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体内彗星试验多种器官细胞分离条件研究
彗星试验是一种能在单细胞水平检测DNA损伤的新技术.由于它具有简便、快速、需样品量少和对环境诱变剂、致癌剂的检测谱宽、灵敏性高等优点[1,2],其应用日益广泛.该试验重要的特点之一,是适用于任何类型的真核细胞,可检测体内多种器官组织的DNA损伤作用.为研究非血液系统靶的遗传毒剂的效应、比较体内各种细胞反应的敏感性、观察各器官DNA损伤及修复动力学改变和探索致癌机制等开辟了一条崭新的途径.应用体内彗星试验研究致癌剂对小鼠多种器官组织的DNA损伤与修复作用,近年来国外已有报道.在其研究中,首先需将各器官组织分离成单个细胞,样品组织的细胞分离制备是体内彗星试验的关键步骤.以往细胞分离多采用酶消化法,Singh等[3]发现胰酶消化细胞会产生明显的DNA断片.Sasaki[4]提出,可通过组织匀浆,提取细胞核,而后进行试验.为了有助于国内体内彗星试验的开展,我们通过适匀浆条件的选择和匀浆法与酶法分离细胞的比较研究,建立适合于体内彗星试验多个器官的样品制备方法.
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大鼠生精细胞分离方法的研究
目的:建立一种简单、有效的哺乳动物睾丸生精细胞分离方法.方法:采用研磨-Percoll法、单一酶-研磨-Percoll法、组合酶法制备成熟期前大鼠睾丸生精细胞,分析比较其细胞总数、分离所需时间和细胞纯度,以及检测细胞培养前后的存活率.结果:组合酶法得到的睾丸生精细胞总数多、分离所需时间短;获得的细胞含杂质少、细胞存活率高;细胞培养48h后的存活率高,与其他两种分离方法比较有显著性差异(P＜0.05).结论:用组合酶法能在较短时间内获得数量较多的、比较纯化和存活率较高的生精细胞.
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人股骨头骨微血管内皮细胞的分离培养方法
目的:探讨培养人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法.方法:2013年10月至2014年1月15例行髋关节置换患者切除的内部无病变的股骨头,男2例,女13例;年龄38～92岁,平均71.2岁.无菌条件下将股骨头内松质骨咬成碎骨粒,放入培养基.采用酶消化法,密度梯度离心法分离细胞;差速贴壁法,选择性培养基法纯化细胞.倒置显微镜观察细胞特点,并采用vWF、CD31免疫荧光进行细胞鉴定.结果:原代培养24 h后倒置显微镜下观察细胞数量与患者年龄呈正相关,年龄越大细胞越少.培养4～5 d细胞呈短梭形、多角形或“鹩卵石”状.培养7～10d细胞生长密集,细胞融合呈漩涡状,接触抑制明显.vWF、CD31免疫荧光检测阳性率100％,表明细胞为骨微血管内皮细胞.结论:人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法简单、稳定、有效、可重复性好,可以获得纯度较高的股骨头骨微血管内皮细胞.
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骨细胞分离培养及其与成骨细胞鉴别比较的实验研究
目的:建立比较稳定的骨细胞实验室分离培养方法,并将其部分生物学特性与实验室培养的成骨细胞进行比较研究,明确两者区别.方法:采用序列酶消化法,分别从3只3dSD乳鼠骨骼中分离培养骨细胞和成骨细胞,培养24 h后进行细胞形态学观察.第1代细胞用碱性磷酸酶试剂盒采用重氮盐法(改良Kaplow氏法)染色,采用免疫细胞化学法对细胞的骨钙素(BGP)染色,测定碱性磷酸酶并计算其活性.结果:骨细胞多呈星状或树枝状,且有很多的突触；成骨细胞呈长梭形,有少量的突触.骨细胞碱性磷酸酶染色,胞浆内cAKP颗粒不明显；成骨细胞碱性磷酸酶染色,胞浆内可见众多cAKP颗粒.骨细胞BGP染色阳性明显,成骨细胞BGP染色阳性不如骨细胞明显.ALP在骨细胞中分泌较成骨细胞低,且有统计学差异.结论:实验室条件下能培养出骨细胞,该类细胞和成骨细胞有明显区别.
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猪脂肪间充质干细胞分离、鉴定、诱导及联合扩张器重建乳房模型的研究
目的 通过从脂肪组织中提取脂肪间充质干细胞,并进行培养鉴定、定向诱导,再联合皮肤扩张器在小型猪腹部皮下塑造乳房重建模型,探讨脂肪间充质干细胞用于乳房重建的可能性.方法 取小型猪颈背部皮下脂肪组织,用胶原酶消化法获得脂肪间充质干细胞,结合免疫荧光法,将所培养细胞用流式细胞技术分析细胞表面抗原,体外诱导其向脂肪细胞、成骨细胞分化,油红O染色、茜素红染色等方法检测细胞诱导分化结果.筛选脂肪间充质干细胞,将脂肪间充质干细胞联合扩张器注射于小型猪乳房模型观察.结果 流式细胞技术检测CD34、CD45阴性表达,CD44、CD105阳性表达,油红O染色可见细胞内有脂滴形成,茜素红染色发现细胞出现钙结节.动物模型发现与对照组相比较,注入干细胞组局部细胞数目增多.结论 猪脂肪间充质干细胞可在体外培养,并可定向诱导成脂肪细胞、成骨细胞,在动物体内可向局部组织分化,引起局部细胞数目增多.
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小鼠骨髓间充质干细胞外泌体的分离与鉴定
目的 探讨骨髓间充质干细胞的外泌体的分离与鉴定方法.方法 通过全骨髓贴壁法培养间充质干细胞;用新兴试剂法收集外泌体,采用电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot鉴定外泌体.结果 第三代骨髓间充质干细胞表面CD45呈阴性表达,CD73和CD105呈阳性表达;骨髓间充质干细胞外泌体呈圆形或椭圆形,大小不均匀,直径30~100 nm,有完整的膜结构;粒径检测显示颗粒直径主峰为61.25 nm,直径为20~200 nm的颗粒占72.4%;外泌体CD63和CD81呈阳性表达;细胞培养上清液中可检测到外泌体CD9和CD63的蛋白表达.结论 在培养间充质干细胞的培养基中可以收集到外泌体,可以通过透射电镜、粒径检测、流式细胞仪和Western blot 对骨髓间充质干细胞的外泌体进行鉴定.
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小鼠脊髓微血管周细胞的体外培养及鉴定
目的 应用周细胞培养基(PCM)分离筛选小鼠脊髓微血管周细胞(SCMP),对其生物学功能进行评价.方法 10只3周龄C57小鼠,无菌条件下取脊髓去除软脊膜,剪碎成大约1 mm×1 mm×1 mm.两次酶消化后用含20％牛血清白蛋白的DMEM离心获得微血管.用内皮细胞培养基(ECM)培养,传代2次后改用PCM培养.倒置显微镜观察细胞增殖状况.免疫细胞化学法检测血小板源性生长因子受体β(PDGFRβ)、神经元-胶质抗原2(NG2)、von Willebrand因子(vWF)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.流式检测CD140b、CD31、CD11b和GFAP的表达.将PCM换为10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基,检测细胞α-SMA表达的变化.通过周细胞-内皮细胞共培养成管实验检测细胞成管能力.结果 接种48 h细胞爬出,7～9d汇合,周细胞和内皮细胞伴随状增殖.改用PCM培养后内皮细胞减少,周细胞呈优势生长.免疫细胞化学表明PDGFRβ和NG2阳性,vWF和GFAP阴性;流式结果表明细胞PDGFRβ的阳性率为95.52％±2.55％,GFAP为0.63％±0.26％,CD31为0.80％±0.26％,CD11b为1.02％±0.35％.10％胎牛血清的DMEM促进细胞分化,α-SMA表达升高.成管实验周细胞与内皮细胞共同形成管腔样结构.结论 通过PCM筛选法能够成功获得纯度较高的SCMP,所获得的细胞具备明显的周细胞的形态和功能特征.
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大鼠A型精原细胞的体外培养
目的探讨大鼠A型精原细胞的分离、鉴定及体外培养的方法与技术.方法利用非连续密度梯度离心及差速贴壁法纯化A型精原细胞;用抗c-kit和抗TERT免疫组织化学法进行细胞鉴定;用含10%NBS的DMEM进行体外培养.结果Percoll分离法结合差速贴壁法终平均大鼠的每个睾丸可得到0.614×106个A型精原细胞,锥虫蓝染色显示细胞的存活率为92.1%.c-kit和TERT免疫组织化学阳性细胞平均分别为(90.8±1.0)%和(91.7±1.2)%.在含10%NBS的DMEM条件下,A型精原细胞于培养96 h增殖达高峰.结论Percoll分离与差速贴壁法结合是纯化A型精原细胞的有效方法;c-kit和TERT免疫组织化学结合证实本实验所获得的细胞是A型精原细胞;大鼠A型精原细胞可以在体外进行增殖.
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一种新型肠上皮干细胞分离方法的建立
目的 探讨密度梯度离心法作为一种新型肠上皮干细胞分离方法的可行性.方法 通过腹腔注射大剂量5-氟尿嘧啶(5-FU)制备肠黏膜严重损伤小鼠模型,取出损伤的肠黏膜消化成单细胞悬液,利用Percoll密度梯度离心法分离细胞体积大小不同的细胞群.HE染色观察各群细胞形态特征,免疫细胞化学及RT-PCR检测各群细胞musashi-1(msi-1)的表达.结果 分离的大部分细胞位于50%和70%密度梯度的Percoll分离液体层,50%密度梯度分离液体层中的细胞符合干细胞的形态特征,免疫细胞化学检测其msi-1表达阳性率约为93%,RT-PCR显示该群细胞msi-1 mRNA表达较强.结论 建立了一种简便、有效的分离具有活性的肠上皮干细胞的方法.
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激光捕获显微切割技术新进展
激光捕获显微切割是一种先进的分离特定同质细胞群进行进一步研究的技术,尤其是在需要研究的细胞占样本细胞数很少时,以及需研究的细胞呈散在分布时,激光捕获显微切割的重要性尤为明显.与免疫组织化学、原位杂交技术、高通量基因分析、蛋白分析技术结合,显微切割技术显示出良好的发展前景.本文简述激光捕获显微切割的基本原理、应用以及可能的发展趋势.
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从组织切片上分离单个细胞的相关技术及其应用前景
1 从组织切片上分离单细胞方法的建立从组织切片上进行单个细胞分离,并扩增出靶DNA片段的技术是1993年由德国科隆大学的Hansmann等[1]建立起来的一项新技术,并将其称为分子组织学技术(molecular histology).该方法的大优点在于能够针对所需研究的细胞,将组织形态和分子生物学技术密切结合,特别适用于细胞组成复杂的病变.同年,Trumper等用霍奇金病(HD)淋巴结制备细胞悬液,结合免疫组织化学,用微操纵器从细胞悬液中提取单个Reed-Sternberg(RS)细胞,并成功地进行了聚合酶链反应(PCR)[3].两种方法相比较,前者更具优势,因为从组织切片上提取单个细胞,能密切结合形态学特征,更为直观和准确,同时也能将目的细胞与周围微环境中的背景细胞作相关性研究.获得单个细胞还有其他方法,如流式细胞仪、密度梯度离心、高梯度磁性细胞筛选,但细胞体积较大时,这些方法易导致细胞碎裂,而从组织切片上提取单个细胞不存在类似问题[4].
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面向细胞分离的微流控技术
在医学和生物学的多项研究中,能够对不同种类的细胞进行有效的分离,一直是学术界所面临和一直在研究的重要问题.如果人们能够有效地分离不同类型的细胞,那么将会给许多疾病的诊断和治疗带来巨大的便利,从而为医学和生物学带来突破.目前,传统的、主要的细胞分离和筛查方法可以分为两大类,分别是标记法和非标记法.随着微流体技术的发展,微流体芯片正在越来越广泛地应用在细胞分离的领域.本文从微流体的研究历程出发,结合现有的传统细胞分离技术,以及其与微流体技术的对比,对微流体在细胞分离领域的应用和发展作综述性介绍.
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脐血单个核细胞的分离及冻存
研究脐血采集后的放置、单个核细胞的分离、冻存等的影响因素.方法为血液采集后,离心分离单个核细胞,进行冷冻保存及复苏后洗涤.结果优选为采集后4℃或室温放置24小时内,羟乙基淀粉2次离心法分离单个核细胞,50%二甲亚砜加自身血浆为保护剂冻存、复苏后洗涤等程序.结论:本研究的优化方法可有效地保存脐血单个核细胞.
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人脐带静脉灌注液间充质干细胞的分离和鉴定
本研究旨在探讨人脐带静脉灌注液中是否存在间充质干细胞及其分离和扩增方法.从正常产妇分娩后的胼带静脉灌注液分离间充质干细胞,观察细胞形态并用流式细胞仪分析其细胞表型和细胞周期,在体外分别诱导其成骨、成脂肪和成软骨细胞分化.结果表明:脐带静脉灌注液来源的间充质干细胞为成纤维细胞样,高表达CD29、HLA-ABC、CD166、CD105、CD73、CD44;不表达造血和内皮标志(CD34、CD45、CD144和CD14).它们可向骨、脂肪和软骨细胞分化,符合间充质干细胞的基本功能特征.结论:人脐带静脉灌注液存在间充质干细胞,能够在体外培养和扩增,可作为今后细胞治疗和组织工程的种子细胞.
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兔骨髓源性血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
本研究探讨兔骨髓源性血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)的分离、培养及鉴定方法.抽取兔骨髓细胞,用梯度密度离心法获得单个核细胞,以内皮细胞培养液培养,通过细胞形态观察、免疫组织化学试验、流式细胞术以及内皮祖细胞吞噬功能进行鉴定.结果表明,新分离的骨髓单个核细胞呈圆形,培养48小时后可见贴壁细胞呈集落样生长,细胞呈圆形或不规则形,核分裂相明显,至培养第7天成片生长的细胞集落相互连接呈梭形的内皮样细胞.内皮祖细胞免疫组织化学检测结果显示CD133(+),CD34(+),Ⅷ因子(++),KDR(++);流式细胞术鉴定结果显示CD133的阳性率为(18.23±7.12)%,CD34的阳性率为(47.71 ±14.85)%,CD31的阳性率为(71.61 ±13.51)%,KDR的阳性率为(87.24 ±11.40)%.细胞吞噬功能鉴定说明超过80%的贴壁细胞都特异性地摄取了Dil-acLDL和FITC-UEA-1.结论:密度梯度离心法体外分离兔骨髓源的单个核细胞,在一定的诱导培养条件下能分化成为血管内皮祖细胞.
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冻存脐带血中内皮祖细胞的分离培养及生物学特性鉴定
目的:建立和开发一种新型的从冻存脐带血中分离培养内皮祖细胞(EPC)的方法,探讨其生物学特性,提高冻存脐带血分离获得EPC的成功率.方法:自液氮罐中收集公共库中2000年至2001年保存的12例冻存脐带血,37℃水浴锅中快速复苏后,磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)洗涤,获得总有核细胞(TNCs),将TNCs接种至培养皿中诱导扩增EPC.使用流式细胞术和免疫荧光方法鉴定EPC并确定纯度.采用下列方法体外鉴定内皮祖细胞的功能:荧光显微镜观察细胞特异性摄取Dil-Ac-LDL和HTC-UEA-I的功能、在基质胶中形成毛细管样结构的情况,ELISA法检测释放VEGF因子的功能.结果:培养3周后,出现1-5个鹅卵石铺路石样内皮祖细胞集落.体外培养第1-3代EPC,其表面CD31、CD34、CD144和VEGFR(CD309)标记阳性率分别为(92.91±5.20)％、(30.0±23.27)％、(88.55±3.83)％和(67.21±12.12)％.EPC细胞具有特异性内吞Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-I、形成毛细管结构,释放低浓度VEGF因子等功能.结论:采用本方法从冻存脐带血中分离EPC的稳定性与重复性高,从冻存的脐带血中分离EPC的成功率可提高至85％.该方法为临床应用丰富的内皮祖细胞奠定了基础.
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小鼠骨骼肌源间充质干细胞的分离与培养
为观察成体小鼠肌肉组织中是否含有间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC),将分离胶原酶消化的肌肉单个核细胞,在含10%胎牛血清的α-MEM/F12培养液中培养,观察培养细胞的形态、细胞化学及增殖特性特征,用流式细胞术分析细胞表型,并观察细胞体外向成骨细胞分化能力.结果显示,从小鼠肌肉组织中分离和培养获得的细胞具有良好的增殖特性,CD34及CD45阴性,CD29及Sca-1阳性率在90%以上.细胞化学染色显示,细胞非特异性酯酶和酸性磷酸酶为阳性,碱性磷酸酶阴性,糖原为弱阳性.细胞经维生素C,β-磷酸甘油及地塞米松诱导后,碱性磷酸酶活性明显增强,阳性率达到94%以上.结论:成体小鼠肌肉组织中含有间充质干细胞,是肌肉干细胞群体中的重要组成部分.
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人胚胎主动脉血管内皮祖细胞的分离、培养及鉴定
目的 研究人胚胎血管内皮祖细胞(EPCs)分离、扩增及鉴定的方法,并评价其分化成血管内皮细胞的能力,为人胚胎血管来源 EPCs 作为干细胞技术治疗疾病的细胞材料提供依据.方法 从 14 周龄流产人胚胎主动脉中应用胶原酶消化法分离获得 EPCs,用含有碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和白血病抑制因子的低血清培养基体外扩增培养EPCs.分离培养的 EPCs 鉴定采用细胞免疫荧光染色、RT-PCR 及流式细胞术,检测 EPCs 细胞的特异标志CD133、CD34 和血管内皮细胞生长因子受体 2(VEGFR2).培养的 EPCs 应用 VEGF 进行诱导分化,并评价其分化成为血管内皮细胞的能力.结果 分离的人胚胎主动脉 EPCs 细胞表达 EPCs 的标志分子 CD133、CD34 和 VEGFR2.EPCs 在体外特定低血清培养条件下表现很强的增殖能力.培养的 EPCs 细胞经过VEGF 诱导后,细胞表达 CD133 明显降低,表达 vWF、CD31 和 ELAM-1 增强,并且体外成管能力和摄取Ac-LDL 能力增强,表明细胞分化成为血管内皮细胞.结论 人胚胎早期主动脉的 EPCs 具有很好的体外自我更新能力和分化成为血管内皮细胞的潜能,可作为 EPCs 治疗疾病的细胞材料.
关键词： 血管内皮生长因子受体2 主动脉 细胞分离 细胞分化 -
防御素的研究进展和应用前景
近年来,在植物、昆虫、两栖类、鸟类和哺乳动物体内发现了一组具有抵抗外界微生物侵害的小分子多肽,称为防御素(defensins).自1984年从人中性粒细胞分离出HNP123以来,已有数十种防御素陆续被发现或报道[1].防御素具有十分广泛的抗菌谱,对细菌、真菌、病毒等多种微生物都具有杀伤作用,尤其是哺乳动物防御素,除了对细菌、真菌、被膜病毒具有杀伤作用外,还能杀伤支原体、衣原体、螺旋体以及一些恶性肿瘤细胞.由于防御素具有众多的生物活性,因此对于它们的研究目前也越来越受到人们的广泛关注.现本文就防御素的结构与类型、生物活性、应用及基因工程制备做一综述.
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地塞米松双向调节小鼠腹腔巨噬细胞白细胞介素-10的表达
IL-10是从TH2细胞分离到的,因能抑制TH1细胞合成和释放细胞因子,故又名细胞因子合成抑制因子.IL-10主要针对T细胞、NK细胞、单核巨噬细胞起抑制作用,是影响体内TH1和TH2平衡的关键性细胞因子之一.因此,对免疫炎症性疾病的发生和发展具有重要的调节作用.我们研究了地塞米松(Dex)对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)IL-10表达的影响.
