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四种重要生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法的建立
[目的]建立包括蓖麻毒素B(Ricin toxion B,RTB)、肉毒梭菌毒素A(Clostri botulinum toxin A,CBTA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)及产气荚膜毒素ε(Clostridium perfringens toxin ε,CPTε)在内的4种重要生物恐怖因子的多重液相芯片检测方法.[方法]采用双抗夹心法原理和液相芯片技术平台,通过优化偶联抗体浓度和检测抗体浓度以及抗原抗体佳孵育时间,建立4种生物恐怖因子液相芯片多重检测方法.[结果]反应条件优化实验结果表明,RTB、CBTA、SEA和CPTε偶联抗体的佳用量分别为20 μg、40μg、80 μg、80μg; RTB、CBTA、SEA和CPTε检测抗体的佳稀释比分别为1:5000、1:1000、1:2000、1:4000:4种毒素抗原抗体佳孵育时间为60min.多重检测结果表明,本研究建立的毒素液相芯片多重检测方法可有效检测上述任意1种毒素、任意2种毒素组合、任意3种毒素组合并能同时检测4种毒素.灵敏度检测结果表明,RTB、CBTA、SEA、CPTε检测灵敏度分别为1 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml.[结论]本研究建立的4种常见生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法通过1次检测能同时检测RTB、CBTA、SEA、CPTε,是一种准确、灵敏、快速和高通量的检测方法.
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胶体金免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B
目的 建立胶体全免疫层析技术快速定量检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的方法.方法 利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立金黄色葡萄球茵肠毒素B的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合检测曲线进行定量检测;在牛奶样品中添加金黄色葡萄球茵肠毒素B作为模拟污染样品进行检测.结果 该法可在5～10 min内完成定性和半定量检测,检出限为8 ng/ml,线性范围8～1000 ng/ml.结论 建立的检测金黄色葡萄球菌肠毒素B的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的金黄色葡萄球菌肠毒素B,并可实现定量,适用于现场快速检测.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 胶体金 免疫层析 双抗体夹心 -
超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素基因B的原核表达
目的构建重组pET-30a-SEB原核表达载体,转化感受态大肠杆菌BL-21(DE3),诱导表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB).方法利用PCR技术从产SEB的金黄色葡萄球菌标准菌株CMCC-26075基因组DNA中克隆SEB全长序列,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行测序.构建pET-30a-SEB原核表达质粒,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),异丙基硫代β-D半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达,经镍离子螯合亲和层析纯化后免疫鉴定.结果PCR获得超抗原SEB基因片段,与克隆载体连接后经测序与文献报道的基本一致;成功构建了pET-30a-SEB原核表达质粒且成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约31×103的蛋白.结论成功克隆了seb基因序列,并进行了原核表达和签定,获得了SEB蛋白,为后续对超抗原SEB的进一步研究奠定了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 超抗原 基因克隆 原核表达 PCR免疫印迹 -
体外联合抗原修饰的树突状细胞的抗癌效应
目的:研究结肠癌患者外周血树突状细胞(dendritic cell, DC)体外联合抗原诱导后的免疫活性.方法:从结肠癌患者外周血中分离并培养DC, 时效实验中分时段以肿瘤抗原修饰DC, 取佳组与T淋巴细胞共孵不同时间, 用MTT检验其对肿瘤细胞的杀伤率; 量效实验中将肿瘤抗原和不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B(staph-lococcus aureus enterotoxin B, SEB)在上一步得出的佳时间内修饰DC, 取佳组按不同比例(DC∶T淋巴细胞)来共孵上一步得出的佳共孵时间, 用MTT检验其对肿瘤细胞的杀伤率.结果: 时效实验组抗原修饰36 h组DC特有分子表达高, 对结肠腺癌细胞的杀伤率也高, 与其他组比较有差异(35.92±0.71 vs 14.85±1.24, 35.92±0.71 vs 9.68±1.25, 35.92±0.71 vs 17.97±1.01, 35.92±0.71 vs 20.32±0.92, P<0.05). 量效实验组联合抗原修饰第7天(SEB: 100 mg/L)DC表达DC特有分子高, 在联合修饰组内, 以1∶100组的杀伤率高, 与其他组比较有显著差异(47.70±2.84 vs 28.99±6.95, 47.70±2.84 vs 40.02±3.65, 47.70±2.84 vs 34.55±3.21, P<0.01). 结论:体外DC抗原修饰和递呈的佳时间都是36 h, 联合应用超抗原SEB的佳值100 ug/L, DC与T淋巴细胞的佳共孵比例是1∶100.
关键词： 树突状细胞 T淋巴细胞 金黄色葡萄球菌肠毒素B 结肠癌 -
TIM4对小鼠食物过敏模型中抗原特异性Th2细胞分化的影响
目的:研究微生物产物对树突状细胞(dendritic cell,DC)和TIM4的作用,探讨在微生物产物参与的食物过敏(food allergy,FA)中TIM4对CD4+T淋巴细胞分化的影响.方法:培养Balb/c小鼠骨髓来源的树突状细胞(bone marrow-derived DC,BMDC),培养的DC分为两组:金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激组和空白对照组,RT-PCR检测不同组DC的TIM4 mRNA表达;流式细胞仪检测DC表面CD11c、MHC-Ⅱ、CD86的表达.在DC和CD4+T淋巴细胞共同培养中将培养的DC分为5组:空白对照组、SEB+卵清蛋白(OVA)组、SEB组、OVA组及TIM4组,同时取过敏模型小鼠脾脏CD4+ T淋巴细胞,不同组的DC与CD4+ T淋巴细胞共同培养,ELISA 法测定混合培养细胞上清液IL-4与IFN-γ的表达.结果:与空白对照组相比,SEB组DC TIM4 mRNA表达明显增高(0.941±0.018 vs 0.422±0.083,P<0.05),并具有剂量依从性.SEB组DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86表达明显高于空白对照组(MHC-Ⅱ:76.684%±3.1803%vs52.984%±3.6026%:CD86:89.746%±2.113%vs 67.558%±0.4341%,均P=0.000).DC和CD4+ T淋巴细胞共同培养中,相比空白对照组.SEB+OVA组IL-4表达显著增高(295.834±20.408 vs 78.335±13.109,P<0.05),而IFN-γ的表达明显减少(362.109±92.271 vs 761.897±102.967,P<0.05);单独的SEB组或OVA组IL-4和IFN-γ与空白对照组无明显差异;TIM4组中IL-4的表达水平较SEB+OVA组明显降低,而IFN-γ的表达明显增高(90.511±15.500 vs 295.834±20.408;807.734±95.436 vs 362.109±92.271,均P<0.05).结论:微生物产物和食物抗原共同作用导致FA,TIM4参与FA的发生.消除TIM4的表达可明显抑制Th2细胞分化,有效纠正Th1/Th2细胞失衡,可阻止过敏性免疫反应.
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SEB/OVA变应性鼻炎模型中调节性T细胞的作用研究
目的 建立变应性鼻炎(AR)小鼠模型,研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)和卵清蛋白(ovalbumin,OVA)在建立AR模型中的作用,并探讨小鼠鼻黏膜中调节性T细胞(regulatoryT cell,Treg)的变化.方法 将40只6～8周Balb/c小鼠,随机分为4组:OVA组(A组)、SEB组(B组)、OVA+SEB组(C组)、生理盐水组(D组),建立小鼠AR模型.采用析因设计分析各组小鼠临床症状评分及Foxp3阳性细胞数.结果 A、B、C、D组症状评分分别为0.90±0.99、0.70±0.82、6.80±1.03、0.60±0.70,C组造模成功,OVA与SEB交互效应,P＜0.01;与其他三组相比,C组Foxp3阳性细胞数显著下降,OVA、SEB交互效应,P＜0.01.结论 只有SEB和OVA协同作用后可致小鼠AR,即SEB可以提高机体对OVA的易感性,发挥免疫佐剂的作用;小鼠鼻黏膜中Treg水平下降,不能有效抑制鼻Th2细胞反应,可能是AR发生的原因之一.
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超抗原活化的耐受性淋巴细胞防治高危角膜移植免疫排斥反应的实验研究
目的 检测超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)体外活化的小鼠淋巴细胞的免疫耐受功能,探讨该细胞对小鼠高危角膜移植免疫排斥反应的防治作用.设计实验研究.研究对象14只BALB/C小鼠作为供体,28只C57BL/J小鼠作为受体.方法 无菌取C57BL/J小鼠脾脏淋巴细胞,制备成5×106/ml的混悬液,分别与SEB和刀豆蛋白A(ConA)体外共培养,MTT法测定细胞增殖.用流式细胞仪测定SEB和ConA体外活化的淋巴细胞在第0、6天时的CIM+CD25调节性T细胞和CD3+NK1.1+NKT细胞百分比.以BALB/c小鼠为供体,C57BL/J小鼠为受体,建立小鼠高危角膜移植动物模型,术后分为实验组、对照组,并分别结膜下注射0.05 ml培养6天的SEB活化的淋巴细胞悬液(浓度1×106个细胞/ml)及相同体积的生理盐水,术后观察记录植片的存活状况,并进行组织病理学检查和免疫组织化学检测.主要指标角膜植片平均存活时间,组织病理学及免疫组织化学染色检查淋巴细胞浸润情况.结果 SEB、ConA与淋巴细胞共培养前OD570nm值均为0.15±0.01(n=6),共培养后第3天为0.25±0.07和0.59±0.06,第6天为0.43±0.07和0.35±0.05.SEB组培养后的淋巴细胞中CD3+NK1.1+NKT细胞由0天时的(1.21±0.19)%升高到(5.67±0.25)%,CD4+CD25+调节性T细胞由(0.37±0.06)%升高到(0.98±0.12)%.活化淋巴细胞结膜下注射后小鼠角膜植片平均存活(28.60±3.75)天,而生理盐水组为(22.13±4.91)天,两者比较差异有统计学意义(P=0.006).HE染色显示对照组植片中度水肿,角膜基质纤维板层结构排列紊乱,有炎性细胞浸润,植片中可见新生血管.而实验组植片仅轻度增厚,基质板层纤维排列规则,未见炎性细胞浸润及新生血管长入.免疫组织化学染色显示治疗组小鼠角膜植片中CD4+和CD8+淋巴细胞数量较对照组明显减少.结论 SEB和ConA均能活化小鼠淋巴细胞并使其增殖.SEB组培养后的淋巴细胞中CD3+NK1.1+NKT细胞和CD4+CD25+调节性T细胞含量比培养前升高.SEB活化的小鼠淋巴细胞具有免疫耐受功能,能够延长小鼠高危角膜移植植片的存活时间.
关键词： 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素B 角膜移植 耐受性淋巴细胞 免疫排斥反应 -
慢性鼻-鼻窦炎合并鼻息肉(CRS/NP)患者术前和术后鼻腔黏膜SEB的检测
目的:探讨金黄色葡萄球菌肠毒素B在鼻腔慢性炎症发生、发展过程中的作用.方法:选择慢性鼻一鼻窦炎合并鼻息肉(CRS/NP)的患者30例作为研究对象.于鼻内镜手术过程中严格无菌操作取鼻息肉组织及水肿黏膜,通过细菌培养、PCR检测金葡菌菌落和金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB).术后3个月换药时取恢复期鼻黏膜同法测定上述指标,后进行统计学分析.结果:30例标本有13例鼻腔或鼻窦黏膜培养出金黄色葡萄菌菌落,其中9例检测出SEB;功能性鼻内镜手术后有5例标本培养出金黄色葡萄菌菌落,SEB未检出.结论:实验证实了SEB在鼻腔慢性炎症中可能具有的重要作用,在经过以功能性鼻内镜手术为主的综合治疗后,SEB检出率降低.
关键词： 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌肠毒素B 鼻腔 -
利用表面等离子体谐振技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素B
本文研究了利用自行研制开发的表面等离子体谐振(SPR-2000)生化分析仪检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)与其羊单克隆抗体IgG的免疫吸附反应,并研究了用SPR技术检测生物大分子相互识别反应相关的一些问题.为了消除溶液间本体折射率差异的影响,我们采用牛血清白蛋白(BSA)本体折射率补偿法,使通入流动系统的不同溶液获得基本一样的本体折射率,获得了很好的效果.在此基础上, SPR-2000生化分析仪初步实验已经能检测到的SEB低浓度是1μg/ml,相当于3.5×10-8M.进一步的实验仍在进行中.
关键词： 表面等离子体谐振 金黄色葡萄球菌肠毒素B 免疫吸附反应 -
金黄色葡萄球菌肠毒素B在不同动物模型中的应答及治疗策略的研究新进展
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)的感染引起的多种临床症状均与其分泌的金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)密切相关,临床对SEB毒素中毒尚无特效疗法.本文对SEB在不同动物模型中的应答及治疗策略的研究新进展作一综述.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 动物模型 治疗策略 -
Tf-SEB偶合蛋白对荷瘤小鼠的疗效及其机理探讨
目的研究人转铁蛋白(Tf)与金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)偶联后,在体内对肿瘤的治疗效果及其机理.方法采用化学方法将Tf与SEB偶联成Tf-SEB偶联蛋白,观察该偶联蛋白对荷瘤小鼠的疗效;采用免疫细胞化学方法初步探讨该偶联蛋白在体内的抗肿瘤机理.结果偶联蛋白处理组动物的肿瘤发生率和死亡率及肿瘤体积均显著低于单体SEB处理组和其它各组;免疫细胞化学结果显示,偶联蛋白处理的动物肿瘤组织内有更为明显的CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润.结论经化学偶联的Tf-SEB偶联蛋白在体内比单体SEB具有更强的激活T细胞的抗肿瘤作用,该作用可能部分是由于具有导向效应的超抗原Tf-SEB偶联蛋白诱导了超抗原依赖细胞介导的细胞毒效应所致.
关键词： 转铁蛋白 金黄色葡萄球菌肠毒素B 超抗原 肿瘤 导向免疫治疗 -
荧光纳米颗粒标记技术快速检测产enterotoxin B金黄色葡萄球菌的实验研究
目的 通过制备SA肠毒素B(enterotoxin B)荧光纳米颗粒单克隆抗体,探讨产enterotoxin B的SA快速检测方法.方法 将已构建好的重组质粒载体PET-28a-enterotoxin B转化入E.coli BL21(DE3),进行株中诱导表达,获得表达蛋白,免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体.再免疫Bal b/c小鼠,制备单克隆抗体荧光纳米颗粒偶联物.后将多克隆抗体包被,制成免疫层析检测试纸条,并设质控线.将不同浓度的标准菌株混入样品中,收集提取液,在反应杯中与荧光纳米颗粒-单抗偶联物和试纸条共同反应5 min,紫外光下肉眼观察结果.结果 实验克隆分子量为798 bp的enterotoxin B基因片段,构建的重组质粒载体能高效表达,获得分子量为34.5 kD的目的蛋白质.单克隆抗体荧光颗粒偶联物与阳性菌株特异性反应,阴性对照菌株无反应.结论 研制的荧光纳米颗粒-enterotoxin B单克隆抗体偶联物特异性强、稳定性好且灵敏度高,实现短时间内对产enterotoxin B的SA快速检测.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 荧光纳米颗粒 单(多)克隆抗体 偶联 快速检测 -
超抗原和肿瘤抗原修饰树突状细胞的杀瘤效应
目的:测定经超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B (SEB)和结肠癌肿瘤抗原联合修饰树突状细胞(DC)的活性.方法:结肠癌手术标本体外培养出结肠癌细胞并鉴定之,冻融法制备肿瘤抗原;同一患者外周血分离出单个核细胞,以细胞因子诱导为DC;尼龙棉柱过滤获取T淋巴细胞;肿瘤抗原和不同质量浓度的SEB联合修饰DC;以联合抗原修饰后的DC为刺激细胞,自体T淋巴细胞为效应细胞,相同时间下以不同比例共同孵育后,采用MTT法检测对结肠癌细胞的体外杀伤效果.结果:诱导出表达CD11c,CD80,HLA-DR分子的DC,经结肠癌肿瘤抗原和SEB联合修饰后,上述分子表达上调.联合抗原修饰DC的T细胞活化作用强于单独使用结肠癌肿瘤抗原修饰DC的T细胞活化作用.100 μg/L SEB 和肿瘤抗原联合修饰的DC以1GA6FA100比例与T淋巴细胞共孵后的杀伤肿瘤细胞效应强.结论:SEB和肿瘤抗原联合修饰DC的活性明显强于单用肿瘤抗原修饰DC的活性.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 树突状细胞 T淋巴细胞 结肠癌 -
金黄色葡萄球菌肠毒素B对小鼠淋巴细胞产生肿瘤坏死因子-α的影响
目的观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对淋巴细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)-α的影响.方法密度梯度离心法获得鼠脾淋巴细胞,不同时间和浓度的SEB处理,流式细胞仪检测产生TNF-α的淋巴细胞阳性率.结果 TNF-α的产生在5d和100ng·ml-1时达到高峰.结论 SEB能有效刺激淋巴细胞产生TNF-α.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 淋巴细胞 肿瘤坏死因子-α 流式细胞仪 -
金黄色葡萄球菌肠毒素B激活TACE诱导人鼻黏膜上皮细胞分泌黏蛋白
目的：观察金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对人鼻黏膜上皮细胞活性氧(ROS)和肿瘤坏死因子转化酶( TACE)活性的影响,并探讨其在介导黏蛋白MUC5AC分泌中的作用。方法体外培养人鼻黏膜上皮细胞,用不同浓度的SEB孵育细胞0~24 h,采用荧光共振能量转移法检测TACE的酶活性,荧光探针H2DCFDA检测鼻黏膜上皮细胞中活性氧( ROS)的含量,ELISA检测培养上清中MUC5AC的分泌水平。同时采用TACE siRNA干扰或ROS抑制剂NAC处理细胞,观察其在介导MUC5AC分泌中的作用。结果100 ng/mL SEB作用鼻黏膜上皮细胞15 min后即可上调TACE的酶活性,30~60 min后达到峰值,并持续至2 h；SEB也能增加鼻黏膜上皮细胞内ROS的含量；采用NAPDH氧化酶抑制剂DPI处理后,ROS水平明显减少；ROS抑制剂NAC处理鼻黏膜上皮细胞后,可明显降低TACE的酶活性；30~100 ng/mL SEB能显著诱导鼻黏膜上皮细胞分泌MUC5AC,采用TACE siRNA干扰其表达或抑制剂处理后,可抑制MUC5AC分泌。结论 SEB激活TACE诱导人鼻黏膜上皮细胞分泌MUC5AC。
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 肿瘤坏死因子α转化酶 活性氧 黏蛋白 -
超抗原SEB对直肠腺癌TIL扩增的研究
目的观测超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对直肠腺癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的激活扩增作用.方法以SEB和细胞因子IL-2分别刺激扩增人中分化直肠腺癌TIL,比较分析TIL细胞数的变化, IL-2和TNF-α分泌的变化.结果 SEB对直肠腺癌TIL有较强大的刺激作用.无论在细胞数量的增加,还是在促进细胞因子的分泌方面,SEB均显示了其对TIL强大的刺激功效.和IL-2相比,SEB对直肠腺癌TIL的刺激更为迅速,早期SEB的刺激作用较IL-2强大,后期则较IL-2弱.结论 SEB是一种良好的TIL激活剂.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 肿瘤浸润淋巴细胞 直肠腺癌 细胞因子 -
金黄色葡萄球菌及其肠毒素B对慢性实验性哮喘小鼠的影响
目的 探索金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)对实验性支气管哮喘小鼠肺组织Th0细胞分化的在体调节和对气道炎症的作用.方法 32只15～17 d BALB/c小鼠,随机分为4组:对照组、模型组、金黄色葡萄球菌组、金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)组.用卵蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠慢性哮喘模型,在致敏前14 d对幼年鼠做金黄色葡萄球菌或SEB预防性腹腔注射.观察记录小鼠的耗氧量、肺组织切片、支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞及相关细胞因子等的改变.结果 金黄色葡萄球菌组与模型组相比.肺组织病理切片结构紊乱减轻、炎症细胞明显减少,小鼠耗氧量降低(5.24±0.12 vs 5.59±0.18),BALF中IL-4水平明显下降(44.94±4.51 vs 29.37±4.17),IFN-γ水平明显增加(19.61±3.83 vs 29.33±4.04),SEB组也有上述作用(耗氧量:5.09±0.20;细胞介素4:36.68±5.10;γ干扰素:24.27±3.46).结论 金黄色葡萄球菌能明显减轻实验性哮喘的气道炎症,纠正哮喘小鼠肺组织中Th1/Th2细胞因子的失衡,其作用可能是通过其分泌的SEB.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 哮喘 气道炎症 -
变应性鼻炎患者鼻黏膜 SEB 和 TIM4的表达及其相关性研究
目的：观察葡萄球菌肠毒素 B（SEB）和 T 细胞免疫球蛋白粘蛋白4（TIM4）在变应性鼻炎患者鼻黏膜中的表达，并探讨其相关性。方法收集24例过敏性鼻炎（AR）患者和22例非 AR 患者手术切除的鼻黏膜标本。从手术切除的鼻黏膜中分离单核细胞并进行流式分析。采用 ELISA、qRT －PCR 和 Western blot 检测 AR 患者鼻黏膜中 SEB 和 TIM4水平。结果在 AR 患者的鼻黏膜中检测到了大量的 B 细胞，同时表达高水平的 TIM4和共刺激分子。在 AR 鼻黏膜检测到高水平的 SEB。加 SEB 培养时， SEB 能介导鼻黏膜 B 细胞 TIM4的表达。 SEB水平和 TIM4＋ B 细胞频率呈正相关（r ＝0.596，P ＜0.05）。结论AR 鼻黏膜中 SEB 和 TIM4表达升高；接触 SEB能介导幼稚 B 细胞表达 TIM4和共刺激分子。 TIM4＋CD19＋B 细胞可能成为治疗 AR 的潜在靶点。
关键词： 过敏 鼻黏膜 鼻炎 金黄色葡萄球菌肠毒素B T细胞免疫球蛋白粘蛋白4 -
胶体金免疫层析法快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A和B
目的 建立快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A (Staphylococcal enterotoxin A,SEA)和B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)的胶体金免疫层析法.方法 用胶体金标记双特异性抗SEA/SEB的单克隆抗体,组装双抗体夹心免疫层析测试卡,快速检测SEA和SEB,评价其检测性能.结果 该测试卡可在10 min内完成定性和半定量检测,对SEA的检测范围为10～ 100 ng/mL,灵敏度为10 ng/mL;对SEB的检测范围为1～100 ng/mL,灵敏度为1 ng/mL.测试卡特异性较强,与SEC、SED和SEE无交叉反应.测试卡的稳定性和重复性良好.进行模拟污染样品试验,灵敏度未见明显下降.结论 胶体金免疫层析测试卡能快速、特异、准确地检测样品中的SEA和SEB,适用于现场快速检测与食物中毒筛查.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 金黄色葡萄球菌肠毒素B 胶体金 免疫层析 -
金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达
目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究.方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序.IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrapTM chelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性.用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性.结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同.表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB.ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应.小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性.结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素B 克隆 多聚酶链试反应 原核表达
