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葡萄球菌肠毒素B突变体基因表达和功能的初步研究
目的应用PCR致变及基因克隆技术,获得抗原性保留，但超抗原毒性明显下降的葡萄球菌肠毒素B(SEB)突变体,用作新型淋巴细胞激活分子和超抗原疫苗的研究。方法用PCR和PCR致变技术,从SEB标准株扩增SEB(SEB-N)和SEB突变基因(SEB-M),分别与原核表达质粒pTrc99A重组,转化大肠杆菌JM109,经筛选获得重组质粒pTrcNb和pTrcMb,用双脱氧链终止法作序列分析。表达的SEB-N和SEB-M蛋白,经双向免疫扩散试验作抗原性鉴定后,刺激小鼠脾细胞并由ELISA法检测培养上清中IL-2的水平。结果 SEB-N 150位苏氨酸(密码子ACT)非定向突变为丙氨酸(密码子GCT),SEB-M 23位天冬酰胺(密码子AAT)定向突变为丝氨酸(密码子AGT)。两种突变基因表达的蛋白均与抗SEB形成明显沉淀线,与天然SEB刺激小鼠脾细胞产生IL-2水平相比,SEB-N和SEB-M突变体蛋白分别下降12.5倍和40倍。结论获得了能表达SEB-N和SEB-M突变体蛋白的2株工程菌。表达的突变体蛋白具有良好的免疫反应性,但刺激小鼠脾细胞产生白细胞介素2的超抗原生物学活性明显下降。
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HCV核心基因插入突变体编码蛋白对人肝癌细胞系(Huh-7)细胞基因表达的影响
目的用基因表达分析法鉴定丙型肝炎病毒(HCV)核心(Core, C)区基因插入突变体编码蛋白在人肝癌细胞系(Huh-7)表达,探讨该蛋白生物学功能及其基因表达改变与致病的关系. 方法构建HCV-1b C基因插入突变体编码蛋白重组表达质粒,建立表达C基因插入突变体编码蛋白Huh-7细胞系,按Affymetrix公司实验程序制备探针、再与该公司HG-U133A和HG-U133B芯片杂交.对基因表达上调或下调≥3倍的基因,用NetAffx作进一步分析.并用半定量RT-PCR对其中3个上调基因进行鉴定. 结果 Microarray分析显示,HCV-1b C基因插入突变体编码蛋白比C蛋白引起更多的基因表达改变,主要集中在信号传导、蛋白酶活性、分子转运、免疫反应等,特别是免疫反应基因表达更加显著.C基因插入突变体编码蛋白表达可同时导致凋亡基因/抗凋亡基因表达上调或下调及致癌基因上调.半定量RT-PCR对有趣的致癌基因FHL2、抗凋亡基因PRKCZ和凋亡基因LGALS1的鉴定结果表明,FHL2、PRKCZ和LGALS1基因的表达比空载体转染对照组相同基因明显上调. 结论HCV C基因插入突变体编码蛋白在Huh-7细胞表达对其基因表达有很大影响,其中对免疫反应基因的影响更明显,这一结果对理解HCV C基因插入突变体编码蛋白在HCV致病过程中的作用及其研制抗HCV药物均有重大的参考价值.
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葡萄球菌肠毒素B突变体的免疫原性研究
目的研究葡萄球菌肠毒素B(SEB)突变体的免疫原性和作为超抗原疫苗的应用前景.方法利用小鼠动物模型,分别对SEB 23位突变体(SEB-M23)和150位突变体(SEB-M150)作毒力、免疫原性和保护力试验.结果小鼠致死性试验表明,与野生型SEB(SEB-N)相比,SEB-M23的毒力大幅度下降,而SEB-M150的毒力则未见下降.淋巴细胞增殖试验发现,SEB-M150与SEB-N相比,cpm掺入量相似,说明150位突变并不影响SEB超抗原的活性;SEB-M23与SEB-N相比,其cpm掺入量显著下降,表明23位突变可显著降低SEB超抗原活性.ELISA结果显示,以SEB-N、SEB-M23、SEB-M150三种蛋白免疫小鼠,都能诱生一定量的抗体,且产生的抗体水平非常接近,无统计学意义.主动免疫治疗和被动免疫治疗结果证明,SEB-M23蛋白免疫的小鼠能抵抗野生型SEB致死剂量的攻击,同时被动转移免疫小鼠的抗血清能保护接受致死剂量SEB-N的小鼠免于死亡.结论 SEB-M23毒力低、免疫原性强,有可能成为一种很有希望的超抗原候选疫苗,用于某些疾病的预防.
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含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽白细胞介素-24突变体蛋白的表达及其生物活性
目的 获得含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽的白细胞介素(IL)-24突变体(RGD-IL-24)蛋白,研究其生物活性.方法 用重叠聚合酶链反应(PCR)技术在IL-24 cDNA序列中引入甘氨酸密码子GGC,构建RGD-IL-24 cDNA,将其克隆人质粒pET28a(+)获得pET28a/RGD-IL-24.pET28a/RGD-IL-24转化菌株BL21(DE3),采用亲合层析纯化蛋白,透析复性.SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定RGD-IL-24蛋白.酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测RGD-IL-24刺激外周血单核细胞(PBMC)产生IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和干扰素(IFN)-γ的能力来测定RGD-IL-24免疫活性.细胞黏附实验检测RGD-IL-24与多种肿瘤细胞结合特性.结果 成功获得RGD-IL-24基因,并构建表达质粒pET28a/RGD-IL-24.表达的RGD-IL-24蛋白约占菌体总蛋白的30%,纯化后蛋白纯度超过90%.RGD-IL-24处理的人PBMC培养上清IL-6、TNF-α和IFN-γ浓度(ng/L)分别为(780.5 ±98.3、2399.1 ±113.2、2130.1 ±98.6),显著高于IL-24处理组(551.0±52.1、1982.5 ±138.2、1762.9 ±119.8).黏附实验证实RGD-IL-24能增强与肿瘤A549、HeLa和ACHN细胞靶向结合作用.结论 含RGD肽的RGD-IL-24蛋白免疫生物活性及与肿瘤细胞靶向结合能力较IL-24明显增强.
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含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽白细胞介素-24突变体蛋白对肝癌细胞抑制作用
目的 观察含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽模体的白细胞介素(IL)-24突变体蛋白(RGD-IL-24)对肝癌细胞的抑制作用.方法 肝癌HepG2细胞分别加入各10μl的RGD-IL-24(8 mg/L)、IL-24(8 mg/L)和磷酸盐缓冲液(PBS),噻唑蓝(MTT)比色法检测HepG2细胞生长抑制作用;DAPI染色检测HepG2细胞凋亡;免疫印迹法检测HepG2细胞bax、bcl-2及Caspase-3蛋白表达;黏附实验检测与HepG2细胞的靶向黏附.结果 RGD-IL-24、IL-24治疗4 d后HepG2细胞存活率分别为(0.219±0.015)、(0.397±0.009),与对照组(0.823±0.013)比较差异有统计学意义(P<0.01).RGD-IL-24、IL-24治疗组细胞凋亡率分别为(0.631±0.027)、(0.472±0.031),与对照组(0.082±0.013)比较差异有统计学意义(P<0.01).RGD-IL-24抑制HepG2细胞生长、诱导凋亡效果均比IL-24显著增强(P<0.05).与IL-24治疗组比较,RGD-IL-24治疗组HepG2细胞促凋亡蛋白bax增加、抗凋亡蛋白bcl-2减少、活化Caspase-3蛋白量增加.黏附实验证实RGD-IL-24与HepG2细胞的靶向结合作用增强.结论 含RGD肽模体的IL-24蛋白能通过与肝癌HepG2细胞的靶向结合增强其凋亡诱导作用.
