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sea基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性的研究
目的 构建葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因及其突变体原核表达系统,了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化.方法 采用高保真PCR和T-A克隆法,从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的sea基因.采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体.建立sea基因及其定位突变体原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白.采用TCID50法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性.采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用.结果 所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100%,7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变.rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52%.rSEA对Vero细胞TCID50为4.1μg,其突变体重组蛋白分别为5.8～23.5μg.1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA/H187A、rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H187A/D227A和rSEA/H225A/D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用(P＜0.05),10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似(P＞0.05).5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长(P＜0.05).结论 本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统,其表达产物的细胞毒性均有所降低.由于rSEA/H225A、rSEA/D227A、rSEA/H225A/D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强,可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体.
