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基于酶催化抗体药物偶联物中抗体的定点突变及鉴定
谷氨酰胺转移酶催化谷氨酰胺与赖氨酸及其衍生物形成异肽键,可用于抗体与小分子药物的定点偶联.本文在构建的抗人CD24嵌合抗体cG7的基础上,定点突变cG7获得具有4个可催化的谷氨酰胺位点的嵌合抗体cG7Q.本研究采用overlap PCR技术将抗体重链CH段第297位天冬酰胺突变成谷氨酰胺,构建含突变重链的真核表达载体.将含突变重链与轻链的载体共转染CHO-s细胞,筛选稳定高产单克隆细胞株,表达及鉴定目的蛋白cG7Q,表面等离子共振法与流式细胞术分析cG7Q与人CD24分子的结合能力,乳酸脱氢酶释放实验鉴定定点突变对抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的影响,结果显示,经改造的cG7Q保持母体单抗的结构和特异性结合能力及部分ADCC效应,为后续制备靶向CD24定点偶联药物奠定基础.
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口服氟伐他汀导致药物性肝病1例
病例:患者,女,75岁.主诉"腹痛伴发热、寒战1天"于2009年12月2日入院.既往高血压病史多年,平时口服硝苯地平缓释片10mg,每天2次;复方盐酸阿米洛利片(武都力)1片,每天1次.于2009年9月查体发现高脂血症,转氨酶正常.11月15日口服氟伐他汀1片,出现腹痛,当时自行缓解未在意,未再服该药.入院前1天再次口服氟伐他汀(商品名:来适可,规格:40mg×7,北京诺华制药,批号:20090101)40mg.查体:体温38.7℃,血压120/80mmHg,心率67次/分,呼吸20次/分,腹软,右下腹及左下腹压痛(+),无反跳痛,肝脾肋下未及,肝脾区无叩击痛,肠鸣音3～4次/分钟,Murphy征(一).实验室生化检查多项异常:谷丙转氨酶(ALT)333U/L,谷草转氨酶(AST)335U/L,总胆红素33.9μmol/L升高(正常5～21μmol/L),直接胆红素9.5 μmol/L(正常0～5μmol/L)升高,间接胆红素24.4 μmol/L升高(正常1.0 ～ 20μmol/L),谷氨酰胺转移酶164U/L,乳酸脱氢酶389U/L,均较正常显著升高.
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谷氨酰胺转移酶6的结构及功能研究进展
谷氨酰胺转移酶(TG)是具有多种催化功能的蛋白家族,其中基因TGM6编码的谷氨酰胺转移酶6(TG6)在脑内分布较多,主要催化转酰胺基反应,使谷氨酰胺与赖氨酸之间形成异肽键交联,这种交联既可以在分子内部也可以在分子间形成.越来越多研究发现TGM6与多种神经系统疾病相关.文中介绍了TG,尤其是TG6的结构、分布、功能及其在神经系统疾病中可能发挥的作用.
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组织型谷氨酰胺转移酶反义寡核苷酸对体外培养牛眼小梁细胞纤维连接蛋白、层粘连蛋白及Ⅳ胶原表达的影响
目的观察组织型谷氨酰胺转移酶(tissue transglutaminase,tTG)反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASODN)对牛眼小梁细胞(bovine trabecular meshwork cells,BTMC)纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)、Ⅳ胶原(collagen-Ⅳ,CA-Ⅳ)表达的影响.方法在脂质体介导下,将0.3 μmol·L-1的tTG-ASODN转染BTMC,无血清DMEM培养基为空白对照组.24 h后,制作细胞爬片,利用免疫组化SP染色法检测tTG-ASODN对BTMC表达FN、LN、CA-Ⅳ的影响.结果空白对照组和ASODN转染组FN、LN和CA-Ⅳ免疫组化染色均为阳性.通过对细胞爬片进行图像统计学分析,与空白对照组相比,ASODN1和ASODN2组中FN、LN、CA-Ⅳ的表达均明显下降(P<0.01),而ASODN1和ASODN2 2组之间没有显著性差异(P>0.05).结论进一步证明了tTG可以促进BTMC表达细胞外基质.通过tTG-ASODN抑制BTMC表达FN、LN、CA-Ⅳ,从而有望从基因水平上防治原发性开角型青光眼.
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tTG AS-ODN抑制培养的牛眼小梁细胞表达纤维连接蛋白的研究
目的 观察组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)AS-ODN(AS-ODN)对体外培养牛眼小梁细胞(BTMCs)纤维连接蛋白(FN)表达的影响.方法 设空白对照组、tTG AS-ODN1组和tTG AS-ODN2组.在脂质体介导下,将0.3μmol/L的tTG AS-ODN转染BTMCs,利用免疫组织化学SP染色法检测BTMCs表达FN情况,采用半定量RT-PCR和Western blot方法检测表达的变化.结果 免疫组织化学结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组灰度均值与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.91).RT-PCR结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组FN/β-actin条带中心密度比与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.73).Western blot结果显示,AS-ODN1和AS-ODN2组FN/β-actin灰度比值与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01),AS-ODN1和AS-ODN2组差异无统计学意义(P=0.92).结论 tTG可以促进BTMCs表达ECM.通过tTG AS-ODN抑制BTMCs表达FN等细胞外基质(ECM),有望从基因水平上防治原发性开角型青光眼(POAG).
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凝血酶诱导皮质神经元凋亡及其机制研究
目的研究凝血酶(Tm)诱导大鼠脑皮质神经元凋亡的机制及组织型谷氨酰胺转移酶(tTG)的作用.方法不同浓度Tm单独或与PAR-1受体抑制剂组织蛋白酶(CAT)G一起处理原代培养大鼠脑皮质神经元,流式细胞仪和Hoechest荧光检测细胞凋亡;免疫荧光染色和微量滴定法检测细胞内tTG酶蛋白表达和酶活性.结果 Tm能剂量依赖性诱导脑皮质细胞凋亡,0.625 U/mTm诱导的细胞凋亡率为10.0%,细胞内tTG酶活性为(11.3±0.2) mU/mg;5 U/ml Tm引起的凋亡率增至31.0%,tTG酶活性亦升至(31.1±0.9) mU/mg,同时免疫荧光也检测到酶蛋白表达.结论 Tm通过PAR-1受体诱导脑皮质神经元凋亡,tTG可能参加胞浆内信号传导途径.
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组织型谷氨酰胺转移酶抑制剂对凝血酶脑组织毒性的影响
目的 通过动物在体实验了解组织型谷氨酰胺转移酶(tissue transglutaminase,tTG)抑制剂(monodansyl-cadaverine,MDC)对凝血酶(thrombin,Tm)脑组织毒性的影响.方法 第1组动物用4种剂量的Tm(0、5、10、15U溶于5μl生理盐水)通过立体定向仪注射入大鼠纹状体,第2组动物在各剂量Tm中同时加入MDC(5mM)加以干预作为相应对照,动物存活24 h后取注射部位石蜡包埋切片,做常规HE染色和凋亡特异性TUNEL染色及照相.观察两种染色的切片细胞变化并对各组TUNEL特异染色的凋亡细胞进行计数,以了解在大鼠体内MDC抑制tTG对Tm诱导凋亡作用的影响.结果 Tm处理脑组织的胞体发生肿胀,细胞核发生浓缩固缩现象,核仁消失,核膜完整性破坏,且浓度越高异常形态的细胞越多.而在对照的Tm+MDC处理组织切片的异常细胞减少.TUNEL凋亡细胞特异性染色计数,5、10和15UTm凋亡细胞数分别为(13.78±3.31)、(25.56±4.16)和(35.00±5.96)个;而同时加入MDC3种不同浓度的凋亡细胞数分别为(8.56±2.51)、(16.89±2.03)和(28.33±5.83)个.结论 MDC可通过抑制tTG减少Tm引起的细胞凋亡.
