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多糖类药物在体外对LAK细胞增殖功能的影响和抗肿瘤作用的实验研究
目的:探讨多糖类药物在体外对LAK细胞增殖功能的影响和抗肿瘤作用.方法:建立B16黑色素瘤小鼠模型,取小鼠脾细胞培养,1组加IL-2,2组加IL-2和人参多糖,3组加人参多糖,分别培养,用台盼蓝染色,观察多糖类药物对LAK细胞增殖功能的影响.同时Ⅰ组瘤体周围皮下注射1组培养细胞,Ⅱ组注射2组培养细胞,Ⅲ组注射3组培养细胞,取肿瘤交界部位皮肤组织,光镜和电镜观察肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的形态和分布特征.结果:人参多糖与IL-2联合体外培养表明,人参多糖能促进LAK细胞的增殖能力(P＜0.05).实验组肿瘤交界区可见不同程度的淋巴细胞浸润,其中以Ⅱ组为多.结论:人参多糖与IL-2联合体外培养能促进LAK细胞的增殖能力,且培养的细胞体内应用淋巴细胞浸润明显增多.
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Percoll及Ficoll分离纯化肝癌移植瘤肿瘤浸润淋巴细胞比较
目的：比较Percoll和Ficoll两种淋巴细胞分离液对肿瘤浸润淋巴细胞纯度及细胞增殖的影响。方法：用Per-coll及Ficoll两种淋巴细胞分离液分离H22肝癌小鼠皮下移植瘤内淋巴细胞，对细胞首先行锥虫蓝染色后在显微镜下计算细胞总数和存活率，后用流式细胞仪分析淋巴细胞纯度及分裂、增殖能力。结果：Percoll及Ficoll分离所得TIL总数分别为(3.28±0.78)×107和(2.02±0.76)×107；Percoll分离所得第3、5、7天的TIL增殖率分别为(22.8±2.31)%、(39.1±1.94)%、(69.85±1.68)%；Ficoll 分离所得第3、5、7天的 TIL 增殖率分别为(13.25±1.68)%、(23.7±5.31)%、(41.5±1.56)%。Percoll分离所得TIL中CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞分别为(73.2±6.8)%、(49.1±10.2)%、(22.0±1.4)%；Ficoll分离所得TIL中CD3+T、CD4+T、CD8+T淋巴细胞分别为(47.9±5.0)%、(29.1±8.4)%、(19.7±5.0)%。结论：与Ficoll相比，Percoll分离所得H22肝癌小鼠皮下移植瘤TIL的细胞得率和纯度更高、增殖力较强，将更有利于后续研究。
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康莱特对肿瘤浸润淋巴细胞的体外扩增及抗肿瘤作用的研究
目的:观察康莱特(KLT)对肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的体外扩增及抗肿瘤免疫作用,为扩大该药的临床应用范围提供依据.方法:从癌症患者恶性胸水中分离获取TIL和自体瘤细胞,观察KLT对TIL体外长期存活、扩增及抗肿瘤作用的影响.结果:①KLT可使TIL体外长期存活(＞17d).②KLT可使TIL在10d内持续扩增并在11～15d保持较高水平.TIL在完全培养液内则在1周内死亡.③扩增后的TIL在体内外的抗肿瘤活性均明显增强,作用类似重组白细胞介素2(rIL-2).结论:KLT可明显促进TIL的体外扩增及抗肿瘤作用,可作为TIL的中药促进剂来替代rIL-2.
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根据临床病理学特征鉴别无家族史MSI-H大肠癌
目的 根据修订的Bethesda指南,分析无家族史大肠癌患者的病理学特征和微卫星不稳定检测结果的关系,探讨无家族史高度微卫星不稳定(MSI-H)大肠癌的临床病理学特征.方法 纳入150例无家族史大肠癌患者,选取5个标准位点(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250)进行免疫荧光PCR,以GeneMapper软件分析PCR产物;收集患者年龄、性别及肿瘤部位信息;光学显微镜观察多种病理特征(分化程度、黏蛋白分化、组织学异质性及类Crohn反应);免疫组化方法检测肿瘤浸润淋巴细胞CD4~+和CD8~+的表达.Logistic逐步回归分析产生回归方程,依据病理特征计算MSI-H表型的概率.结果 无家族史大肠癌中MSI-H表型为13.33%;低分化、组织学异质性、类Crohn反应和TILs是MSI-H表型大肠癌的独立鉴别因子,Logistic回归方程鉴别MSI-H表型大肠癌的敏感性为70.0%,特异性为99.2%,总准确率为95.3%.结论 MSI-H表型构成了一个病理学特异的无家族史大肠癌类型,根据临床病理学特征能够有效地检出MSI-H表型大肠癌.
关键词： 微卫星不稳定 遗传性非息肉病性结直肠癌 大肠癌 临床病理学 肿瘤浸润淋巴细胞 -
皮肤肿瘤组织中类高内皮微静脉的形态学研究
目的:探讨人黑色素瘤组织中类高内皮微静脉与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的形态特征.方法:采用光镜和透射电镜观察了10例手术切除的人皮肤黑色素瘤组织中的类高内皮微静脉和TIL的分布和超微结构.结果:类高内皮微静脉主要分布于乳头层和癌周围.病变早期其内皮高大,胞浆突起增多,核大,细胞器丰富,有大量淋巴细胞穿越管壁;病变晚期,内皮细胞核不规则,出现大量齿状切迹,细胞质内出现大量微丝和质膜小泡,线粒体多出现肿胀、扩张,基膜不连续,少见淋巴细胞穿越.TIL多存在于癌周围区,活化淋巴细胞较多.随着病程的进展,淋巴细胞数量减少.结论:1.皮肤黑色素瘤组织中部分血管可演变为类高内皮微静脉,是淋巴细胞向癌组织浸润(淋巴细胞定向归巢)的重要场所.2.肿瘤组织中的淋巴细胞归巢与抗肿瘤密切相关.
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人参多糖及IL-2对小鼠黑色素瘤细胞体内的抑制效应
目的探讨依赖人参多糖及IL-2的肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)在体内抗肿瘤作用. 方法建立B16黑色素瘤小鼠模型,将30只C57小鼠随机分为4组,1组瘤体周围皮下注射IL-2,2组注射IL-2和人参多糖,3组注射人参多糖,4组仅注射生理盐水作为对照组,通过测量瘤重、瘤体积和抑瘤率观察其抗肿瘤作用.同时取瘤周部位皮肤组织,光镜和电镜观察TIL细胞的形态和分布特征. 结果人参多糖与IL-2联合体内应用抗肿瘤作用显著强于对照组(P <0.05).实验组瘤周区可见不同程度的淋巴细胞浸润,其中以2组为多,且可见TIL细胞与肿瘤细胞有膜接触. 结论人参多糖与IL-2联合体内应用抗肿瘤作用显著强于对照组,且T IL细胞前者明显增多.
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BCL-2基因表达与乳腺癌抗凋亡及免疫耐受的关系
目的观察乳腺癌细胞株BCL-2基因表达与其耐受肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)免疫攻击的关系,探索应用BCL-2硫代反义寡核苷酸(BCL-2SON)治疗乳腺癌的途径.方法BCL-2硫代反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞株MCF-7,Western印迹法观察其对BCL-2表达的抑制;并将MCF-7细胞与乳腺癌标本分离出来的TIL共同培养,通过JAM试验观察TIL诱导MCF-7细胞凋亡的情况.结果BCL-2SON处理的MCF-7细胞无BCL-2表达,并在JAM试验中随着TIL浓度增加,凋亡细胞也增加;未经处理的对照组可见BCL-2表达,JAM试验中随着TIL浓度增加,凋亡细胞的量无明显变化.结论BCL-2表达的乳腺癌细胞可对抗肿瘤浸润淋巴细胞的免疫攻击,BCL-2SON可作为治疗乳腺癌的新途径.
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体外大量扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞及其生物学特性的初步分析
目的：探讨体外大量培养扩增原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的新方法，并初步研究其分子表型和功能特征。方法20例手术切除的原发性肝癌组织经混合消化酶消化为单个细胞后，应用密度梯度离心法分离其中的淋巴细胞，然后应用两步培养法大量扩增 TILs，并检测它们的生长扩增速度。应用流式细胞仪检测扩增淋巴细胞的分子表型， ELISA法检测其 IFN-γ的分泌水平，并分析高表达 PD-1和低表达 PD-1分子 TILs分泌 IFN-γ的能力。结果18例标本中的 TILs在体外经两步法培养后可以扩增达到1010数量级。扩增的 TILs中 CD3+细胞的比例为（91.7±7.4）%，CD3+CD56+细胞的比例为（28.5±11.7）%， CD3+CD4+细胞的比例为（32.5±19.6）%，CD3+CD8+细胞的比例为（62.5±29.1）%。PD-1分子在 CD3+CD8+细胞的比例为（23.5±16.1）%。扩增的 TILs分泌 INF-γ的水平为（827.8±307.7）pg/ml，其中9例 PD-1分子低表达的 CD3+CD8+细胞的分泌 INF-γ的水平为（1087.5±249.6）pg/ml，6例 PD-1分子高表达的 CD3+CD8+细胞的分泌 INF-γ的水平为（478.6±69.3）pg/ml，两者相比有明显差异（P <0.05）。结论应用两步培养法从原发性肝癌中大量扩增 TILs简便易行，扩增的TILs主要为 CD3+CD8+T淋巴细胞，且 TILs中 PD-1的表达与其分泌 IFN-γ的能力呈负相关。
关键词： 肿瘤浸润淋巴细胞 干扰素 γ 程序性细胞死亡受体 1 原发性肝癌 -
结肠癌患者肿瘤浸润淋巴细胞CD28表达的检测及临床意义
共刺激分子CD28主要表达于T淋巴细胞上,与活化B淋巴细胞上的B7相互作用后产生的"第二信号"才能使T细胞活化,形成免疫应答.肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)是主要存在于肿瘤间质内的T细胞为主的一个异质性淋巴细胞群体,研究发现,淋巴细胞浸入到肿瘤组织内是体内免疫系统对肿瘤的抵抗现象,肿瘤部位的淋巴细胞浸润程度愈高,患者预后愈好[1].为研究肿瘤组织TIL中T淋巴细胞变化与疾病的关系,我们采用流式细胞仪对48例结肠癌患者肿瘤组织中TIL细胞CD28的表达进行了检测,以探讨其变化及临床意义.
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肿瘤浸润淋巴细胞过继免疫治疗黑色素瘤进展
肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocyte，TIL）是存在肿瘤周围的一群异质性细胞，包括 CD4＋T 细胞、CD8＋T细胞、调节性T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞等，以 CD3＋T 细胞为主。TIL 在肿瘤周围浸润的程度及 CD8＋T细胞所占的比例与肿瘤患者的预后呈明显正相关[1]。但部分TIL在肿瘤抑制性微环境中呈免疫耐受状态。基于TIL的过继性细胞治疗（adoptive cell transfer，ACT）是将浸润在肿瘤周围的淋巴细胞分离，经体外培养，活化和扩增后回输到患者体内，从而发挥杀伤肿瘤的作用。离体培养的TIL可以脱离肿瘤抑制性微环境的作用，再次活化。因TIL的ACT具有肿瘤特异性好、抗瘤谱广、杀伤活性强以及可在体外大量扩增的优点，在肿瘤过继免疫治疗的研究中受到较多关注。本文将重点探讨TIL的临床应用研究的现状，存在的问题及可能的解决途径。
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新型免疫活性细胞CIK体外对肝癌细胞的杀伤
目的 观察人体CIK(cytokine-induced killer)细胞的体外增殖力及杀伤肝癌细胞活性.方法 采取健康自愿者的成分血,用淋巴细胞分离液分离获得外周血单个核细胞(PBMC),在体外培养条件下,通过加入不同细胞因子(如IFN-γ,IL-1,IL-2,CD3 mAb)培养诱导成CIK细胞和LAK细胞,观察不同培养细胞的增殖能力;用流式细胞仪对培养细胞做细胞表型动态分析,观察培养细胞的表面标志;与LAK细胞作对比,用MTT法测定并比较不同效应细胞的体外抗肝癌细胞活性.结果 CIK细胞在培养14 d后开始大量增殖且在含人血清的培养基中增殖数量多,可达500多倍.经表型分析表明,CIK细胞属于异质细胞群,在培养过程中,CD3+CD56+双阳性细胞的绝对数量获得了大量增殖,至56 d时可占细胞总数的51.26%,是CIK主要的效应细胞;实验表明,CIK细胞体外杀伤肝癌细胞的活性明显优于LAK细胞.结论 CIK细胞是一种具有较强杀伤肝癌细胞的免疫活性细胞,有可能应用于抗肿瘤的生物治疗.
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肿瘤浸润淋巴细胞与结直肠癌预后的meta分析
目前，TNM分期是临床上制订结直肠癌治疗方案的主要依据，然而，此分期系统不能充分反映临床治疗和评估患者预后的情况。按照指南， TNM分期I期和低危II期患者术后无需接受辅助治疗就可以达到理论上的完全治愈，并长期存活（ Benson et al ，2013）。然而，约有10％的I期和20％的II期患者术后会发生复发转移。因此，临床上亟需其他预测预后的辅助指标来更精确分期，并为术后辅助治疗提供更多的依据。
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肿瘤浸润淋巴细胞与肺癌免疫靶向治疗
肺癌是全世界范围内肿瘤相关死亡的首要原因[1-2],其具有恶性程度高、早期发现率低、死亡率高的特点.约80％～ 85％新确诊肺癌病例为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)(其中包括腺癌、鳞癌及大细胞肺癌),并且多数患者在确诊时已处于不可切除或不可治愈的阶段[3].晚期肺癌的一线治疗方式取决于肿瘤组织病理学类型,小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)及鳞癌患者首选全身化疗,而腺癌患者的表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)突变、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合等基因改变是决定治疗方案的重要因素[4].
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中央型和效应型记忆T细胞亚群在肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞中的分布
目的 研究中央型记忆T细胞(TCM)和效应型记忆T细胞(TEM)在肝癌肿瘤浸润淋巴细胞中的分布特点.方法 通过流式细胞仪检测肝脏组织浸润淋巴细胞CD3、CD4、CD8、CD45RO、CD62L、CCR7表面标志的表达情况.结果 乙肝肝癌组、乙肝癌旁组及对照组CD4+ TCM亚群占CD4+ CD45RO+ Tm的比例分别为(0.25±0.17)％、(0.29±0.22)％、(0.37±0.33)％,差异无显著统计学意义(P＞0.05).CD4+ TEM亚群占CD4+ CD45RO+Tm的比例分别为(89.7±7.4)％、(98.7±0.6)％、(95.5±3.7)％,差异有统计学意义(P＜0.05).其中乙肝肝癌组明显低于乙肝癌旁组及对照组.乙肝肝癌组、乙肝癌旁组及对照组CD8+ TCM亚群占CD8+ CD45RO+ Tm的比例分别为(0.41±0.31)％、(0.55±0.60)％、(0.26±0.25)％,其中乙肝癌旁组显著高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).CD8+ TEM亚群占CD8+ CD45RO+ Tm的比例分别为(92.4±4.3)％、(98.1±0.7)％、(98.2±1.1)％,乙肝肝癌组显著低于乙肝癌旁组及对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 原发性肝癌患者肿瘤浸润CD45 RO+ Tm中,无论是CD4+还是CD8+,主要以TEM亚群为主,TCM亚群所占比例很小.CD4+ TEM亚群及CD8+ TEM亚群占CD45RO+ Tm的比例在肝癌组织中显著小于非肝癌组织,而CD4+ TCM亚群及CD8+RM亚群占CD45RO+ Tm的比例在肝癌组织及非肝癌组织中无差别.
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葡萄球菌肠毒素A脂质体对小鼠原位移植H22肝癌的治疗作用
目的观察葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)脂质体对小鼠原位移植H22肝癌的治疗作用.方法逆相蒸发法制备SEA脂质体,肝脏原位注射法建立小鼠H22原位肝癌模型,静脉注射SEA脂质体,观察瘤重及抑瘤率.并用ELISA法检测肝组织和血浆中细胞因子TNF-α、IFN-γ的水平;免疫组化染色法观察肿瘤组织TIL的浸润情况.结果与游离SEA相比,SEA脂质体能显著增加肝癌组织TIL浸润和肝脏组织中TNF-α、IFN-γ水平,并对小鼠原位H22肝癌具有明显抑制作用,而游离SEA无此作用.SEA脂质体组血浆中细胞因子水平较游离SEA组显著降低.结论 SEA脂质体可以显著增加SEA治疗小鼠原位H22肝癌的疗效,并有可能降低由细胞因子介导的毒性作用.可能的机制是SEA脂质体具有肝靶向性,能激活肝癌原位TIL,激活的TIL及其分泌的大量细胞因子参与了抗肿瘤.
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肝癌及癌旁组织中4-1BB分子的表达及意义
目的研究肝癌及癌旁组织中4-1BB分子的表达及意义.方法应用RT-PCR、直接免疫荧光细胞化学法、激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测肝癌和癌旁组织以及外周血淋巴细胞中4-1BB分子的表达情况.结果全部肝癌癌旁1 cm组织中可检测到4-1BB mRNA,8例肝癌组织和6例癌旁5cm组织中4-1BB mRNA 呈弱表达.激光共聚焦显微镜检测到13例癌旁1 cm肝组织中浸润淋巴细胞4-1BB+/CD4+或CD8+荧光.两组外周血CD4+和CD8+ T细胞表面几乎均未检测到4-1BB分子的表达.结论肿瘤浸润淋巴细胞可能通过4-1BB共刺激信号途径得以有限活化并发挥局部杀伤效应.
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半乳糖基抗CD3单抗-TIL杀伤自体肝癌细胞的杀伤活性测定
为增强肿瘤浸润淋巴细胞的趋肝性和杀伤靶细胞能力,我们将肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与半乳糖基抗CD3单抗结合,制备了半乳糖基抗CD3单抗-TIL(McAb-TIL),并从形态学上证明McAb-TIL在体外有良好的趋肝细胞性和杀伤自体肝癌细胞能力[1,2],本研究进一步从定量检测杀伤活性角度探讨McAb-TIL杀伤自体肝癌细胞的能力.
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大肠癌原发灶及其肝转移灶组织Fas、FasL的表达比较
Fas-FasL系统诱导活化肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)凋亡,逃避机体免疫系统监视,在肿瘤发生、发展和转移中起重要作用.本文应用SP免疫组化法研究大肠癌原发灶及其肝转移灶的Fas、FasL表达及其意义.
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原发性肝癌射频治疗后局部免疫功能的变化及其临床意义
目的 对原发性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)射频消融治疗(radiofrequency ablation,RFA)前后肿瘤内部及边缘热休克蛋白70(heat shock protein,HSP70)的表达、CD8+T细胞数量的变化以及RFA治疗后,肿瘤边缘HSP70表达与肿瘤边缘CD8+T细胞数量之间的关系进行观察,探讨RFA治疗对原发性肝癌局部免疫功能状态的影响及其可能的临床意义.方法 对17例HCC分别在RFA治疗前、后1个月,于肿瘤内部和肿瘤边缘超声引导下穿刺活检取样;采用PowerVisionTM二步染色法进行免疫组化分析,测定HSP70的表达、CD8+T细胞的数量;随访HCC复发/新生情况.结果 RFA治疗后肿瘤边缘组织HSP70表达增强(Z=3.337,P=0.001)、CD8+T细胞数量增多(Z=1.996,P=0.049);RFA治疗后,≤4 cm肿瘤组的占位边缘CD8+T细胞数量高于＞4 cm肿瘤组(Z=1.966,P=0.048).RFA治疗后,边缘组织HSP70表达与CD8+T细胞数量之间呈正相关关系(r=0.489,P=0.046);RFA治疗后,无复发或新生组的占位边缘组织HSP70表达和CD8+T细胞数量分别高于复发或新生组(Z=2.009,P=0.045;Z=2.007,P=0.045). 结论 RFA治疗后边缘HSP70表达增强、CD8+T细胞数量增多,显示RFA治疗后局部免疫原性提高,抗肿瘤效应细胞浸润增加.
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Fas/Fas-ligand介导的凋亡与胃癌免疫逃逸的关系
本研究通过原位观察胃癌细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的Fas/ Fas-ligand (FasL)表达和凋亡情况,并结合胃癌的临床病理特征,评价Fas/ FasL系统对胃癌生物学行为的影响.
