首页 > 文献资料
-
葡萄球菌肠毒素A真核表达质粒的构建及其在喉癌Hep-2细胞来源exosomes中的表达
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)与糖基化磷脂酰肌醇(GPI)的真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI并转染人喉癌细胞株Hep-2细胞,检测Hep-2细胞分泌的exosomes中SEA的表达.方法 利用NOT I酶切原核生物质粒pGSI-SEA-GPI粘性末端,琼脂糖凝胶电泳分离、提纯目的基因SEA-GPI,利用T4连接酶连接真核表达质粒pmiR-RB-REPORT与SEA-GPI构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.脂质体法转染pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI至Hep-2细胞,荧光定量实时PCR(qRT-PCR)检测Hep-2细胞SEA-GPI mRNA的表达.提取Hep-2细胞分泌的exosomes,免疫印迹测定SEA在exosomes中的表达.结果 琼脂糖凝胶电泳显示成功构建真核表达质粒pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI.qRT-PCR检测显示,pmiR-RB-REPORT-SEA-GPI转染的Hep-2细胞SEA-GPI mRNA显著表达.免疫印迹显示Hep-2细胞分泌的exosomes中存在SEA蛋白表达.结论 SEA可能通过GPI结构锚定于exosomes膜上,为制备含有SEA-GPI锚定蛋白的SEA-eoxsomes瘤苗提供了依据.
-
转染超抗原SEA肝癌细胞的构建及鉴定
目的用基因重组的方法将葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因转染至肝癌细胞.方法先从产SEA标准菌株中提取并扩增SEA全长基因,将SEA基因克隆及亚克隆至真核表达载体pLXSN构建pLXSN-SEA重组质粒,再将重组质粒转染至人肝癌细胞系BEL-7402细胞,用RT-PCR和ELISA法鉴定.结果从产SEA标准菌株ATCC13565中提取并扩增出SEA基因全长片段;SEA基因克隆和亚克隆至真核表达载体pLXSN,经测序证实所得序列与GenBank中的标准序列完全一致;将pLXSN-SEA质粒转染肝癌细胞BEL-7402,经筛选获得稳定表达的抗性单克隆.RT-PCR扩增出约800bp的基因片段,经ELISA分析细胞培养上清中SEA蛋白的含量在皮克的水平.结论成功构建了重组超抗原SEA基因的克隆载体及真核表达载体,将SEA基因转染至肝癌细胞株BEL-7402细胞后癌细胞能够表达并持续分泌SEA蛋白.
-
超抗原SEA抗肿瘤研究进展
超抗原是指一些细菌或病毒编码的蛋白分子, 只需极低浓度即可激活大量的淋巴细胞克隆.作为一种强大的T细胞激活剂,超抗原成为肿瘤免疫治疗研究的热点之一.本文对其特性及目前的研究进展作一综述.
-
催乳素对葡萄球菌肠毒素A诱导的人外周血T细胞凋亡的影响
目的 探讨催乳素(PRL)在T细胞的活化诱导凋亡(activation induced cell death,AICD)中的作用.方法 用葡萄球菌肠毒素(sEA)体外刺激人外周血T细胞作为T细胞AICD的模型,在第2次向模型中加入SEA诱导T细胞凋亡的同时,分别加入3种不同浓度的hPRL(20、300和1000 ng/ml)进行干预,同时设不含hPRL的对照组.0～24 h内,以MTT法检测T细胞的增殖情况.PI染色后用流式技术检测细胞凋亡情况,并通过琼脂糖凝胶电泳检测T细胞凋亡DNA.流式检测T细胞的Fas和FasL的表达水平变化.Western blot法检测T细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax.结果 在T细胞的AICD模型中高浓度PRL组(300、1000 ng/ml)其T细胞增殖得到显著维持(P＜0.05),各PRL处理组T细胞凋亡率比对照组降低了32.9%～78.2%(P＜0.05).PRL组(300、1000 ng/ml)Bax/Bcl-2比值比对照组下降了44.4%～46.0%(P＜0.05).PRL可明显抑制细胞表面Fas和FasL的表达,其中各PRL处理组Fas的细胞阳性率比对照组下降了51.1%～75.0%(P＜0.01),FasL的细胞阳性率比对照组下降了28.2%～39.1%(P＜0.01).结论 在SEA诱导T细胞的AICD过程中,PRL可通过抑制Fas、FasL和Bax的表达,并提高Bcl-2的表达,来抑制T细胞凋亡,维持T细胞的增殖.
-
sea基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性的研究
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因及其突变体原核表达系统,了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化.方法 采用高保真PCR和T-A克隆法,从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的sea基因.采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体.建立sea基因及其定位突变体原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白.采用TCID50法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性.采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用.结果 所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100%,7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变.rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52%.rSEA对Vero细胞TCID50为4.1μg,其突变体重组蛋白分别为5.8～23.5μg.1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用(P＜0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似(P＞0.05).5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统,其表达产物的细胞毒性均有所降低.由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体.
-
溶瘤腺病毒介导的超抗原SEA基因的构建和潜在的靶向抗膀胱肿瘤机制
目的 通过重组pSG218质粒构建携带超抗原葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的pDC318-SEA腺病毒载体,将其扩增纯化,并探讨其潜在的靶向抗肿瘤机制.方法 通过PCR技术,从产 SEA的葡萄球菌标准菌株基因组 DNA中获得 SEA全长基因,酶切后克隆入pSG218质粒,获得重组质粒pDC318-SEA.鉴定正确后,将pDC318-SEA与病毒骨架质粒pPE3-ccdB通过脂质体共转染HEK293细胞,9～14 d出现病毒空斑.提取腺病毒的DNA,进行PCR鉴定.扩增DC318-SEA,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测定病毒滴度.结果 应用PCR验证、双酶切分析、序列测定表明,成功构建了pDC318-SEA质粒,通过同源重组成功获得携带超抗原SEA基因片段的DC318-SEA腺病毒.结论 获得可表达SEA基因的DC318-SEA溶瘤腺病毒载体,为进一步研究该病毒对膀胱肿瘤靶向治疗的作用奠定了基础,该病毒载体应该有巨大的、多靶向性、高效抗膀胱肿瘤作用.
-
葡萄球菌肠毒素A脂质体对小鼠原位移植H22肝癌的治疗作用
目的观察葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)脂质体对小鼠原位移植H22肝癌的治疗作用.方法逆相蒸发法制备SEA脂质体,肝脏原位注射法建立小鼠H22原位肝癌模型,静脉注射SEA脂质体,观察瘤重及抑瘤率.并用ELISA法检测肝组织和血浆中细胞因子TNF-α、IFN-γ的水平;免疫组化染色法观察肿瘤组织TIL的浸润情况.结果与游离SEA相比,SEA脂质体能显著增加肝癌组织TIL浸润和肝脏组织中TNF-α、IFN-γ水平,并对小鼠原位H22肝癌具有明显抑制作用,而游离SEA无此作用.SEA脂质体组血浆中细胞因子水平较游离SEA组显著降低.结论 SEA脂质体可以显著增加SEA治疗小鼠原位H22肝癌的疗效,并有可能降低由细胞因子介导的毒性作用.可能的机制是SEA脂质体具有肝靶向性,能激活肝癌原位TIL,激活的TIL及其分泌的大量细胞因子参与了抗肿瘤.
-
催乳素对葡萄球菌肠毒素A诱导T细胞凋亡的影响
目的:观察作为重要细胞因子的催乳素在T细胞活化诱导凋亡过程中的作用.方法:实验于2005-03/2006-06在校级实验室新乡医学院免疫学实验室完成.实验材料:正常人外周血由新乡医学院第一附属医院提供,葡萄球菌肠毒素A(sigma).实验方法:①T细胞活化诱导凋亡模型的建立:取健康人外周血5 mL,加入等体积淋巴细胞分离液,采用密度梯度离心法获得淋巴细胞.完全1640培养基重悬细胞,加入葡萄球菌肠毒素A(SEA),置于37℃、体积分数为0.05的CO2培养,至第4天,800 r/min离心10 min,以新鲜完全1640培养基换液,尽可能除去SEA.培养液中加入人白细胞介素2继续培养2周待用.②催乳素干预:将获得细胞离心并弃去培养液,用新鲜完全1640培养基重悬,调整细胞密度为5x109 L-1,加入24孔板中,分别加入4 mg/L SEA诱导细胞凋亡,同时加入20,300,1 000 μg/L催乳素,以不加催乳素的为对照组.③实验评估:于培养0,16,24 h时采用MTT法检测T细胞增殖情况.培养16 h时用流式技术检测细胞凋亡情况,并通过琼脂糖凝胶电泳检测T细胞凋亡DNA,并采用流式细胞术检测T细胞膜表面Fas和FasL,Western Blot法检测T细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax.结果:①MTT法检测T细胞增殖:不同质量浓度催乳素干预组在16,24 h的T细胞数量较对照组明显增多[吸光度值:对照组:0.65±0.02,0.54±0.04;20 μg/L催乳素组:0.81±0.04,0.71±0.11;300 μg/L催乳素组:1.14±0.10,1.22±0.10;1 000μg/L催乳素组:1.12±0,12,1.22±0.12,P＜0.01].0～24 h内300,1 000μg/L催乳素组T细胞数量呈上升趋势(P＜0.01),20μg/L催乳素组T细胞数量呈下降趋势(P＜0.01).②流式细胞术检测T细胞凋亡率:培养16h时,与对照组比较,各质量浓度催乳素干预组T细胞凋亡率降低[(46.80±9.21)%,(31.40±7.03)%,(17.50±4.29)%,(10.20±3.84)%,P＜0.05].③流式细胞术检测T细胞膜表面Fas、FasL:与对照组比较,各质量浓度催乳素干预组Fas和FasL细胞阳性率均下降[Fas:(88.0±17.3)%,(43.0±13.1)%,(22.0±6.7)%,(25.0±8.2)%,P＜0.01;FasL:(46.0±17.5)%,(33.0±11.4)%,(31.0±14.0)%,(28.0±13.8)%,P＜0.05].④Western Blot检测T细胞Bcl-2、Bax:与对照组比较,20μg/L催乳素组Bax和Bcl-2表达均无明显差异(P＞0.05),300 μg/L,1 000μg/L催乳素组Bax表达明显降低(P＜0.05),Bcl-2表达明显升高(P＜0.05).结论:在葡萄球菌肠毒素A诱导的T细胞活化诱导凋亡过程中,催乳素以细胞因子的身份,可通过抑制Fas、FasL和Bax表达,提高Bcl-2表达,来抑制T细胞凋亡,维持T细胞增殖.
-
点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定
目的:进行点突变的SEA(D227A)基因原核表达载体的构建,并进行表达、分离纯化与鉴定.方法:采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因,通过下游引物上的点突变,使得到的SEA基因752位碱基突变由A突变为C,致使SEA成熟蛋白的第227位氨基酸残基由D(GAT)突变为A(GCT),构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中进行原核表达,再通过Westem blot进行鉴定.结果:构建的SEA(S227A)基因经测序证实与设计的序列一致.成功地构建pRSET-SEA(D227A)重组表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,通过IPTG诱导得到分子量约为32kD的蛋白,Western blot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合,后采用Ni2+-NTA柱进行分离纯化.结论:成功地构建SEA(D227A)基因原核表达载体,并在大肠杆菌中得到高效表达,为寻找有效低毒副作用的超抗原提供了线索.
-
SEA联合热疗对Hela细胞周期进程及凋亡的影响
目的：探讨葡萄球菌肠毒素A（ SEA）对人宫颈癌细胞株（ Hela）细胞生长、增殖、凋亡等生物学行为的影响。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同条件下对Hela细胞的增殖抑制率，流式细胞仪检测Hela细胞周期进程的变化及凋亡率，透射电子显微镜检测 Hela细胞超微结构改变。结果单纯热疗组、单纯SEA组及SEA联合热疗组对Hela细胞增殖抑制率分别为18.4％、26.4％及46.8％，与对照组相比差异显著（ P＜0.05）。流式细胞仪结果显示G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，G2/M1期细胞相对增多，且细胞凋亡率升高，组间比较差异显著。结论 SEA 联合热疗能显著提高Hela细胞的增殖抑制率，抑制G1期细胞向S期细胞的转化进程，诱导Hela细胞凋亡及亚细胞结构改变。
-
Survivin启动子调控sea基因真核表达质粒的构建及其在肺癌细胞中的特异性表达
目的 构建Survivin启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达质粒,并检测其在人肺腺癌A549细胞中的特异性表达.方法 以金黄葡萄球菌(ATCC25923)基因组为模板,PCR扩增sea基因.用sea基因替代以Survivin启动子为调控序列的pGL-S-RED质粒中的Red基因,构建真核表达质粒pGL-S-SEA.酶切及测序鉴定后,用脂质体转染A549细胞和MRC-5人胚肺成纤维细胞.RT-PCR检测两种细胞sea基因的转录情况.结果 Survivin启动子调控的、以超抗原SEA编码序列CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-S-SEA构建正确,并在A549细胞中启动了sea基因的转录,其强度为内参基因(GAPDH)的65.96%,而在MRC-5细胞对照中未检测到sea基因的转录.结论 已成功构建Survivin启动子调控的sea基因真核表达质粒,survivin启动子可在转录水平特异性地调控sea基因在A549细胞内表达,为下一步以其作为基因疫苗治疗肺癌奠定了基础.
关键词： Survivin启动子 超抗原 葡萄球菌肠毒素A 肺癌 基因疗法 -
超抗原SEA研究进展
超抗原是一类只需极低浓度（1～10 ng/ml） 即可激活大量的淋巴细胞克隆，产生极强的应答效应的抗原性物质。葡萄球菌肠毒素A（staphylococcal enterotoxin A，SEA）是金黄色葡萄球菌产生的葡萄球菌肠毒素家族中一员，是有效的T细胞活化因子之一。研究发现，SEA可通过刺激T细胞增殖,促进IL-2,TNF-α,IFN-γ等淋巴因子的产生,从而发挥抗肿瘤免疫治疗作用。
-
葡萄球菌肠毒素A脂质体诱导人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞分泌细胞因子的实验研究
目的:研究脂质体包裹的葡萄球菌肠毒素A(SEA)是否仍然具有游离SEA刺激淋巴细胞分泌细胞因子的能力. 方法:从5例原发性肝癌患者癌组织中分离培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),分别以葡萄球菌肠毒素A脂质体(L-SEA)、游离葡萄球菌肠毒素A(SEA)和白细胞介素-2(IL-2)刺激后,以ELISA法检测其产生的细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)的浓度. 结果:除第4天L-SEA刺激组IFN-γ水平低于SEA刺激组 (P< 0.05)外,此两组的细胞因子分泌无显著性差异(P>0.05),而且都高于IL-2组(P<0.05). 结论:L-SEA仍然具有SEA刺激TIL分泌细胞因子的能力.
-
葡萄球菌肠毒素A脂质体不良反应的初步研究
目的:观察葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)脂质体的不良反应. 方法:用逆相蒸发法制备SEA脂质体(L-SEA),静脉注射L-SEA,用ELISA法检测小鼠血浆中细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)的水平,并观察L-SEA对新西兰大白兔血压、呼吸及体温的影响. 结果:L-SEA组小鼠血浆中细胞因子水平较游离SEA组显著降低,对新西兰大白兔血压、呼吸及体温的影响也明显低于游离SEA组.结论:L-SEA可以显著降低SEA的不良反应,其机制可能是L-SEA能减少血浆中细胞因子的产生.
-
葡萄球菌肠毒素A基因的克隆、原核表达和鉴定
目的克隆葡萄球菌肠毒索A(SEA)基因,构建其原核表达系统,鉴定重组蛋白(rSEA)免疫原性.方法采用PCR技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中扩增全长SEA基因片段,T-A克隆后测序,构建pET32a-SEA表达质粒,转化入E.coli BL21DE3宿主菌,通过IPTG诱导表达,分离、纯化及Western印迹法鉴定.结果PCR获得SEA基因片段,DNA测序结果与已报道的SEA基因序列(GenBank No:L22566,AP004828)一致,构建了pET32a-SEA表达质粒,并成功地诱导、纯化了rSEA蛋白,rSEA表达量约为细菌总蛋白的40%.结论成功克隆了SEA全长基因,构建了rSEA原核表达系统,为进一步研制SEA的单克隆抗体及诊断试剂盒奠定了基础.
-
mTERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达研究
目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepal-6、结肠癌细胞CT26、黑色素瘤细胞B16和成纤维细胞NIH3T3中的表达情况.方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,转化Ad293细胞制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染上述四种细胞.采用免疫荧光染色法及流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况.结果:以感染复数为100病毒量感染上述细胞后,CD80和SEA的不同肿瘤细胞上表达率不同,而病毒感染的NIH3T3细胞不表达SEA和CD80.结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在不同肿瘤细胞中的靶向表达,但表达效率有所不同.为进一步采用同一腺病毒对不同肿瘤细胞的进行靶向基因治疗研究奠定了基础.
关键词： 葡萄球菌肠毒素A CD80 端粒酶反转录酶启动子 腺病毒 -
肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体的构建及体外生物学活性鉴定
[目的]构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因重组腺病毒载体.[方法]首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttle-CMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2.将AFP增强子、启动子及SEA基因分别从已构建的pKS-EP载体和pMDl8-T-SEA载体上,亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化E.coli BJ5183.以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepal-6和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3.采用间接免疫荧光法,经荧光显微镜观察和流式细胞术检测SEA在细胞膜表面的表达.采用3H掺入法检测膜表达的SEA体外诱导淋巴细胞增殖的活性.[结果]SEA能够靶向性地表达在高表达AFP的Hepal-6细胞膜上,在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达,并且体外能够诱导淋巴细胞增殖.[结论]成功地构建了肝癌靶向性SEA基因重组腺病毒载体,为进一步研究SEA在肝癌靶向基因治疗中的应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础.
-
葡萄球菌肠毒素激活肿瘤浸润淋巴细胞及外周血淋巴细胞体外抗人卵巢癌的对比研究
目的:探讨葡萄球菌肠毒素A(SEA)对卵巢癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及其外周血淋巴细胞(PBL)抗瘤活性的诱导作用.方法:取10例卵巢癌伴腹水患者实体瘤、腹水及外周血标本,分离TIL和PBL.在SEA及IL-2作用下培养,定时计数,了解其增殖情况；流式细胞仪检测其CD3、CD4、CD8表达；噻唑蓝(MTT)比色法测定其对K562及自体肿瘤细胞的细胞毒活性；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中TNF-a和IFN-γ浓度.结果:10例中8例成功分离实体瘤TIL、腹水TIL及PBL.(1)SEA刺激的实体瘤TIL、腹水TIL及PBL增殖速率明显较IL-2诱导组快(P＜0.05),但增殖高峰后出现下降趋势,IL-2组未出现此现象；(2) CD3+ CD4+及CD3+CD8+T表达率均明显上升,其中SEA诱导组比IL-2组增加比例明显(P＜0.05),以SEA作用的CD3+ CD8+T比例增加快；(3)TIL对自体肿瘤细胞的杀伤活性明显高于对K562细胞的杀伤活性(P＜0.05),PBL对自体肿瘤细胞的杀伤活性则明显低于对K562细胞的杀伤活性(P＜0.05),SEA激活组比IL-2组杀伤率高(P＜0.05)；(4)各效应细胞分泌的TNF-a、IFN-γ分别在培养的第2天和第4天达到高峰,高峰后迅速下降,SEA诱导组在前10天明显高于IL-2诱导组(P＜0.05).结论:SEA可高效、迅速诱导卵巢癌TIL的抗瘤活性.
-
葡萄球菌肠毒素A对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞抗瘤活性的作用
目的探讨葡萄球菌肠毒素A(SEA)对肝癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)抗瘤活性的诱导作用.方法取5例手术切除肝癌标本,分离TIL,在SEA作用下进行培养.定时记数,了解其增殖情况.流式细胞仪检测其CD3、CD4、CD8表达情况,噻唑蓝(MTT)比色法测定其对HepG-2肝癌细胞株的细胞毒活性,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定培养上清液中肿瘤坏死因子(TNF)-α和γ-干扰素(IFN-γ)浓度.结果在SEA刺激下,2周TIL扩增100倍.1周后CD3+细胞占95%以上,CD8+细胞较CD4+细胞增殖更迅速.TIL细胞毒活性随培养逐渐增强.在培养的前10 d内,TIL产生大量的TNF-α峰值达(453.70±9.26) ng/L和IFN-γ,其峰值达(2 013.22±20.41) ng/L.结论 SEA可高效、迅速诱导肝癌TIL的抗瘤活性.
-
表达超抗原葡萄球菌肠毒素A的喉癌细胞的建立
目的:构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因真核表达载体并建立其稳定表达的喉癌细胞系.方法:根据标准葡萄球菌菌株ATCC13565中SEA基因序列,人工合成其编码区序列,然后亚克隆至真核表达载体pIRES2 EGFP,构建pSEA-IRES-EGFP重组质粒,再将重组质粒转染至喉癌Hep-2细胞,G418筛选获得抗性单克隆,用RT-PCR和ELISA法鉴定SEA在喉癌细胞中的表达.结果:合成的SEA基因亚克隆至真核表达载体pires-EGFP后,测序证实克隆的SEA序列与GenBank中标准葡萄球菌菌株ATCC13565的编码区序列完全一致；重组质粒转染喉癌Hep-2细胞后,经筛选2周获得抗性单克隆,挑选单克隆,RT-PCR扩增获得特异的基因片段.经ELISA分析,发现细胞培养上清液中SEA蛋白的含量达Pg级水平.结论:成功构建了超抗原SEA基因的重组真核表达载体,转染至喉癌Hep-2细胞后,SEA基因能够在细胞表达并持续分泌SEA蛋白.
