素血症提供一条新途径。 一、材料与方法 1.剪切的野生型大鼠 HO-1 cDNA表达型质粒的构建：BamHI酶切表达型质粒pcDNA3后形成的粘性末端经DNA聚合酶I填平（Klenow大片段）。
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基于PCR的体外诱变技术
定点突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一,可以有目的改变DNA序列中的碱基.它不仅可以阐明基因表达的调控机理,还可用研究蛋白质结构与功能间的关系,改造天然蛋白质,使之更符合应用需求.自从PCR技术发明以来,便被用于进行定点突变.综述了各种基于PCR技术的定点突变方法,并与其他定点突变方法进行对比.
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突变型人PRKAG2基因的克隆及其表达载体构建
目的 构建含有定点突变的人PRKAG2基因表达载体.方法 首先应用Trizol法抽提健康人全血mRNA,通过实时聚合酶链反应(RT-PCR)克隆得到野生型人PRKAG2 cDNA;继而通过聚合酶链反应(PCR)定点突变的方法获得突变型人PRKAG2基因,命名为G100S,后应用酶切连接的方法得到重组载体pEGFP-G100S.结果 Trizol法提取人细胞mRNA,经RT-PCR合成cDNA第一条链,特异性引物PCR扩增得到PRKAG2基因片段,目的片段条带在1761 bp左右.分段克隆得到的G100S片段分别为300 bp与1500bp左右.转化Top10感受态细菌,PCR筛选阳性菌落5个克隆有3个克隆可见1800 bp左右的阳性片段,筛选得到pEGFP-G100S重组阳性克隆.测序证实重组载体pEGFP-G100S构建成功.结论 构建的含定点突变人PRKAG2基因重组载体pEGFP-G100S为进一步研究基因PRKAG2 G100S突变的功能奠定了基础.
关键词： PRKAG2基因 定点突变 pEGFP-N1载体 人 -
Annexin A2的表达上调及其23位酪氨酸磷酸化促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖和侵袭
目的:构建以慢病毒质粒pCDH为载体的人Annexin A2(Anxa2)基因及其不同活性状态的突变体的重组质粒,筛选并验证稳定表达目的基因的人乳腺癌细胞MCF-7,观察不同表达水平及不同的酪氨酸磷酸化状态下Anxa2对乳腺癌细胞MCF-7增殖及侵袭能力的影响.方法:以质粒pEGFP-N3-Anxa2为模板,利用PCR定点突变技术获得Anxa2基因的不同活性状态的突变体—pEGFP-N3-Anxa2Y23A和pEGFP-N3-Anxa2Y23D.以慢病毒质粒pCDH和pEGFP-N3-Anxa2及其突变体为模板,通过亚克隆技术获得重组质粒pCDH-EGFP-Anxa2WT、pCDH-EGFP-Anxa2Y23A及pCDH-EGFP-Anxa2Y23D.利用慢病毒感染获得稳定表达Anxa2及其突变体的MCF-7细胞.分别采用MTT和克隆形成、划痕和transwell法测定MCF-7的增殖、迁移和侵袭能力.结果:表达Anxa2-WT及Anxa2-Y23D蛋白的MCF-7细胞的增殖、迁移及侵袭能力明显提高.结论:Anxa2的表达上调及其23位酪氨酸的磷酸化促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖及侵袭.
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超氧化物歧化酶基因突变在大肠埃希菌中表达
目的在克隆人源铜锌超氧化物歧化酶基因(hCu,Zn-SOD)的基础上,对hCu,Zn-SOD进行定点突变,使其在E.coliDH5α中表达,为进一步改造hCu,Zn-SOD基因奠定基础.方法首先构建质粒pESOD,然后用定点突变技术把其中hCu,Zn-SOD的Cys111密码子突变为Ala111密码子,再与pUCMT1相连接,构建表达载体pE-SODT111,使其在E.coliDH5α中表达,表达产物用改良的邻苯三酚法和Westem杂交测定.结果hCu,Zn-SOD突变后在E.coliDH5α中成功表达,表达产物具有SOD活性,活力为16.447 U/ml培养液.结论hCu,Zn-SOD基因经过定点突变后构建的表达载体可在DH5n中表达,表达产物同样具有天然的hCu,Zn-SOD活性.
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金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因定点突变分析
目的 利用金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因His118定点突变,以获得超抗原性保持不变的减毒肠毒素.方法 利用PCR介导的定点突变技术,对SEc2基因中的His118密码子进行定点突变,得到的带有突变基因的表达质粒在大肠埃希菌中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达.采用镍离子金属整合(NiNTA)亲和层析和凝胶过滤层析纯化突变体蛋白,并测定突变体蛋白超抗原性及体外抑瘤效果.结果 应用点突变试剂盒,PCR扩增得到SEc2突变体表达质粒pET-28a-SEC2(H118Y)在1nmol.L IPTG诱导下高效表达.突变体蛋白SEC(H118Y)在2～200ng时刺激人体细胞增殖效果与sEC2基本一致,体现二者具有相同的超抗原性.SEC(H118Y)时,在2～200ng与SEC2抑制大肠癌细胞Cx-1效果基本相同,而在500ng时,SEC(H118Y)抑瘤效果明显优于与SEC2.结论 SEC(H118Y)超抗原性和抑瘤活性没有因His118位点的突变而改变.
关键词： 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒索C2 定点突变 PBMC增殖 体外抑瘤 -
R31L TNF-α突变体重组质粒的构建、真核表达及其产物的胞毒效应
目的:研究膜型、分泌型TNF-α的31位氨基酸在其生物学效应中的作用,进一步探讨TNF-α结构与生物学效应的关系.方法:采用重叠PCR方法将wt TNF-α 31位精氨酸(R)密码子(CGC)定点突变替换成亮氨酸(L)密码子(CTC),构建R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,采用脂质体转染法将其瞬时转染COS-7细胞进行表达,通过MTT法检测R31L TNF-α突变体的胞毒效应.结果:酶切、PCR及测序鉴定证实目的基因R31L TNF-α正确连接到pcDNA3.0的多克隆位点;TNF-α 31位突变可增强sTNF-α的胞毒效应,突变体的CC50值是野生型的1/10,而对mTNF-α的生物学效应无明显影响.结论:本实验成功地构建了R31L TNF-α-pcDNA3.0重组质粒,且在真核细胞COS-7中获得表达;TNF-α 31位置换成亮氨酸后,主要增强其分泌型分子的胞毒效应,而对其膜分子无作用.
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重症肌无力治疗性单价IgG抗体基因的构建
目的:构建一株对重症肌无力(MG)具有特异性免疫治疗作用的单价IgG类抗体基因.方法:应用定点突变技术,将致病性抗乙酰胆碱受体(AChR)抗体IgG637的重(H)链第322位氨基酸进行K322A突变,获得的突变型抗体IgG637/K322A基因再进行H链互补决定区3(CDR3)缺失突变,获得突变型抗体IgG637/K322A/CDR3ΔPLKP基因.经转化大肠杆菌XL1-Blue进行增殖后,转染哺乳类细胞CHO-k1进行表达,表达产物经ELIAS检测与补体C3的结合活性,经RIA检测与特异性抗原人AChR的结合活性.突变抗体H链再经杵(T366Y)臼(Y407T)突变,以利于异源H链的配对.结果:突变型抗体IgG637/K322A丧失了与补体C3结合的能力,突变型抗体IgG637/K322A/CDR3ΔPLKP丧失了与人AChR结合的能力.测序证实已经获得了预想的杵臼突变序列.结论:已经成功的制备了无补体激活能力的单价IgG类抗AChR抗体基因.
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HBV A83点变异真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达
研究A83点突变的生物学意义.采用分子生物学方法,设计引入KpnⅠ和Hind Ⅲ酶切位点的引物扩增乙型肝炎病毒(HBV)ayw亚型的PcP10标准株中的Pre-C/C片段(1 814-2 452),经Kpn Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后,在T4DNA连接酶的作用下连于EB病毒真核表达载体,利用定点突变技术对连接载体进行1 896点的定点诱变.经错配PCR-RFLP和测序分析,确定突变的克隆.提取突变前后的质粒转染HepG2细胞.突变后在Pre-C/C第28位氨基酸形成终止密码,使HBeAg合成终止,转染HepG2细胞后未能检测到HBAg,而未突变的重组质粒则HBeAg表达为强阳性.HBVA83点突变真核表达载体的构建为体外研究该点突变对HBeAg表达的影响以及HBeAg阴性的乙型肝炎病毒感染的致病机理奠定基础.
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不同温度对人类肽基脯氨酰顺反异构酶蛋白及突变体交联反应的影响
目的：研究不同温度对人类肽基脯氨酰顺反异构酶（ hPPI）体外交联反应的影响。方法以人总 RNA为模板设计正反引物进行hPPI基因克隆，以获取的正常型表达载体为模板，利用PCR定点突变的方法将hPPI基因中两个半胱氨酸（ Cys）突变为丝氨酸（ Ser），经异丙基硫代半乳糖苷（ IPTG）诱导表达正常型和突变型蛋白，在不同温度条件下进行蛋白交联反应，聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS－PAGE）鉴定交联现象。结论与溶菌酶表现相似，正常型hPPI蛋白交联反应随温度升高而逐渐加快，在达到蛋白变性温度时交联反应明显，出现大量二聚体和多聚体条带；将突变型hPPI蛋白置于与正常型hPPI蛋白完全相同的反应条件下，观察不到任何交联条带。结论热变性可显著改变蛋白高级结构，蛋白对热变性无明显特异性，在变性温度临界条件下表现出相同的聚合作用；二硫键可导致蛋白结构改变，从而影响交联结果。
关键词： 人类肽基脯氨酰顺反异构酶( hPPI) 蛋白质交联 定点突变 温度 二硫键 -
p53基因突变子175 H、248 W和273 H的定点突变及表达载体的构建
目的:定点诱变合成p53基因突变子进而构建表达载体.方法:以野生型p53基因为模板,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物,将突变位点设计在引物上,通过重叠延伸法2次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,后将扩增片段克隆入pcDNA3.1载体中.结果:在预期位点已经发生突变,p53基因第175位密码子由精氨酸(cgc)突变为组氨酸(cac),第248位密码子由精氨酸(cgg)突变为色氨酸(tgg),第273位密码子由精氨酸(cgt)突变为组氨酸(cat).p53基因突变子表达载体成功构建.结论:PCR技术诱导定点突变准确、高效.基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点奠定了基础.
