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重组金黄色葡萄球菌肠毒素A协同增强破伤风类毒素的免疫原性研究
目的 重组超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A (SEA)与Al(OH)3佐剂联合应用协同增强破伤风类毒素(TT)的免疫原性观察.方法 将高、低两个剂量的TT分别与高、中、低3个剂量的重组SEA同时吸附一定浓度的Al(OH)3作为样品组,同时设置高、低剂量TT分别与同样浓度Al(OH)3的吸附组作为对照；各组分别腹部皮下免疫NIH小鼠8只,0.5 ml/只；免疫4周后,摘眼球采血,分离血清,检测各组抗TT抗体的IgG水平.结果 在TT高剂量组,高、中剂量的SEA均能增强抗TT抗体的IgG水平(P＜0.05),而低剂量SEA组与对照组相比未能增强TT的免疫原性；在TT低剂量组,3个剂量的SEA均能显著增强TT的免疫原性,P＜0.05.结论 TT联合重组SEA及Al(OH)3佐剂能诱导免疫后小鼠产生更强的体液免疫应答,SEA及Al(OH)3佐剂对TT具有协同免疫增强效应.
关键词： 超抗原 破伤风类毒素 佐剂 免疫 金黄色葡萄球菌肠毒素A -
金黄色葡萄球菌肠毒素A检测方法的建立及其应用
目的 建立一种敏感、特异、便捷的方法,用于检测食源性金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA).方法采用经典的细胞融合技术制备抗SEA的单克隆抗体,亲和层析纯化抗体蛋白,ELISA方法测定抗体滴度,免疫层析分析抗体亚型.以抗SEA单抗为一抗,建立Western印迹法,检测不同食物样品中的SEA.结果筛选出3株抗SEA的单抗,命名为SEA-7,SEA-18和SEA-86.纯化后的3株单抗纯度均>90％,抗体滴度均在1:32000,经鉴定均为IgG1亚型.利用3株单抗建立检测SEA的Western印迹法,SEA-7的检测灵敏度高,可达1.56 ng.以SEA-7为一抗,可检测出不同食物中污染的SEA,如污染了1.56 ng SEA的水,污染了5 ng SEA的粥或火腿肠匀浆.结论建立的检测SEA方法可靠灵敏,可用于监测食源性金黄色葡萄球菌污染.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 单克隆抗体 毒素检测 -
金黄色葡萄球菌肠毒素A基因克隆及表达
目的对金黄色葡萄球菌肠毒素A基因(SEA)进行克隆、鉴定与表达,为制备单抗、诊断试剂及进一步深入研究SEA的功能奠定基础.方法用聚合酶链反应(PCR)扩增SEA基因,将扩增的产物连接于测序载体pMD18-T上,经测序反应确定无误,酶切后将SEA基因与原核表达载体pET42b(+)构建表达SEA的重组质粒,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒,经双酶切鉴定后,再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内,对转化菌株进行诱导后,破菌,进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE).结果构建了表达载体pET42b(+)-SEA,并获得高效表达,表达的蛋白质相对分子质量为27 000,重组蛋白(rSEA)在37 ℃、25℃经异丙基硫化-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导时均以包涵体形式存在.结论 SEA基因成功克隆到表达质粒内并表达,为制备单抗、诊断试剂及其致病机制研究奠定了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 原核表达载体 克隆 表达 -
重组金葡菌肠毒素A的抗癌效应研究
目的: 金黄色葡萄球菌肠毒素A作为一种超抗原,其抑瘤活性一直受到关注,其直接应用于肿瘤治疗的报道较少,本研究对其抑瘤活性进行了分析.方法: 利用亲和层析纯化出重组SEA,注射接种了黑色素瘤的小鼠,观察其抑瘤效应.结果: 各组剂量的重组SEA均能有效抑制肿瘤的生长,其高、中、低剂量重组SEA的抑瘤率分别为79.3%、75.6%和73.8%,而原位注射(中剂量)的抑瘤率为90.6%.治疗小鼠的肿瘤组织出现大量的T细胞浸润;此外,SEA以免疫的形式刺激动物,能明显产生特异性抗体,并在一定程度上增强小鼠对肿瘤转移的抵抗力.结论: 重组SEA对小鼠黑色素瘤的能产生明显的抑制效应,尤其是原位注射,这为SEA的靶向治疗肿瘤奠定了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 肿瘤 免疫治疗 -
SEA基因修饰抑制小鼠恶性黑素瘤B16细胞肺转移
超抗原 (superantigen)是一组细菌或病毒编码的新型蛋白质分子,它以完整的蛋白质分子形式分别直接与抗原提呈细胞(APC)膜上MHCⅡ类分子抗原结合槽外侧及T细胞表面抗原识别受体TCRVβ区直接结合,不需要APC处理,即可激活比普通抗原多达数千乃至数万倍的T淋巴细胞,并促使活化的T细胞分泌多种足量的细胞因子如TNF-α、TNF-β、TNF-γ、IL-2、IL-6等,产生强烈的抗肿瘤免疫效应,直接或间接地杀伤肿瘤细胞[1～3].作为超抗原的一种,金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal-enterotoxin A,SEA)近年来受到国内外学者广泛关注,大量研究表明[2,4],SEA在肿瘤的导向免疫治疗中具有巨大的潜力和良好的应用前景.本研究通过用SEA对小鼠黑素瘤细胞B16进行修饰,实现了抗肿瘤效果作用,现将结果报告如下.
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超抗原治疗恶性黑素瘤的实验研究进展
超抗原可以与普通抗原不同的形式大量激活T淋巴细胞,调动机体的抗肿瘤免疫功能.利用这一特性,将超抗原与相应的抗肿瘤相关抗原的单抗制成融合蛋白,以此治疗恶性黑素瘤,发现针对表达相应抗肿瘤相关抗原的B16黑素瘤细胞均有强烈的杀伤作用,荷瘤小鼠的存活期可得到延长.通过诱导SEA基因与主要组织相容性抗原Ⅱ类分子结合位点的突变与联用细胞因子,还可降低上述融合蛋白所致的毒副作用,并增强其抗肿瘤效应.此外,将超抗原基因转染治疗恶性黑素瘤在实验动物身上也取得了较好的疗效.
关键词： 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素A 恶性黑素瘤 免疫疗法 -
应用E1区缺陷载体构建携带SEA基因的选择性腺病毒
目的:构建由端粒酶启动子(hTERT)调控的携带超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcus aureus enterotoxin A,SEA)基因的选择性复制重组腺病毒.方法:应用酶切、连接方法将hTERT连接于腺病毒穿梭质粒E1A和E1B序列之前调控E1A和E1B蛋白的表达,CMV启动子和SV40分别调控目的基因SEA的表达和终止,利用脂质体将腺病毒骨架质粒和穿梭质粒共同转染人胚肾293细胞(HEK-293)进行同源重组,获取选择性复制腺病毒CMV-SV40-hTERT(CSS-H),氯化铯梯度离心纯化重组腺病毒,并测定病毒滴度.结果:应用PCR验证、双酶切分析、序列测定等方法验证重组质粒基因片段连接正确无突变,通过同源重组获得携带超抗原SEA基因片段的CSS-H重组腺病毒,测定滴度为2.9×1010 pfu/ml.结论:携带SEA基因选择性复制重组腺病毒CSS-H成功构建.
关键词： 腺病毒 肿瘤 金黄色葡萄球菌肠毒素A -
双调控溶瘤腺病毒携带SEA基因靶向鼠膀胱癌的表达
目的:研究hTERT和HIF启动子双调控的溶瘤腺病毒能否感染鼠膀胱癌细胞并表达治疗基因,为动物实验提供依据.方法:以不同浓度溶瘤腺病毒感染鼠膀胱癌细胞,生物倒置显微镜下动态观察细胞形态变化,RT-PCR检测SEA在细胞内mRNA表达,Western blot检测SEA蛋白表达.结果:镜下可见细胞感染腺病毒并终裂解,RT-PCR和Western blot分别检测到实验组mRNA和蛋白的表达.结论:携带SEA基因的hTERT/HIF双调控溶瘤腺病毒可在鼠膀胱癌细胞内复制增殖并表达SEA基因,可用于治疗鼠膀胱癌的动物实验研究.
关键词： 溶瘤腺病毒 膀胱癌 金黄色葡萄球菌肠毒素A 人端粒酶逆转录酶 缺氧诱导因子 -
重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用
目的:将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列进行拼接,形成融合基因.方法:利用重叠区扩增基因拼接法,分别扩增hPLAP-1 C末端信号肽序列和SEA基因序列.然后,将二段基因拼接并与pGEM-T克隆载体连接,酶切和测序鉴定.结果:成功扩增出hPLAP-1 C末端信号肽序列131 bp和SEA基因序列796 bp;经测序证实,二段基因序列成功拼接(901 bp).结论:重叠区扩增基因拼接法能将SEA基因与hPLAP-1C末端信号肽序列拼接,形成融合基因.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 碱性磷酸酶 重叠区扩增基因拼接法 -
SEA诱导人PBMC对结肠癌Caco-2细胞的杀伤效果观察
目的 通过蛋白注入和基因转染两种形式,观察金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)诱导人外周血单核细胞(PBMC)对结肠癌Caco-2细胞的杀伤效果.方法 密度梯度离心法分离PBMC,用不同浓度SEA诱导;MTT法测定PBMC对Caco-2细胞的杀伤率;用阳离子脂质体法将重组质粒pEGFP-N1-SEA转染至Caco-2细胞,检测PBMC对该细胞的杀伤率.结果 在一定范围内,随着SEA浓度的升高,PBMC对Caco-2细胞的杀伤率显著上升,在36 h、高效靶比、高SEA浓度的情况下,杀伤率可达57.23%;将pEGFP-N1-SEA转染至Caco-2中,转染效率达55%,同时能显著提高PBMC的杀伤率,转染60 h后杀伤率可达54.62%.结论 通过蛋白注入和基因转染两种形式,SEA均能诱导并增强PBMC对Caco-2细胞的杀伤效果.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 外周血单核细胞 结肠癌细胞 阳离子脂质体 -
携带超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因低免疫原性病毒的构建
目的 构建具备表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因的低免疫原性慢病毒载体,以期发挥高效激活T细胞抗肿瘤作用.方法 应用聚合酶链反应(PCR)获取大小分别为851 bp的人端粒酶反转录酶(hTERT)-CMV启动子序列及774 bp的SEA目的基因,将目的基因构建到慢病毒载体质粒中,基因测序正确后,转入感受态细胞DH5α中扩增、收集.利用穿梭质粒和包装质粒共转染293FT细胞中包装病毒,超速离心浓缩法收集病毒上清液,荧光滴度法检测病毒滴度.感染复数(MOI)=10病毒上清转染膀胱肿瘤细胞BIU-87细胞株,收集PCR产物测序目的基因,Western blot法检测SEA基因表达.结果 载体质粒大小为10 458 bp,基因测序正确,无明显碱基突变.荧光滴度法检测病毒滴度为(4.30 ±2.00)×109 TU/ml.PCR产物测序目的基因证实目的基因正确,分光光度计检测24、48、96 h总RNA产物分别为742、803、726 mg/L.Western blot结果显示SEA基因成功表达.结论 成功构建携带超抗原SEA基因低免疫原性病毒.
关键词： 慢病毒 金黄色葡萄球菌肠毒素A 肿瘤 超抗原 -
靶向性超抗原EGF-SEA融合基因的构建及表达
目的:构建金黄色葡萄球菌肠毒素A (SEA)和表皮生长因子(EGF)表达载体.方法:利用PCR及RT-PCR技术分别克隆出SEA基因及EGF基因片断,以经过改良优化的桥式PCR将2个基因融合,再转入表达载体pET-44,经诱导剂诱导后分泌SEA-EGF融合蛋白.结果:所得SEA、EGF基因测序结果示与GENEBANK中公布的标准序列一致,且成功融合SEA-EGF基因并成功导入表达载体.结论:该研究成功构建了SEA-EGF表达载体,为进一步研究SEA-EGF融合蛋白抗头颈肿瘤靶向免疫治疗奠定了基础.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 表皮生长因子 超抗原 靶向治疗 -
超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A锚定的膜表达热休克蛋白70的肠癌瘤苗的抗癌治疗作用研究
目的 研制超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)锚定的膜表达热休克蛋白(HSP)70的肠癌细胞瘤苗,研究其抗肿瘤治疗作用.方法 以先期实验制备的膜表达HSP70肠癌细胞株CT26.扩增后以本研究组早先研制的跨膜型SEA蛋白转染法锚定肠癌细胞,灭活并制备双重修饰的肠癌细胞瘤苗.观察瘤苗在体外对小鼠脾淋巴细胞的增殖刺激效应;在BALB/c小鼠结直肠癌移植模型中观察瘤苗的抗癌治疗作用:瘤体生长抑制和荷瘤鼠的生存时间;并同时检测实验鼠的自然杀伤细胞(NK)和细胞毒淋巴细胞(CTL)活性.结果 激光共聚焦显微镜和流式细胞术均证明瘤苗细胞的双重修饰:SEA锚定,HSP70表达并结合在瘤苗细胞膜表面.比较对照,SEA锚定或膜表达HSP70的单一修饰瘤苗均显示出较高的鼠淋巴细胞增殖刺激效应;较强的瘤体生长抑制,并使荷瘤鼠的生存时间延长.而SEA锚定的膜表达HSP70的双重修饰瘤苗比单一修饰瘤苗,有着更高的淋巴增殖刺激效应,更强的瘤体生长抑制作用,并使荷瘤鼠的生存时间进一步延长.结论 成功研制了超抗原SEA锚定的膜表达HSP70的肠癌细胞瘤苗,此双重修饰瘤苗对结直肠癌荷瘤小鼠有更强的治疗作用.
关键词： 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素A 热休克蛋白70 结肠肿瘤 瘤苗 -
超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A对T淋巴细胞分化的作用
目的:探讨超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(stapylococoal enterotoxin A,SEA)对T淋巴细胞亚群Tc/Th细胞增殖的不同影响.方法:以SEA刺激脐带血单个核细胞(CBMCs),以3H-TdR掺入法及ELISA法检测Tc/Th细胞对SEA刺激的反应.结果:经SEA刺激后,CBMCs中的Tc0/Th0增殖并向Ⅰ型或Ⅱ型分化.在较低浓度SEA刺激时,CBMCs分泌IL-10的比例高于γ-IFN;而经较高浓度SEA刺激后,CBMC分泌γ-IFN 的比例高于IL-10.结论: SEA在较低浓度刺激时, 诱导T淋巴细胞向Tc1/Th1的分化;而较高浓度时,在促进T细胞增殖的同时,可以诱导T细胞向Tc2/Th2的分化.
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SEA对PML-RARα多肽体外诱导外周血单个核细胞TCRζ链表达的作用
目的:了解金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)联合PML-RARα融合多肽体外诱导正常人外周血T细胞活化TCRζ链基因表达情况.方法:利用T细胞液体培养法分别与正常人外周血淋巴细胞加入PML-RARα融合多肽、SEA和SEA联合PML-RARα多肽诱导培养T细胞,其中SEA刺激包括培养初始或培养第5天加入SEA两组(PS、PSI),并设空白对照组(不加多肽及SEA).分别收集各组培养20 d后细胞提取mRNA并合成cDNA,采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量检测TCRζ链在不同组别T淋巴细胞中的表达情况,以β2微球蛋白基因(β2M)作为内参,根据相对定量公式:2<'-△△Ct>分析TCRζ链表达差异.结果:与空白组相比,联合诱导组在培养初始加入SEA及第5天加入SEA的培养T细胞中TCRζ链表达上升,而单独SEA诱导组的TCRζ链表达下降.结论:超抗原SEA联合PML-RAR α多肽体外诱导T细胞可使TCRζ链基因表达水平升高,有望为研制急性早幼粒细胞白血病疫苗提供新的切入点.
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胶体金免疫层析法快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A和B
目的 建立快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素A (Staphylococcal enterotoxin A,SEA)和B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)的胶体金免疫层析法.方法 用胶体金标记双特异性抗SEA/SEB的单克隆抗体,组装双抗体夹心免疫层析测试卡,快速检测SEA和SEB,评价其检测性能.结果 该测试卡可在10 min内完成定性和半定量检测,对SEA的检测范围为10～ 100 ng/mL,灵敏度为10 ng/mL;对SEB的检测范围为1～100 ng/mL,灵敏度为1 ng/mL.测试卡特异性较强,与SEC、SED和SEE无交叉反应.测试卡的稳定性和重复性良好.进行模拟污染样品试验,灵敏度未见明显下降.结论 胶体金免疫层析测试卡能快速、特异、准确地检测样品中的SEA和SEB,适用于现场快速检测与食物中毒筛查.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 金黄色葡萄球菌肠毒素B 胶体金 免疫层析 -
SEA-CD80基因过表达Hepa1-6肝癌细胞体外诱导的免疫学效应
观察经SEA和CD80重组腺病毒感染Hepa1-6肝癌细胞后体外能否诱导抗肿瘤免疫学反应.方法 Hepa1-6细胞分别经空载体腺病毒Ad(空)和重组腺病毒Ad-MMRE-mTERT-B7、Ad-MMRE-mTERT-SEA、Ad-MMRE -mTERT-BIS感染后,和小鼠脾淋巴细胞共培养,然后采用Brdu酶联免疫法(ELISA)检测淋巴细胞增殖；流式细胞术检测T淋巴细胞亚群增殖；ELISA法检测细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ的产生；LDH释放法检测CTLs对Hepa1-6的杀伤作用.结果与感染空载体腺病毒Ad(空)和未感染Hepa 1-6细胞相比,经重组腺病毒感染的Hepa1-6细胞体外能够显著诱导脾淋巴细胞的增殖,其中CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞增殖显著；细胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-2的产生显著升高；CTIs对肿瘤细胞的杀伤活性显著增强；双基因过表达Hepa1-6细胞体外诱导的免疫应答高于单基因过表达Hepa-6细胞.结论Hepa-6细胞经重组腺病毒感染后,表达在细胞膜上的SEA和CD80均具有免疫学活性,为今后采用所构建重组腺病毒进行肿瘤的免疫基因治疗提供了实验依据.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A CD80 腺病毒 体外 抗肿瘤免疫 -
SEA基因与GPI信号肽序列融合基因的真核表达载体的构建和序列分析
目的将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcus enterotoxin A,SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列,即糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl inositol,GPI)附着信号序列,拼接成融合基因,并构建该融合基因的真核表达载体.方法利用基因SOEing法,分别扩增hPLAP-1 C末端信号肽序列和SEA基因,然后将二段基因拼接起来,拼接后与pGEM-T克隆载体连接,再亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,测序鉴定.结果分别成功扩增出hPLAP-1 C末端信号肽序列131 bp和SEA基因789 bp,并将二段基因序列成功拼接(901 bp),且成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/SEA-GPI,经测序是正确的.结论真核表达载体pcDNA3.1(+)/SEA -GPI的构建,为研究SEA -GPI抗肿瘤作用奠定了基础.
关键词： 超抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素A 人胎盘碱性磷酸酶 糖基化磷脂酰肌醇 -
BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒在BALB/c小鼠肌肉表达分析
检测BCR-ABL-pIRES-SEA重组基因疫苗在小鼠肌肉中的表达.用已构建BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒免疫BALB/c小鼠一侧后肢骨骼肌,每两周一次,每次注射200μg,第七周取材用RT-PCR及免疫组织化学染色法检测目的基因在注射部位肌肉中转录和表达.结果发现:实验小鼠骨骼肌内检测到BCR-ABL和金黄色葡萄球菌肠毒素A (SEA)基因的转录,以及BCR-ABL蛋白的表达,证明所构建的BCR-ABL-pIRES-SEA重组质粒在小鼠体内可以有效地表达基因产物.
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树突状细胞的体外培养及其抗癌作用
背景与目的 恶性肿瘤患者免疫力低下,缺乏强有力的抗肿瘤免疫应答,其原因是肿瘤细胞的抗原性较弱,而且抗原提呈细胞的功能低下,使肿瘤抗原不能有效地提呈给淋巴细胞.因此如何能有效地诱导出抗肿瘤免疫效应是一个非常关键的问题.本研究通过建立体外培养树突状细胞(dendritic cells, DC)的方法并观察其诱导的抗肺癌作用的研究,为以DC为基础的肺癌免疫瘤苗的临床应用提供实验依据.方法 3 mol/L氯化钾法提取人肺腺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽;从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中用GMCSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增DC,用流式细胞仪FCM及免疫染色法分析鉴定DC;肺癌肿瘤可溶性抗原(tumorsoluble antigen, TSA)和超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A, SEA)联合修饰致敏DC;以联合抗原修饰后的DC、单纯肺癌抗原TSA致敏的DC、单纯超抗原SEA修饰的DC和未经抗原修饰的DC分别与外周血T淋巴细胞共同孵育,刺激T淋巴细胞活化增殖,诱导产生具有识别肺癌抗原的特异性CTL(作为效应细胞分别称为TSA-SEA-DCL、TSA-DCL、SEA-DCL、DCL);采用MTT法检测各效应细胞对靶细胞GLC-82、肺癌CALU-6和人红白血病K562细胞的抗癌活性;镜下观察DC、效应细胞形态及对靶细胞的杀伤过程.结果 诱导出高表达CD1a、HLADR、CD80具有典型树突状细胞特性的DC;TSA-SEA-DCL对靶细胞GLC-82的杀伤率明显高于TSA-DCL、SEA-DCL及DCL,亦明显高于对K562细胞的杀伤率;与靶细胞共育时镜下发现效应细胞CTL靠近并聚集在肿瘤细胞周围,致使肿瘤细胞发生变性坏死及凋亡.结论 本实验方法能成功诱导出具有典型特征的成熟DC,肺癌TSA联合超抗原SEA诱导的DC疫苗对肺癌细胞有高效特异杀伤作用.
关键词： 树突状细胞 肿瘤可溶性抗原 金黄色葡萄球菌肠毒素A 肺肿瘤 超抗原
