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建立金黄色葡萄球菌肠毒素B悬浮芯片定量检测方法
目的 建立金黄色葡萄球菌肠毒素B悬浮芯片定量检测方法.方法 利用双抗体夹心法免疫学原理,以金黄色葡萄球菌肠毒素B的特异性抗体包覆微球为载体,利用悬浮芯片(Bio-Plex)系统建立检测模型;检测不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B,测定方法的灵敏性;通过该方法对大肠杆菌、普通变型杆菌、蓖麻毒素和禽流感病毒HA、NH蛋白和金黄色葡萄球菌热休克毒素的检测,判断方法的特异性;将不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B添加到奶粉中验证方法的实用性和稳定性.结果 悬浮芯片方法对金黄色葡萄球菌肠毒素B的检测线性范围为0.2～1 653.4 ng/ml,低检测值为203 pg/ml,均优于酶联免疫吸附实验;除与2.3μg/ml金黄色葡萄球菌热休克毒素有交叉反应外,和其他几种细菌、毒素、蛋白均无交叉反应;对添加相同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B奶粉的检测的相对标准偏差在1.30%～16.93%.结论 悬浮芯片定量检测方法对于模拟添加的金黄色葡萄球菌肠毒素B具有良好的检测效果.
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2011年北京地区儿童病例A组链球菌超抗原基因特征研究
目的 分析2011年北京市儿童来源A组链球菌(GAS)临床分离株13种超抗原基因的携带情况及其与病例特征和emm分型间的关系.方法 2011年5-7月在北京市36家医院收集儿童来源GAS临床分离株635株.采用实时荧光PCR方法检测菌株超抗原基因speA、speB、speC、speF、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、smeZ、ssa的携带情况,PCR法扩增M蛋白N末端基因片段,并对产物测序确定GAS的emm型别.结果 13种超抗原基因的携带率分别为speA (22.4％)、speB (100.0％)、speC (99.4％)、speF (99.7％)、speG (99.7％)、speH (76.4％)、speI(76.2％) 、speJ(21.7％)、speK(0.6％) 、speL(1.1％) 、speM(2.2％) 、smeZ(99.7％)、ssa(98.0％),共观察到26种超抗原谱.超抗原speA、speH、speI、speJ在emm1和emm12型GAS间分布的差异有统计学意义(P＜0.05).致咽部感染菌株超抗原speK和speL的检出率高于致猩红热菌株(P＜0.05)；而对ssa的携带率低于致猩红热菌株(P＜0.05).结论 2011年北京市儿童来源GAS对超抗原基因speB 、speF、smeZ 、speG 、speC和ssa的携带率较高,speM、speL和speK的携带率较低.GAS的emm分型与超抗原基因间存在密切联系.未观察到超抗原基因speA和speC在致猩红热和致咽部感染菌株间的分布差异.
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北京市2015-2017年猩红热及咽部感染患者A组链球菌超抗原基因特征研究
目的 分析2015-2017年北京市猩红热及咽部感染患者A组链球菌(GAS)超抗原基因特征.方法 采集猩红热及咽部感染患者咽拭子标本进行GAS分离鉴定,采用实时荧光PCR法检测超抗原基因(speA、speC、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、speM、smeZ和ssa),PCR法扩增后测序确定GAS的emm基因型别.结果 2015年5月至2017年7月采集的6 801份咽拭子标本中共分离到377株GAS菌株(阳性率5.5％).超抗原基因speC、speG、speH和speK的检出率3年间出现较明显变化.共检测到45种超抗原基因谱,占比较高的2种超抗原基因谱在emm1和emm12型间分布差异均有统计学意义(x2=38.196,P＜0.001;x2=72.310,P＜0.001).超抗原speA、speH、speI和speJ在emm1和emm12型GAS间分布差异均有统计学意义(x2=146.154,P＜0.001;x2=52.31,P＜0.001;x2=58.43,P＜0.001;x2=144.70,P＜0.001).结论 2015-2017年北京市猩红热及咽部感染患者GAS超抗原基因speC、speG、speH和speK的检出率有较明显变化,speA、speH、speI和speJ在emm1和emm12基因型之间的分布存在差异,GAS菌株所携带的超抗原基因谱更宽,但主要流行谱未发生改变.
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2014年北京市儿童A组链球菌感染分离株超抗原基因谱分析
目的 分析2014年北京地区儿童A组链球菌(group A Streptococcus,GAS)超抗原基因谱,探讨其与GAS的emm型别和感染相关疾病的关系.方法 于2014年5-7月在北京市16个区(县)36家哨点医院被临床诊断为猩红热和咽扁桃体炎的儿童患者咽拭子样本中分离到259株GAS.采用Real-time PCR方法检测GAS超抗原基因(speA、speB、speC、speF、speG、speH、speI、speJ、speK、speL、spe、smeZ、ssa);PCR法扩增GAS菌株M蛋白N末端基因片段,产物经测序比对后确定GAS的emm型别.比较不同组间超抗原基因、emm型别分布的差异.结果 259株GAS中,13种超抗原基因的检出率分别为:speA 48.6％ (126株)、speB 99.2％ (257株)、speC 99.2％ (257株)、speF 98.8％ (256株)、speG98.5％ (255株)、speH 43.6％ (113株)、speI 46.3％ (120株)、speJ 49.0％ (127株)、smeZ 99.2％ (257株)、ssa98.5％ (255株),speK、speL、speM均未检出,共观察到11种超抗原基因谱(A～K).超抗原基因speA、speJ在emm1型GAS中检出率分别为94.2％ (113/120)、95.0％(114/120),高于在emm12型GAS中的检出率(均为5.6％,7/124),差异有统计学意义(x2值分别为191.20、194.80,P值均＜0.001);超抗原speH、speI在emm12型GAS中检出率分别为83.9％(104/124)、88.7％(110/124),高于emm1型GAS的检出率[3.3％(4/120)、4.2％(5/120)],差异有统计学意义(x2值分别为160.30、174.90,P值均＜0.001).致猩红热和致咽扁桃体炎病例GAS分离株的超抗原基因、emm型别分布差异均无统计学意义(P＞0.05).结论 2014年北京市儿童来源GAS的超抗原基因speB、speC、speF、speG、smeZ和ssa的检出率较高,未检测到超抗原基因speK、speL、speM;超抗原基因分布与GAS的emm型别密切相关;未发现超抗原基因及emm型别在致咽扁桃体炎和致猩红热菌株间的分布差异.
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中国儿童A族链球菌感染菌株emm分型及超抗原基因谱分布
目的 研究A族β溶血性链球菌感染菌(GAS)株emm分型及其超抗原在我国儿童中的分布情况.方法 用聚合酶链反应(PCR)联合测序对2005年～2006年中国5家儿童医院的222株A族β溶血性链球菌感染的临床菌株进行emm分型;PCR检测speA,speC,speH,speI,speG,speJ,ssa和SMEZ超抗原基因的分布情况.结果 共检测到9个emm型,emm12为主占55.86%(124/222),其次emm1占39.64%(88/222);78.39%的A族溶血性链球菌(GAS)分离株携带有6个或以上的超抗原基因,emm型和超抗原基因谱之间存在密切联系.结论 中国儿童GAS感染流行菌株具有emm型分布集中和超抗原基因携带率高的特点,不同的emm分型有不同的超抗原基因谱,这将为我国GAS疫苗的研制提供重要的分子流行病学依据.
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转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定
目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染至肝癌细胞.方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因,将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒,再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞,用RT-PCR和ELISA法鉴定.结果从产SEA标准菌株ATCC13565中提取并扩增出SEA基因全长片段;SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN,经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致;将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402,经筛选获得稳定表达的抗性单克隆.RT-PCR扩增出约800bp的基因片段,经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平.结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体,将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL-7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白.
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超抗原SEA抗肿瘤研究进展
超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子, 只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆.作为一种强大的T细胞激活剂,超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一.本文对其特性及目前的研究进展作一综述.
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假结核耶尔森菌超抗原的研究进展
近年来科学家发现了一组称之为超抗原(Superantigen)的微生物蛋白质.这些蛋白质之所以引起人们广泛的兴趣,是因为它们在非常规情况下,与免疫系统相互作用并引发诸如食物中毒、中毒性休克和自身免疫性疾病等.了解超抗原的免疫学和生物学作用,有助于阐明一些与微生物感染有关疾病的发病机制;并为发展新的有效的治疗对策提供可能性.某些细菌,已证明或可能产生超抗原,其中典型的超抗原是由金黄色葡萄球菌和化脓链球菌产生的外毒素,还有关节炎支原体的丝裂原(Mycoplasma arthritidis mitogen, MAM).近年来相继发现能产生超抗原的细菌还有假结核耶尔森菌,并且将该菌所产生的超抗原命名为假结核耶尔森菌衍生的丝裂原(YPM),对人类可引起特征性免疫并发症,如反应性关节炎、结节性红斑、川崎病等.
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重组金黄色葡萄球菌肠毒素A协同增强破伤风类毒素的免疫原性研究
目的 重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A (SEA)与Al(OH)3佐剂联合应用协同增强破伤风类毒素(TT)的免疫原性观察.方法 将高、低两个剂量的TT分别与高、中、低3个剂量的重组SEA同时吸附一定浓度的Al(OH)3作为样品组,同时设置高、低剂量TT分别与同样浓度Al(OH)3的吸附组作为对照；各组分别腹部皮下免疫NIH小鼠8只,0.5 ml/只；免疫4周后,摘眼球采血,分离血清,检测各组抗TT抗体的IgG水平.结果 在TT高剂量组,高、中剂量的SEA均能增强抗TT抗体的IgG水平(P＜0.05),而低剂量SEA组与对照组相比未能增强TT的免疫原性；在TT低剂量组,3个剂量的SEA均能显著增强TT的免疫原性,P＜0.05.结论 TT联合重组SEA及Al(OH)3佐剂能诱导免疫后小鼠产生更强的体液免疫应答,SEA及Al(OH)3佐剂对TT具有协同免疫增强效应.
关键词： 超抗原 破伤风类毒素 佐剂 免疫 金黄色葡萄球菌肠毒素A -
超抗原SEA对Tc1和Tc2细胞分化和增殖的影响
目的探讨超抗原SEA对Tc1和Tc2亚群细胞增殖的不同影响.方法以SEA刺激PBMC,以免疫荧光染色结合流式细胞术比较刺激与未刺激的PBMC中T细胞各亚群比例的变化;从PBMC中分离CD8+T细胞,定向诱导为Tc1和Tc2细胞系,3H-TdR掺入法检测Tc1和Tc2细胞对SEA刺激的反应,用免疫荧光染色和流式细胞术检测CD25的表达.结果经SEA刺激后,PBMC中的Tc0/TH0增殖并向Ⅰ型或Ⅱ型分化,但SEA所诱导PBMC中的Tc2/TH2的比例远高于Tc1/TH1;SEA在体外能更有效地促进Tc2亚群细胞的增殖;经SEA刺激的Tc2细胞系CD25的表达也高于Tc1.结论 SEA优先诱导PBMC中的Tc2/TH2的分化,在体外更有效地促进Tc2细胞增殖.
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超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素基因B的原核表达
目的构建重组pET-30a-SEB原核表达载体,转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3),诱导表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB).方法利用PCR技术从产SEB的金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC-26075基因组DNA中克隆SEB全长序列,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行测序.构建pET-30a-SEB原核表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,经镍离子螯合亲和层析纯化后免疫鉴定.结果PCR获得超抗原SEB基因片段,与克隆载体连接后经测序与文献报道的基本一致;成功构建了pET-30a-SEB原核表达质粒且成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约31×103的蛋白.结论成功克隆了seb基因序列,并进行了原核表达和签定,获得了SEB蛋白,为后续对超抗原SEB的进一步研究奠定了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 超抗原 基因克隆 原核表达 PCR免疫印迹 -
金黄葡萄球菌肠毒素A诱导的免疫应答
目的 研究超抗原金黄葡萄球菌A型肠毒素(SEA)在体内诱导的体液免疫反应、T淋巴细胞增殖及免疫无应答的规律和作用.方法 利用重组SEA蛋白免疫小鼠,酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测特异性抗体及其亚类水平,观察两者的产生过程及变化规律.RT-PCR反应检测免疫后小鼠脾脏内细胞因子的mRNA表达水平,EUSPOT法检测rSEA对脾细胞分泌IFN-γ能力的影响,流式细胞术检测T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达.结果 BALB/c小鼠在低剂量的rSEA初次免疫后2周,即产生了高水平的特异性抗体,此时体内以体液免疫应答为主,IgG2a/IgG1＜1;而在免疫早期,Th1型细胞因子的mRNA表达水平高于Th2型,以细胞免疫应答为主.短时期内进行再次免疫后脾细胞的IFN-γ分泌频率显著下降;流式细胞仪在rSEA激活的T淋巴细胞表面检测到了PD-1(programmed death-1)分子的表达,其表达量随时间及免疫次数增加.结论 超抗原SEA初次免疫即能引起强大的体液免疫应答与细胞免疫应答;再次免疫引起了免疫无应答,这与PD-1介导的抑制作用增强有关.
关键词： 金黄葡萄球菌A型肠毒素 超抗原 淋巴细胞增殖 免疫无应答 抑制性受体PD-1 -
葡萄球菌肠毒素B突变体基因表达和功能的初步研究
目的应用PCR致变及基因克隆技术,获得抗原性保留，但超抗原毒性明显下降的葡萄球菌肠毒素B(SEB)突变体,用作新型淋巴细胞激活分子和超抗原疫苗的研究。方法用PCR和PCR致变技术,从SEB标准株扩增SEB(SEB-N)和SEB突变基因(SEB-M),分别与原核表达质粒pTrc99A重组,转化大肠杆菌JM109,经筛选获得重组质粒pTrcNb和pTrcMb,用双脱氧链终止法作序列分析。表达的SEB-N和SEB-M蛋白,经双向免疫扩散试验作抗原性鉴定后,刺激小鼠脾细胞并由ELISA法检测培养上清中IL-2的水平。结果 SEB-N 150位苏氨酸(密码子ACT)非定向突变为丙氨酸(密码子GCT),SEB-M 23位天冬酰胺(密码子AAT)定向突变为丝氨酸(密码子AGT)。两种突变基因表达的蛋白均与抗SEB形成明显沉淀线,与天然SEB刺激小鼠脾细胞产生IL-2水平相比,SEB-N和SEB-M突变体蛋白分别下降12.5倍和40倍。结论获得了能表达SEB-N和SEB-M突变体蛋白的2株工程菌。表达的突变体蛋白具有良好的免疫反应性,但刺激小鼠脾细胞产生白细胞介素2的超抗原生物学活性明显下降。
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川崎病TH1/TH2功能状态的研究
川崎病(Kawasaki disease,KD)是一种急性弥漫性血管炎,婴幼儿发病多见,至今,该病病因及发病机理不明,从病人的流行病学特征推测可能与病原体感染或毒素超抗原引起免疫学异常有关.本研究通过对KD患儿急性期、恢复期PPD皮试的观察以及外周血血清IgE的变化、外周血CD4 T细胞CD30表达和外周血单个核细胞(PBMC)培养上清IL-4、IFN-γ水平的测定,了解KD急性期TH1/TH2功能平衡状态及免疫发病机理.
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跨膜型超抗原SEA融合蛋白的表达及其对小鼠黑色素瘤的免疫治疗作用
目的制备跨膜型超抗原融合蛋白,研究该蛋白制备的肿瘤疫苗的抗肿瘤作用. 方法用已构建的重组跨膜型超抗原的表达载体pET-28a-TM-SEA转化E.coli BL21(DE3)pLysS 宿主菌,在IPTG诱导下产生目的蛋白;用Ni-NTA His Bind Resin纯化带有His-Tag的目的蛋白.采用免疫组化法、免疫荧光法和流式细胞术检测其对细胞膜的锚定作用.建立C57BL/6小鼠的黑色素瘤模型,观察跨膜型超抗原SEA融合蛋白制备的肿瘤疫苗对荷瘤小鼠的免疫治疗作用. 结果跨膜型超抗原融合蛋白能够锚定在肿瘤细胞膜上.融合蛋白制备的肿瘤疫苗能够显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长,并延长其生存期. 结论跨膜型超抗原融合蛋白制备的肿瘤疫苗具有较强的抗肿瘤作用,有可能作为一种有效的新型疫苗用于肿瘤的治疗和预防.
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小肝癌无水乙醇灭活后超声引导瘤区注射超抗原的局部免疫应答
目的 研究小肝癌经皮无水乙醇治疗(PEIT)后瘤区连续注射超抗原局部的免疫应答.方法 选取34例小肝癌患者,均于无水乙醇注射治疗原位灭活后第3、第4和第7周瘤区经皮局部注射超抗原生物制剂高聚生(PHIT),每次注射1 600 U.比较注射高聚生(HAS)前后治疗区CD3、CD4、CD8、CD57和CD68浸润变化情况.结果 CD3、CD4、CD57和CD68局部浸润较注射高聚生前有明显增高(P＜0.01),且持续至注射后第5周仍高于治疗前(P＜0.05).结论 超声引导局部注射高聚生能够有效地增强肝癌患者局部抗肿瘤细胞免疫,可能具有一定的抗肿瘤复发和降低肝癌复发率的作用.
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SEA和喉癌MAGE-A3基因重组真核共表达载体的构建和鉴定
目的 构建超抗原SEA和喉癌来源的MAGE-A3基因共表达的真核表达载体,检测、鉴定其在293T细胞中的表达.方法 分别用RT-PCR方法及人工化学合成法获得MAGE-A3和SEA基因片段,然后依次将MAGE-A3和SEA基因克隆至含内部核糖体进入位点的真核表达载体IRES序列的上、下游,构建成重组质粒pMAGEA3-IRES-SEA.经脂质体转染至293T细胞以后,用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹分别鉴定SEA、MAGE-A3基因的表达.结果 限制性内切酶酶切分析证实MAGE-A3基因和SEA基因均正确地克隆在pMAGEA3-IRES-SEA中,基因测序结果与GenBank公布的MAGE-A3、SEA序列完全一致,实现了双基因的正确重组.重组质粒转染293T细胞后能检测到MAGE-A3、SEA基因的高水平表达.结论 成功地构建了pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒,并能在293T细胞中有效表达MAGE-A3和SEA蛋白,由此奠定了其作为抗喉癌DNA疫苗应用的基础.
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溶瘤腺病毒介导的超抗原SEA基因的构建和潜在的靶向抗膀胱肿瘤机制
目的 通过重组pSG218质粒构建携带超抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的pDC318-SEA腺病毒载体,将其扩增纯化,并探讨其潜在的靶向抗肿瘤机制.方法 通过PCR技术,从产 SEA的葡萄球菌标准菌株基因组 DNA中获得 SEA全长基因,酶切后克隆入pSG218质粒,获得重组质粒pDC318-SEA.鉴定正确后,将pDC318-SEA与病毒骨架质粒pPE3-ccdB通过脂质体共转染HEK293细胞,9～14 d出现病毒空斑.提取腺病毒的DNA,进行PCR鉴定.扩增DC318-SEA,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测定病毒滴度.结果 应用PCR验证、双酶切分析、序列测定表明,成功构建了pDC318-SEA质粒,通过同源重组成功获得携带超抗原SEA基因片段的DC318-SEA腺病毒.结论 获得可表达SEA基因的DC318-SEA溶瘤腺病毒载体,为进一步研究该病毒对膀胱肿瘤靶向治疗的作用奠定了基础,该病毒载体应该有巨大的、多靶向性、高效抗膀胱肿瘤作用.
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SEA和喉癌MAGE-A3构建的真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠体内的转录
目的：检测真核质粒pMAGEA3-IRES-SEA经过电穿孔转染在小鼠中的转录。方法将葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal endotoxin A，SEA）和喉癌来源的黑色素瘤抗原A3（melanoma-associated antigen A3， MAGE-A3），构建成基因共表达的真核质粒 pMAGEA3-IRES-SEA。将pMAGEA3-IRES-SEA用电转染的方法免疫BALB/C小鼠单侧股四头肌，每2周1次，每次注射50μg，共免疫3次。末次免疫2周后，取注射部位组织，用荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测目的基因在注射部位肌肉中的转录情况。结果在实验小鼠注射部位的骨骼肌内检测到 SEA、MAGE-A3基因转录mRNA。结论所构建的pMAGEA3-IRES-SEA真核表达质粒，可通过电转染的方式，在小鼠体内能有效地转录。这为研究该质粒通过小鼠的体内转录蛋白的表达，诱导机体细胞免疫、体液免疫来清除喉癌，奠定了理论基础。
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胸腔内注射葡萄球菌超抗原对非小细胞肺癌伴恶性胸腔积液及其生存率的影响
约50%的非小细胞肺癌(NSCLC)可能合并恶性胸腔积液,大部分患者功能状态差而且预后不良,生存时间仅2～3个月.常用的姑息性治疗包括胸腔置管引流及使用滑石粉、多西环素或博来霉素行化学性胸膜固定术,但这些治疗方法均不能延长患者的生存期.我们观察了胸腔内注射一种对T淋巴细胞具有强大刺激作用的新药--金黄色葡萄球菌超抗原(SSAg,浙江耀江药业有限公司),对14例未加选择的、功能状态差且伴有恶性胸腔积液的NSCLC患者的毒性作用和疗效,并与18例未加选择的、接受胸腔内喷洒滑石粉的患者进行比较.
