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黄药子诱导肝损伤大鼠血清脂肪酸的代谢轮廓
中药黄药子具有肝毒性,黄药子诱导的肝损伤大鼠的血清脂肪酸代谢轮廓尚不清楚.本文采用气相-质谱联用技术定量分析空白组、黄药子醇提物(ethanol extraction,ET)组和黄独素B(diosbulbin B,DB)组大鼠血清中16种游离脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)和酯化脂肪酸(esterified fatty acids,EFA),借助化学计量学方法分析大鼠灌胃黄药子或黄独素B后血清中脂肪酸代谢轮廓的变化.NEFA含量测定结果显示,DB组棕榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、油酸、异油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳三烯酸、花生四烯酸和二十二碳六烯酸含量显著降低;ET组亚油酸和二十碳三烯酸含量显著升高,花生四烯酸、二十二碳六烯酸含量显著降低.EFA含量测定结果显示,ET组和DB组棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量显著降低.主成分分析表明,ET组和DB组的大鼠血清脂肪酸代谢轮廓明显偏离正常水平,且ET组偏离程度大于DB组.偏小二乘法-判别分析表明,花生四烯酸和二十二碳六烯酸对ET和DB的肝毒性具有重要贡献,且与谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素具有良好的相关性,被鉴定为黄药子肝毒性的潜在生物标识物.本研究为深入研究黄药子的肝毒性的分子作用机制奠定基础.
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大鼠灌胃黄独素B单体和黄药子醇提物后黄独素B的药动学和组织分布比较
目的 研究黄独素B(DIOB)在大鼠体内的血浆药动学和组织分布特征,并比较DIOB单体和黄药子醇提物(EEDB)给药后DIOB血浆和组织暴露以及消除的差异.方法 建立并验证了定量分析血浆和组织样品DIOB的液相-串联质谱法(LC-MS/MS).SD大鼠ig给予DIOB 1.3 mg·kg-1和EEDB 1.0 g·kg-1,不同时间点采样,测定血浆和组织样品中的DIOB浓度.快速平衡透析法测定DIOB在血浆和组织的蛋白结合率.采用WinNonlin 6.4软件拟合并获得药动学参数.结果 大鼠给予DIOB单体和EEDB后,血浆DIOB的峰浓度(cmax)和达峰时间(tmax)分别为312±67和(131±84)μg·L-1(P<0.01)以及0.12±0.07和(0.23±0.17)h;消除半衰期(t1/2)分别为1.17±0.28和(2.34±0.83)h(P<0.05).组织分布研究结果表明,DIOB在肺的分布浓度高,其次是肝和肾.DIOB单体组DIOB在肺、肝和肾组织的AUC(0-24 h)分别为4527.0±557.7,183.0± 51.1和(64.4±22.4)ng·h·g-1,EEDB组分别为6507.9±424.3(P<0.01),467.5±202.7(P<0.05)和(238.6± 70.0)ng·h·g-1(P<0.01).DIOB的血浆、肝和肺组织的蛋白结合率为38.7%~43.6%,61.3%~66.9%和61.4%~64.7%.DIOB肺/血浆游离浓度AUC比值>48.结论 DIOB以单体和EEDB 2种形式给药后,大鼠血浆动力学和组织分布存在一定的差异.DIOB在肺组织的分布具有较强的靶向性.在黄药子和DIOB的药效学和毒理学研究中应关注上述特征和差异.
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黄药子质量控制方法研究
目的:对中药黄药子的质量标准进行初步研究.方法:以75％乙醇提取,采用薄层色谱法进行定性鉴别;采用Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5μm)柱,以乙腈-0.15％磷酸水(35∶65)为流动相,流速1 mL/min,检测波长215 nm,高效液相法测定黄独素b的含量.结果:在TCL鉴别中,黄独素b的斑点清晰,分离效果好;在高效液相色谱中,黄独素b平均回收率为99.40％,RSD为0.51％.结论:本实验建立的黄药子中黄独素b的鉴别和含量测定方法简便、准确、重复性好,适用于本品的质量控制.
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正交设计优选黄药子中黄独素B的提取工艺
目的 优选黄药子中黄独素B的提取工艺.方法 高效液相法测定黄独素B的量,正交设计优选佳提取工艺.结果 黄独素B的佳提取工艺为6倍量的75％乙醇提取3次,每次2h.结论 该实验确定的提取工艺稳定可靠,具有良好的应用前景.
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黄药子质量标准研究
目的 建立黄药子的质量标准.方法 采用薄层色谱法对黄药子中黄独素B进行定性研究;采用高效液相色谱方法定量检测黄独素B,选用ZORBAX Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm,5μm);柱温为35℃;流动相为甲醇-0.1％磷酸溶液(32∶68);体积流量1.0 mL/min;检测波长为210 nm;依据《中国药典》2010年版方法对黄药子进行水分、总灰分等各项检查.结果 黄药子药材中水分10.5％ ～ 13.2％,总灰分2.22％ ～4.02％,酸不溶性灰分0.08％ ～0.63％,醇溶性浸出物含有量7.6％ ～ 12.9％;饮片中水分8.1％ ～11.7％,总灰分2.78％ ～3.84％,酸不溶性灰分0.06％～0.53％,醇溶性浸出物含有量6.9％～12.0％;薄层鉴别专属性强;黄药子药材和饮片中黄独素B含有量在0.15％ ～0.48％范围内.黄独素B在进样量0.155 36～1.553 6μg (r=0.999 9)范围内具有良好的线性关系,平均回收率为100.26％ (RSD=1.47％).结论 本方法可靠、准确、专属性强,可作为黄药子的质量控制方法.
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黄独素B致小鼠肝损伤过程中对肝外排型转运体Mrp2表达的影响
目的:探究黄独素B引起小鼠肝损伤过程中肝转运体Mrp2的变化情况.方法:雄性ICR小鼠分为试验组和对照组,每组8只.试验组以50 mg·kg-的剂量灌胃给药黄独素B 14 d后,摘眼球取血分离血清测定肝功生化指标、称量肝脏重量计算肝重指数、制作肝脏病理切片,后采用免疫印迹方法测定肝脏转运体Mrp2的表达变化情况.结果:黄独素B给药组小鼠肝重指数及肝功生化指标如谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、总胆汁酸、总胆红素和直接胆红素等均比空白对照组升高,差异具有统计学意义.同时,与空白对照组相比,给药组肝外排型转运体Mrp2表达明显降低,差异具有统计学意义.结论:黄独素B口服能够引起小鼠肝脏外排型转运体Mrp2表达的下降,阻碍胆红素、胆汁酸及毒性物质外排而造成其在体内及肝内的蓄积,该变化可能是黄独素B引起药源性肝损伤的机制之一.
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星点设计-效应面法优化黄独素B分散片的制备工艺
目的:优化黄独素B分散片的制备工艺,提高黄独素B的溶出速率.方法:建立黄独素B分散片体外溶出度测定方法;采用星点设计-效应面法,以填充剂微晶纤维素(MCC)的用量、载药量、助流剂微粉硅胶用量及崩解剂交联羧甲基淀粉钠(cCMS-Na)用量作为考察因素,以体外溶出度和崩解时限为指标,对黄独素B分散片成型工艺进行优选.建立二次多项式模型描述考察指标和4个因素之间的数学关系,绘制效应面图,确定较优处方并进行验证试验.结果:优选的佳处方比例为:黄独素B:3.13％,MCC:35％,纤维素乳糖:53.24％,cCMS-Na:7.5％,微粉硅胶:1.13％.结论:采用星点设计-效应面法优选的黄独素B分散片成型工艺简便、可行性高,且崩解时限短、体外溶出快.
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黄独素B致小鼠急性肝损伤的代谢组学研究
目的:从代谢层面探索黄独素B致小鼠急性肝损伤的潜在生物标志物,研究其肝毒性作用机制.方法:将24只小鼠随机分成正常组(0.5％羧甲基纤维素钠溶液)和黄独素B组(200 mg/kg),每组12只.一次性灌胃给予相应药物24 h后,检测小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平和肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;采用苏木精-伊红染色法观察肝组织病理学变化;采用核磁共振氢谱(1H-NMR)检测尿液和肝组织中的代谢产物水平,并采用正交偏小二乘法-判别分析(OPLS-DA)筛选黄独素B肝毒性的潜在生物标志物.结果:与正常组比较,黄独素B组小鼠血清中ALT、AST水平均显著上升,肝组织中MDA水平显著上升、SOD水平显著下降(P<0.05);肝组织细胞受损,出现明显病理性改变;尿液和肝组织中代谢产物水平发生显著改变,各筛选得到3种和6种与肝损伤相关的潜在生物标志物(P<0.05),分别为α-酮戊二酸、二甲胺、氧化三甲胺(尿液)和谷胱甘肽、牛磺酸、肌苷、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸(肝组织).结论:黄独素B主要是通过自由基氧化作用损伤肝细胞,其对机体三羧酸循环、氨基酸代谢、肠道菌群产生影响可能是其肝毒性的作用机制.
