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重组溶瘤腺病毒RCAdC68-EGFP对结肠癌细胞增殖的影响
目的 本实验通过比较重组溶瘤腺病毒RCAdC68-EGFP与复制缺陷型重组腺病毒AdC68-EGFP对结肠癌细胞的杀伤作用,初步观察RCAdC68-EGFP对结肠癌细胞增殖的影响.方法 以不同病毒剂量(100、500、2500、12500vp/cell)感染结肠癌细胞HCT 116、NCI-H508、HT-29及人胚肾细胞HEK-293.感染后第3、5、7天用MTT法检测不同细胞的抑制率,结晶紫染色实验检测细胞的杀伤作用及相差显微镜观察细胞形态学变化和病变情况.结果 RCAdC68-EGFP对结肠癌细胞HCT 116、NCI-H508、HT-29的增殖抑制作用与病毒感染剂量及感染时间成正比,以500vp/cell病毒感染剂量感染细胞7天后,RCAdC68-EGFP对HCT 116、NCI-H508、HT-29、HEK293细胞的抑制率分别为86.70％、96.85％、99.70％、99.99％,AdC68-EGFP的细胞抑制率分别为6.57％、11.46％、9.11％、99.99％,RCAdC68-EGFP与AdC68-EGFP对细胞的增殖抑制作用有统计学差异(P＜0.01),而对HEK-293细胞增殖抑制作用无统计学差异(P＞0.05).结论 RCAdC68-EGFP能显著抑制HCT 116、NCI-H508、HT-29细胞的增殖,初步显示出RCAdC68-EGFP作为溶瘤病毒载体治疗肿瘤的潜能.
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溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究进展
溶瘤腺病毒是一种改造过的能够选择性地在肿瘤细胞中复制,并能够杀死肿瘤细胞的腺病毒,目前已经应用于肿瘤治疗中.但是因为肿瘤的复杂性以及高突变性,所以提高溶瘤腺病毒对肿瘤的有效性,选择性和安全性成为了主要的研究方向.能够在体内正常表达shRNA、细胞因子、自杀基因、基质修饰蛋白等治疗性基因的溶瘤腺病毒具有比单纯的溶瘤腺病毒更强的抗肿瘤活性.而具有肿瘤特异性启动子,尤其是双调控启动子的溶瘤腺病毒对肿瘤细胞具有更强的选择性杀伤作用.另外用脂质体、PEG聚合物、纳米颗粒、多肽等包裹的溶瘤腺病毒能够减少病毒的免疫原性以及对肝脏的毒性,增强了全身给药途径的抗肿瘤活性.特别是用PEG连上抗体、小肽、细胞因子和配体,能显著提高溶瘤腺病毒的选择性.因此,整合病毒载体与非病毒载体的优点并与免疫治疗相结合,是一个很有希望的提高病毒靶向治疗效果的策略.
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溶瘤腺病毒抗肿瘤策略研究进展
溶瘤腺病毒是一类经过基因工程改造,能够选择性地在肿瘤细胞中复制并溶解、杀伤肿瘤细胞的腺病毒,但不影响正常细胞功能.至今,已尝试多种方式提高溶瘤腺病毒的抗肿瘤活性和安全性,包括改变腺病毒传导方式,利用特异性启动子和增强子驱动治疗基因的表达以及协同放化疗、免疫治疗等.
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溶瘤腺病毒ATV联合顺铂协同抑制A549细胞的研究
目的 探讨双特异性溶瘤腺病毒ATV与化疗药物顺铂联用对人肺癌细胞A 549治疗的增效减毒作用. 方法 将构建的溶瘤腺病毒ATV感染A 549细胞后进行Annexin V检测,分析ATV对肿瘤细胞的抑制方式;单用ATV、顺铂以及两者联合作用于人肺癌A 549细胞,采用MTS法检测细胞体外增殖情况,采用划痕试验、Transwell迁移试验和Transwell侵袭试验检测细胞的迁移侵袭情况;构建A 549皮下移植瘤裸鼠模型,单独注射重组腺病毒、顺铂以及重组腺病毒和顺铂联合使用,观察监测肿瘤生长情况,评价溶瘤腺病毒联合顺铂对肿瘤的体内抑制作用. 结果 双特异性重组腺病毒ATV主要通过诱导A 549细胞凋亡达到对细胞的杀伤;ATV联合顺铂体外杀伤A 549细胞具有一定的剂效和时效关系,且其抑制作用显著强于ATV及顺铂单独使用;ATV联合顺铂作用下,可使A 549细胞迁移侵袭能力降低,且能显著抑制小鼠皮下移植瘤生长,延长模型小鼠生存期. 结论 ATV可诱导肿瘤细胞凋亡,ATV与化疗药物顺铂联用可增强对A549细胞生长及迁移侵袭能力的抑制作用,即具有抑制肺癌细胞A 549的增效减毒作用.
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靶向溶瘤腺病毒介导的IL-24对有免疫功能小鼠胰腺癌移植瘤生长的抑制
目的 探讨靶向溶瘤腺病毒介导的IL-24(ZD55-IL-24)对有免疫功能小鼠的胰腺癌移植瘤生长的抑制作用.方法 体外采用结晶紫染色观察ZD55-IL-24.对胰腺癌细胞Panc02的生长抑制作用.体内采用肿瘤生长曲线、成瘤率曲线、TUNEL凋亡检测、细胞毒T淋巴细胞(CTL)杀伤试验和细胞因子检测评价ZD55-IL-24对小鼠胰腺癌的生长抑制作用.结果 ZD55-IL-24体外能抑制胰腺癌细胞生长.体内实验表明,与ZD55-EGFP组或者PBS组比较,ZD55-IL-24组的肿瘤成瘤率低,肿瘤生长速度更慢.ZD55-IL-24不仅能诱导肿瘤细胞凋亡,还能通过诱导CTL杀伤胰腺癌细胞并通过上调血浆γ-IFN和IL-6水平而产生抗肿瘤免疫作用.结论 ZD55-IL-24在有免疫功能的小鼠上能产生抗肿瘤免疫和抑制胰腺癌移植瘤生长.
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携带IL-24的溶瘤腺病毒对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用
目的 构建携带IL-24基因的溶瘤腺病毒CNHK600-IL24,评估该病毒在裸鼠体内对乳腺癌的抑瘤能力.方法 将IL-24基因插入腺病毒穿梭载体SG502-△CR2,与5型腺病毒骨架载体pPE3共转染至293细胞,获得溶瘤腺病毒CNHK600-IL24.建立乳腺癌原位成瘤模型、尾静脉注射及左心室注射模拟转移瘤模型,通过尾静脉注射CNHK600-IL24,应用"活体内光学成像系统"动态地观察病毒的疗效.结果 CNHK600-IL24经测序及PCR鉴定正确,滴度为1.9×1010pfu/ml.乳腺癌原位成瘤模型:对照组的光子数以及肿瘤体积均明显高于CNHK600-IL24各治疗组(P＜0.05).CNHK600-IL24治疗后肿瘤组织出现明显的坏死,肿瘤细胞发生显著的凋亡,免疫组化检测可见肿瘤细胞内Hexon和IL-24的表达.尾静脉注射模拟转移瘤模型:对照组的裸鼠大部分于38 d前死亡,而CNHK600-IL24组的生存天数明显延长(P＜0.05).左心室注射模拟转移瘤模型:活体内光学成像可见对照组与治疗组之间具有明显差别.结论 高滴度的溶瘤腺病毒CNHK600-IL24对于乳腺癌具有明显的抑瘤效果.
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靶向性溶瘤腺病毒对肝癌细胞的特异性杀伤研究
目前颇为看好的一类恶性肿瘤基因治疗方案是溶瘤腺病毒介导的癌细胞裂解疗法.针对肝细胞癌(HCC)的特异性溶瘤腺病毒(带甲胎蛋白启动子)多表现出对AFP阳性HCC细胞的选择性裂解.尽管占总数30%～40%的AFP阴性HCC细胞内仍有痕量的AFP启动子活性[1],但这些HCC特异性溶瘤腺病毒对其均无杀伤作用.
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调控食管癌癌胚抗原基因表达对溶瘤腺病毒H101抗癌作用的影响
目的 研究调控食管癌癌胚抗原(CEA)基因表达对溶瘤腺病毒H101抗癌作用的影响,探讨影响H101敏感性的内在因素.方法 选择CEA低表达的EC9706细胞株(EC9706-SCEA)和CEA过表达的EC9706细胞株(EC9706-CEA)复苏培养,细胞生长实验检测调控EC9706细胞CEA基因表达对细胞生长的影响,通过细胞毒性实验和裸鼠体内实验检测H101对不同CEA表达水平EC9706细胞的杀伤效果.结果 细胞生长实验表明,EC9706-SCEA、EC9706-CEA和EC9706细胞群体倍增时间分别为(30.9±2.0)h、(31.1±2.5)h和(29.1±2.6)h,差异无统计学意义(P＞0.05).细胞毒性实验显示,当感染复数(MOI) ≥0.01 PFU时,H101对EC9706-SCEA细胞的抑制率明显高于EC9706、EC9706-CEA、EC9706-siCon和EC9706 -Con细胞(P＜0.05).不同时间各组裸鼠移植瘤体积测定显示,H101对治疗组裸鼠皮下移植瘤的生长均有抑制作用,但其对EC9706-SCEA治疗组移植瘤生长的抑制作用(抑瘤率为61.5％ ～ 74.5％)显著强于EC9706治疗组(抑瘤率为35.5％ ～44.8％)和EC9706-CEA治疗组(抑瘤率为32.3％～38.5％),差异有统计学意义(p＜0.05).结论 溶瘤病毒H101对EC9706-SCEA细胞的杀伤力明显增强.沉默CEA基因的表达,有望成为提高溶瘤病毒H101抗癌效果的新途径.
关键词： 食管肿瘤 癌胚抗原 溶瘤腺病毒 食管癌细胞系EC9706 裸鼠 -
塞来昔布联合携带白细胞介素24基因的溶瘤腺病毒对人类膀胱尿路上皮癌T24细胞的作用
目的 评估塞来昔布联合携带白细胞介素24(IL-24)基因的溶瘤腺病毒(ZD55-IL-24)对人类膀胱尿路上皮癌T24细胞的选择性杀伤效能.方法 荧光显微镜观察ZD55-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对细胞的转染效率.以人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为对照.RT-PCR法测IL-24 mRNA在细胞中的表达.MTT法测塞来昔布联合ZD55-IL-24对肿瘤细胞选择性抑制作用.流式细胞术检测细胞凋亡情况.结果 ZD55-EGFP感染细胞后,在相同时间下T24细胞中的荧光强度明显高于HUVEC细胞.ZD55-IL-24转染后在相同时间内T24细胞组IL-24 mRNA表达量均高于HUVEC组(t=-12.54,P＜ 0.01).ZD55-IL-24与塞来昔布联合对T24细胞的抑制率高(P＜0.01).T24细胞各组的细胞增殖抑制率也明显高于HUVEC组(F=251.35,P＜ 0.01).联合用药组的T24细胞凋亡率也明显高于单独用药组；T24细胞组凋亡率明显高于HUVEC组(P＜ 0.001).结论 塞来昔布与ZD55-IL-24联合用药能大程度地抑制T24细胞的增殖,而对正常细胞影响轻微.这种抑制作用可能与细胞凋亡有关.
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携带免疫基因的前列腺癌特异性溶瘤腺病毒制备及功能验证
目的制备前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，评价其体外溶瘤和免疫激活功能。方法以LNCaP细胞和Jurkat细胞的cDNA为模板，采用普通PCR和巢式PCR分别扩增获得前列腺特异性抗原（ prostate specific antigen，PSA）基因、CD40L-N 基因和 CD40L-C 基因；并采用重叠 PCR 方法将 PSA、Linker、CD40L-N 和CD40L-C基因依次连接并扩增获得融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L（PL）。采用以Adeasy系统为基础的溶瘤腺病毒构建体系，构建并制备携带PL的溶瘤重组腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。以不同感染复数（multiplicity of infection， MOI）的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞后不同时间点，流式细胞术检测细胞凋亡情况；50 MOI的Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞，于48 h收集其裂解液，并将其作用于正常人外周血单个核细胞，CCK8检测细胞增殖能力。结果 PCR成功扩增并连接获得融合蛋白基因PL，构建并制备了携带PL基因的溶瘤腺病毒Ad-PL-PPT-E1A。 RT-PCR和Western印迹检测结果显示，Ad-PL-PPT-E1A可在PC3M细胞中高效表达E1A和PL蛋白。将Ad-PL-PPT-E1A感染PC3M细胞后，可见明显的细胞病变；同时，流式细胞检测结果显示，当感染滴度达到200 MOI时，48 h的凋亡率达到70．67％±2．98％。 CCK8结果显示，Ad-PL-PPT-E1A感染后，可恢复PC3M细胞裂解液对人外周血单个核细胞的抑制作用。结论成功制备和鉴定了前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒Ad-PL-PPT-E1A，并在体外证实了其具有溶瘤和免疫的双重功能。
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溶瘤腺病毒抗肿瘤策略研究进展
对腺病毒基因组进行改造可以使其特异性杀伤肿瘤细胞而不影响正常细胞，由此构建的溶瘤腺病毒(又称条件复制型腺病毒)(conditionally replicative adenoviruses，CRAds)作为癌症病毒治疗的方法之一已经应用于临床试验。然而病毒溶瘤作用不强限制了其进一步应用，目前多数的研究设计在溶瘤腺病毒内加载治疗基因，以增强其杀伤作用和对肿瘤微环境或免疫系统的调节，同时合理联合已有治疗方法，可提高溶瘤腺病毒抗肿瘤作用。
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溶瘤腺病毒靶向治疗肿瘤干细胞的研究进展
肿瘤干细胞(或肿瘤起始细胞)由于具有很强的肿瘤起始能力和浸润转移能力而成为许多肿瘤中难治性的细胞群体.有研究表明肿瘤干细胞对化疗、放疗抵抗,因此与肿瘤的复发有关.针对肿瘤干细胞治疗策略将会影响肿瘤治疗的成败,已有研究表明溶瘤腺病毒可通过感染的方式杀伤肿瘤干细胞,因此可以克服肿瘤干细胞对药物耐受、对放化疗抵抗的机制;另外,通过基因工程的方法在溶瘤腺病毒的构建过程中增加一些外源性抗肿瘤基因,还可促进溶瘤病毒的特异性和抗肿瘤活性.该文总结溶瘤腺病毒靶向针对肿瘤干细胞的研究进展,以期为今后的临床治疗和应用提供理论基础.
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溶瘤腺病毒治疗膀胱癌进展
溶瘤腺病毒是通过基因工程改变部分生物学特性的腺病毒.因其可以复制、增殖,后裂解膀胱癌细胞而成为治疗膀胱肿瘤新的研究方向.为了使其具有更好的特异性、靶向性和安全性,人们进行了从改变单个基因到改变多个基因又到插入特异性启动子构建不同的溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的研究,虽然还有很多问题有待解决,但已经取得了一定的成果.
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特异性溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的研究进展
溶瘤腺病毒因能够杀伤膀胱癌细胞同时对正常组织几乎没有影响而受到人们的广泛关注，对其进行了多方面的研究，其中特异性启动子调控的溶瘤腺病毒是研究热点。人们通过插入单个或多个特异性启动子构建了治疗膀胱癌的组织特异性溶瘤腺病毒来提高其靶向性、特异性和安全性。现就特异性启动子调控溶瘤腺病毒治疗膀胱癌的原理、研究进展以及存在的问题等方面进行综述。
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间质干细胞荷载溶瘤腺病毒治疗肿瘤进展
溶瘤腺病毒是具有高度的肿瘤靶向性和良好的转染率，但全身应用后机体的免疫防御机制明显限制了溶瘤腺病毒的治疗效果。细胞荷载溶瘤腺病毒可能是克服这一瓶颈的有效策略，间质干细胞对肿瘤细胞有天然的靶向性同时可荷载溶瘤腺病毒提高抗肿瘤效果，本文主要对间质干细胞荷载溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究领域及研究进展进行综述。
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溶瘤腺病毒携带的PUMA基因对人卵巢癌细胞株SKOV3化疗敏感性的影响
目的 探讨溶瘤腺病毒携带的p53上调凋亡调控因子(PUMA)基因(Adp-PUMA)对人卵巢癌细胞株SKOV3化疗敏感性的影响,以探索增加化疗敏感性,降低化疗药物应用剂量的肿瘤治疗新策略.方法 2010年8月至2011年10月在中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所采用MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑,内盐]法测定Adp-PUMA联合化疗药物对人卵巢癌细胞的生长抑制作用,并与单用化疗药物组进行对比.结果 Adp-PUMA与化疗药物顺铂(cDDP)、紫杉醇(TAX)、健择(Gemzer)联合应用后作用于SKOV3细胞,IC50分别由化疗药物单独作用时的8.98、20.59、7.51降低到了1.83、2.87、1.70,且各组合用指数均＜1.此结果表明Adp-PUMA联合化疗药(cDDP,TAX,Gemzer)对卵巢癌细胞的增殖抑制作用具有协同效应,较小剂量的Adp-PUMA能增加卵巢癌化疗敏感性,降低卵巢癌细胞SKOV3对化疗药物的IC50.结论 Adp-PUMA增加了SKOV3对化疗药物的敏感性,与化疗药物联合可降低化疗药物的应用剂量.
关键词： p53上调凋亡调控因子 溶瘤腺病毒 卵巢肿瘤 化疗 -
表达Ki67-siRNA的溶瘤腺病毒抑制人肾癌ACHN细胞Ki67基因表达及增殖研究
目的:研究表达Ki67-siRNA的溶瘤腺病毒(ZD55-Ki67)对肾癌ACHN细胞Ki67基因表达及增殖抑制作用.方法:ZD55-Ki67、溶瘤腺病毒ZD55、表达Ki67-siRNA的增殖缺陷腺病毒Ad-Ki67感染人肾癌ACHN细胞.Western印迹法检测E1A表达;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹、免疫组织细胞化学法检测Ki67表达;原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;MTT法检测细胞存活;结晶紫染色法检测细胞毒作用.结果:感染ZD55-Ki67、ZD55的ACHN细胞表达E1A;抑制Ki67表达作用依次为ZD55-Ki67＞Ad-Ki67＞ZD55.ZD55-Ki67、ZD55、Ad-Ki67感染的ACHN细胞凋亡率(%)分别为(56.3±3.1)、(25.3±2.5)、(37.0±3.0),均显著高于对照组(5.5±2.1)(P＜0.01),每种病毒之间均有显著差异(P＜0.01);存活率(%)分别为(40.9±2.2)、(71.3±6.6)、(86.8±3.1),每种病毒之间均有显著差异(P＜0.01);对ACHN细胞的细胞毒作用ZD55-Ki67＞ZD55＞Ad-Ki67.结论:表达Ki67-siRNA的溶瘤腺病毒具有显著的抑制肾癌ACHN细胞Ki67基因表达、诱导凋亡、杀伤肾癌细胞作用.
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重组腺病毒Ad－HP对胃癌的抑制作用
目的：探讨表达HN蛋白的重组腺病毒Ad－HP在体内外对人胃癌细胞的抑制作用。方法：通过MTS法检测Ad－HP（Ad－HN－PEG3p－E1a）对SGC7901细胞的增殖抑制效果，采用Annexin V染色、Caspase酶活性检测、Western blot 免疫印迹检测揭示Ad－HP对SGC7901细胞的抑制方式和途径。对BALB／c裸鼠进行瘤内注射Ad－HP探究其在体内的抗肿瘤作用。结果：体外实验中Ad－HP明显抑制SGC7901细胞增殖，并表现出时间效应和剂量效应关系。 Ad－HP能提高Caspase酶活性，并释放细胞色素C。体内实验中Ad－HP能显著延缓瘤体生长并延长模型动物的平均生存期，而且能上调IL－2和IFN－γ等细胞因子，使免疫反应朝向Th1优势。结论：Ad－HP可特异性有效抑制胃癌细胞增殖和肿瘤生长。
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携带人TRAIL基因的双靶向溶瘤腺病毒与X线联合抑瘤效应
目的 探讨携带人TRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL,联合X线照射对A549细胞生长的影响.方法 将质粒pPE3-hTRAIL与pSG500用Lipofectamine2000共转染至293细胞内同源重组,包装出的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL,采用PCR法进行鉴定,并在293细胞中大量扩增病毒,采用50％组织培养感染计量法测定病毒滴度,以MOI为5的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL感染A549细胞24 h,用RT-PCR法检测hTRAIL基因在肿瘤细胞中的表达.用小同MOI值(0.01～40)的CNHK500-hTRAIL感染A549细胞,感染5 d,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测其对A549细胞的细胞存活率,以便确定适宜的感染滴度.用CNHK500-hTRAIL感染A549细胞,感染后48 h,用不同剂量的X线(1和2 Gy)照射,照射后3d,通过MTT比色法检测CNHK500-hTRAIL联合X线照射下A549细胞的细胞存活率.结果 PCR法鉴定表明溶瘤腺病毒CNHK500内携带hTRAIL基因,制备的CNHK500-hTRAIL病毒滴度为3.25×109PFU/ml,且CNHK500-hTRAIL携带的hTRAIL基因在A549细胞中有效表达.经不同MOI值CNHK500-hTRAIL感染A549细胞,细胞存活率为64.26％～96.02％.CNHK500-hTRAIL感染联合不同剂量X线照射组细胞存活率较单纯X线照射(1和2 Gy)和单纯CNHK500-hTRAIL感染组明显降低(P＜0.01),细胞存活率分别为50.77％和45.56％,增敏效应比值(E/O)为1.5和1.6,均大于1.4.结论 成功构建了携带hTRAIL基因的溶瘤腺病毒CNHK500-hTRAIL,CNHK500-hTRAIL感染与X射线联合照射对A549细胞生长有协同抑制作用.
关键词： 肺癌 溶瘤腺病毒 肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体 放射治疗 细胞存活率 -
构建一种受hTERT启动子和miR-145双调控的更为安全的新型溶瘤腺病毒
目的:构建一种受人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子和miR-145双调控的更加安全的条件复制型腺病毒.方法:在已构建的hTERT启动子调控早期复制必需基因E1A的条件复制型腺病毒Adzq 11基础上,再将四个拷贝的miR-145的靶序列加入到E1A的3’非翻译区,构建新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T.应用Real-time PCR测定人非小细胞肺癌细胞A549和人胚肺成纤维细胞HLF中miR-145的表达量;然后在这两株细胞中,分别转染Adzq11和Adzq11-145T对应的穿梭质粒及感染病毒本身,用Real-time PCR检测E1A表达量以测定调控效果;用病毒空斑单位法检测两种病毒的复制情况;用CCK8检测对A549和HLF细胞的杀伤作用.结果:构建的新型溶瘤腺病毒Adzq11-145T在HLF中复制量明显低于Adzq11,其E1A mRNA水平和杀伤效应也显著降低.而在A549中,Adzq11-145T在E1A表达、病毒复制和溶瘤能力方面较Adzq11均无显著降低.结论:成功构建出一种新的受转录和转录后水平双重调控的条件复制型腺病毒Adzq11-145T,它比仅加入hTERT启动子调控早期复制必需基因E1A的腺病毒Adzq11更加安全.
