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溶瘤腺病毒治疗实体肿瘤研究进展
溶瘤腺病毒能选择性地在肿瘤细胞内增殖,裂解肿瘤细胞,而对邻近正常细胞几乎无影响,是肿瘤基因治疗的理想载体.通过基因工程改造,溶瘤腺病毒能感染特定类型肿瘤细胞,发挥抗肿瘤效果.然而,实体肿瘤复杂的组织学结构和免疫逃避机制明显限制溶瘤腺病毒的溶瘤效果,无法将肿瘤彻底根除.荷载表达相关结构分子、免疫调节分子的溶瘤腺病毒能靶向肿瘤微环境及提高肿瘤免疫,提高抗肿瘤效果,为溶瘤腺病毒介导的癌症基因疗法提供新平台.
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溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中的作用
溶瘤腺病毒是继手术、放疗、化疗后治疗肿瘤的新式方法,它能特异性识别并感染肿瘤细胞,终导致细胞溶胀而摧毁肿瘤细胞,但无法在正常机体细胞内复制而不具有杀伤作用,理论上具有更高的抗肿瘤效应和更低的副作用.目前溶瘤腺病毒Onxy-015(dl 152)已进入Ⅲ期临床试验,文章就溶瘤腺病毒治疗肿瘤的国内外研究进展进行综述.
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溶瘤腺病毒治疗前列腺癌研究进展
我国前列腺癌发病率呈逐年上升的趋势.早期前列腺癌有治愈可能,但进展期或转移性前列腺癌无法治愈.近年来,具有肿瘤选择性复制并杀伤肿瘤细胞而对正常细胞毒性较低的溶瘤腺病毒治疗前列腺癌的研究有诸多报道,临床前研究已经显示了其强大的溶瘤效果,临床研究也验证了其抗肿瘤效果和安全性,溶瘤腺病毒单独及联合放化疗治疗去势抵抗性前列腺癌的研究显示了一定的疗效.
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膀胱癌溶瘤腺病毒治疗研究进展
膀胱癌是常见的恶性肿瘤,绝大多数为非肌层浸润性膀胱癌.目前,传统的治疗方法仍不能治愈所有膀胱癌患者,膀胱内灌注化疗药物和免疫制剂治疗后失败的膀胱癌缺乏有效的治疗方法.近年来,溶瘤腺病毒治疗肿瘤的研究大量报道,膀胱癌由于给药方便、局部给药不会引起全身毒副作用而成为溶瘤腺病毒治疗的理想癌种.全文综述溶瘤腺病毒膀胱内灌注治疗膀胱癌的研究进展.
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溶瘤腺病毒对肿瘤干细胞的靶向治疗
肿瘤干细胞是肿瘤复发的源泉.溶瘤腺病毒可以选择性地感染并摧毁肿瘤细胞和肿瘤干细胞.文章从溶瘤腺病毒的角度,综述其对肿瘤干细胞的杀伤作用.
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癌胚抗原基因抑制对溶瘤腺病毒H101治疗人食管癌裸鼠皮下移植瘤的影响
目的:观察癌胚抗原(CEA)特异性基因沉默对溶瘤腺病毒H101杀伤食管癌EC9706细胞作用的影响,以探讨影响H101敏感性的内在因素.方法:利用RNA干扰(RNAi)技术,构建针对人食管癌EC9706细胞的CEAsiRNA载体,通过基因转染,在EC9706细胞中建立稳定的CEA基因沉默体系,并以空载体转染和未进行转染的EC9706细胞作对照,建立人食管癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,用H101进行瘤内注射.采用Real Time PC和Western Blot方法检测移植瘤组织中CEA的表达,测量肿瘤体积.结果:降低CEA在mRNA和蛋白质水平的表达,对人食管癌EC9706细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤时间和体积无影响,经H101瘤内注射治疗后,干扰组、空载体组和对照组肿瘤体积分别为(50.16±19.01)、(208.13±72.29)、(219.46±46.56)mm3,干扰组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),而空载体组与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05).论:抑制食管癌EC9706细胞中CEA的表达,可引起H101敏感性增加.
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一氧化氮对组织特异性溶瘤腺病毒转染膀胱肿瘤细胞的影响
目的:研究一氧化氮(NO)对肿瘤组织特异性溶瘤病毒转染过程的影响及对外源基因表达的调节作用.方法:构建组织特异性溶瘤腺病毒,常规培养膀胱肿瘤BIU 87和5637细胞株,以硝普钠作为外源性NO的供体.应用PTIO和L-NMMA分别作为内源性NO的清除剂和诱导型-氧化氮合酶(NOS)的抑制剂.采用Nitrate/Nitrite Assay Kit检测NO和(或)病毒作用前后膀胱肿瘤细胞培养液中的NO水平.应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测NO对重组病毒抗肿瘤细胞增殖的影响；透射电镜观察腺病毒颗粒进入细胞情况和亚细胞结构变化.结果:膀胱肿瘤细胞BIU-87和5637本身培养液中NO水平很低,给予外源性NO供体后NO水平随时间延长而升高.重组病毒Ad-UPⅡE1A能通过E1A基因发挥溶瘤作用.NO能够促进该病毒转染入BIU-87、5637细胞.50 μmol/L和100μmol/L的NO联合Ad-UPⅡE1A 30 MOI作用后能够促进肿瘤细胞的增殖,而200 μmol/L的NO联合重组腺病毒作用后则促进肿瘤细胞的死亡.NO对Ad UPⅡ-E1A的作用具有时间依赖性.透射电镜观察发现,重组病毒Ad-UPⅡ-E1A能够进入并在膀胱肿瘤细胞内复制,而NO能够提高病毒的转染效率并引起肿瘤细胞自吞噬和凋亡.结论:NO能够促进溶瘤腺病毒Ad UPIIE1A转染膀胱肿瘤细胞的效率,但NO因其浓度不同对溶瘤腺病毒的溶瘤效果具有双向调节作用,低剂量的NO能够下调重组病毒E1A的表达从而促进肿瘤细胞增殖,而高剂量的NO通过上调E1A的表达因而发挥溶瘤效应.
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表达可溶性程序性死亡受体1溶瘤腺病毒对B16/F10细胞增殖凋亡的影响及其机制
目的 构建表达可溶性程序性死亡受体1(sPD1)溶瘤腺病毒并研究其对B16/F10细胞增殖凋亡影响及机制.方法 构建表达sPD1溶瘤腺病毒并感染B16/F10细胞株,荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术对比分析病毒复制功能,噻唑蓝(MTT)法检测重组病毒抑制B16/F10生长;注射病毒于B16/F10皮下瘤小鼠模型中,观察肿瘤体积变化,EliSpot技术检测肿瘤浸润淋巴细胞数量.结果 病毒处理B16/F10细胞6、24、36、48、60、72 h后,Ad5处理组病毒拷贝数增加倍数分别是0.99±0.10、1.12±0.05、1.57±0.15、3.59±1.03、6.26±0.74、9.69±1.46;Ad5-sPD1处理组病毒拷贝增加倍数分别是1.00±0.104、0.99±0.08、1.05±0.03、3.56±1.04、6.04±0.38、11.05±1.12,两组比较差异无统计学意义(P=0.754);分别使用不同病毒量,感染复数(MOI)为0、5、10、15、20的病毒处理B16/F10细胞72 h后,Ad5处理组细胞活力为(100.00±6.39)％、(101.60±5.21)％、(98.66±7.31)％、(93.50±4.54)％、(73.16±2.45)％;Ad5-sPD1处理组细胞活力为(100.00±6.38)％、(97.10±6.37)％、(96.96±7.44)％、(95.67±7.46)％、(74.49±4.14)％,两组比较差异无统计学意义(P=0.779);Mock(无病毒感染)、Ad5和Ad5-sPD1病毒治疗B16/F10皮下瘤小鼠模型,实验终止时,肿瘤体积分别是(3 638±1.823)、(2603±336)、(1 097±532)cm3,差异有统计学意义(Mock和Ad5:P=0.044,Mock和Ad5-sPD1:P=0.000,Ad5和Ad5-sPD1:P=0.000).Mock、Ad5和Ad5-sPD1病毒分别注射小鼠模型,5d后,γ-干扰素(IFN-γ)斑点数分别是19.4±7.75、149.8±25.18、314±32.34,各组间差异有统计学意义(Mock和Ad5:P=0.000,Mock和Ad5-sPD1:P=0.000,Ad5和Ad5-sPD-1:P =0.000).结论 表达sPD1溶瘤腺病毒通过阻断免疫抑制通路,增加肿瘤特异性淋巴细胞浸润,提高溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用,抑制肿瘤生长.
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含有人端粒酶反转录酶的溶瘤腺病毒Ad11联合异环磷酰胺对人骨肉瘤细胞的杀伤作用及其机制
目的 探讨溶瘤腺病毒Ad11联合异环磷酰胺对入骨肉瘤细胞的杀伤作用及机制.方法 体外培养人骨肉瘤细胞株MG63,采用细胞毒性检测法(MTS法)检测Ad11的50％大效应浓度(EC50)和异环磷酰胺的25％抑制浓度(IC25)和50％抑制浓度(IC50).使用MTS法分别检测对照组、Ad11组[转染复数(MOI)=5]、异环磷酰胺组1(IC25=15 μmol/ml)、异环磷酰胺组2(IC50=25 μmol/ml)、联合组1(Ad11 +IC25)、联合组2(Ad11+ IC50)的细胞活性.Western blot技术检测对照组和实验组的自噬相关蛋白Beclin-1和LC3A/B的表达.结果 MTS实验显示Ad11处理骨肉瘤细胞,其EC50值为5.26 MOI,联合异环磷酰胺后对骨肉瘤细胞MG63具有协同杀伤作用.Western blot结果显示Ad11联合异环磷酰胺处理细胞时,异环磷酰胺引起的细胞自噬作用受到抑制.结论 Ad11对骨肉瘤细胞株MG63具有杀伤作用,联合异环磷酰胺时杀伤作用增强,该协同作用可能是由于Ad11减弱了MG63细胞的保护性自噬作用.
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携带人肝细胞生长因子第一结构域基因溶瘤腺病毒的构建及其对胃癌细胞的杀伤作用
目的 构建携带具有抗肿瘤细胞和抗血管生成作用的人肝细胞生长因子第一结构域(HGFK1)基因的肿瘤特异性启动子调控的溶瘤腺病毒,研究其对胃癌细胞选择性杀伤作用.方法以人端粒酶反转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)分别调控溶瘤腺病毒复制必要的E1a和E1b基因,基因组插入HGFK1基因,构建HGFK1溶瘤腺病毒(TH-Ad-HGFK1-EGFP)和无HGFK1溶瘤腺病毒(TH-Ad-EGFP),空斑计数法滴定病毒浓度;病毒分为3组:实验A组(TH-Ad-HGFK1-EGFP)、实验B组(TH-Ad-EGFP)和对照C组(Ad-EGFP),分别感染胃癌细胞SGC7901和正常人成纤维细胞(HF);半数细胞培养物感染量法(TCID50)检测病毒扩增倍数;噻唑蓝(MTT)法检测病毒杀伤抑制作用;双重荧光染色检测病毒促凋亡作用.结果 溶瘤腺病毒TH-Ad-HGFK1-EGFP、TH-Ad-EGFP经测序及聚合酶链反应(PCR)鉴定确认构建成功,滴度都为2×1010pfu/ml;病毒扩增结果显示:A、B组病毒在SGC7901细胞中的扩增倍数分别为1.47×104、1.60×104倍,远大于对照C组病毒,在HF细胞中为110倍和124倍,远小于对照C组病毒;MTT结果显示:当感染复数(MOI)=100时,A组病毒对SGC7901细胞72、96h后的抑制率为(71.34±8.27)%、(74.56±1.78)%,B组为(30.58±3.83)%、(31.84±6.62)%,C组为(23.40±2.29)%、(21.18±2.32)%.A组与B组两时间点分别比较差异有统计学意义(P=0.002、P=0.003),A组与C组分别比较差异有统计学意义(P=0.003、P=0.000).A、B组病毒对HF细胞在96h后的抑制率为(18.94±0.88)%、(22.84±3.34)%,C组为(53.25±3.50)%,A、B两组与C组分别比较差异有统计学意义(P=0.003、P=0.001);凋亡结果显示:A组SGC7901细胞的凋亡率为(18.66±4.04)%,远高于其余各组.结论 溶瘤腺病毒TH-Ad-HGFK1-EGFP能在胃癌细胞SGC7901中复制增殖并对其有杀伤抑制、促凋亡作用.
关键词： 胃癌 人肝细胞生长因子第一结构域 溶瘤腺病毒 SGC7901 -
溶瘤腺病毒ZD55-特异性核基质结合区结合蛋白1对裸鼠前列腺癌DU145细胞移植瘤的治疗作用
目的 观察携带特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)基因短发卡RNA (shRNA)的溶瘤腺病毒ZD55-SATB1对裸鼠前列腺癌DU145细胞移植瘤的治疗作用.方法 构建前列腺癌DU145细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,将裸鼠随机分成4组,每组8只,分别用ZD55-SATB1、ZD55-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、Ad-SATB1、磷酸盐缓冲液(PBS)进行瘤内注射治疗,每次病毒100μ1(5×108 pfu),隔天1次,共3次.每周测量肿瘤体积,绘制肿瘤时间-体积生长曲线,治疗第49天将裸鼠全部处死,免疫组织化学检测SATB1基因表达水平,取肺脏组织苏木素-伊红(HE)染色检测肿瘤转移.原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测肿瘤组织细胞的凋亡.结果 成功构建前列腺癌DU145细胞裸鼠皮下移植瘤模型.ZD55-SATB1组肿瘤体积为(295.3 ±51.9) mm3,与ZD55-EGFP组(525.6±89.3) mm3 (P=0.017)、Ad-SATB1组(582.3 ±97.0) mm3 (P=0.010)和PBS组(777.1±139.8)mm3 (P =0.009)比较,差异有统计学意义.肺组织HE染色显示:PBS组全部出现肺转移,ZD55-EGFP组2只出现转移,而ZD55-SATB1和Ad-SATB1组则无转移.TUNEL显示:ZD55-SATB1组凋亡率为(87.3±4.8)％,ZD55-EGFP组为(51.2±3.4)％(P=0.013),Ad-SATB1组为(41.3±3.2)％(P=0.010),PBS组为(20.1±1.9)％(P=0.009),ZD55-SATB1组凋亡率显著增高,差异有统计学意义.免疫组织化学法显示:SATB1在ZD55-SATB1、ZD55-EGFP、Ad-SATB1和PBS组吸光度值分别为13.8±1.2、81.1±7.3(P=0.010),26.9±2.4(P =0.025)和88.3 ±7.8(P =0.009),与对照组间比较,差异均有统计学意义.结论 ZD55-SATB1可有效抑制人前列腺癌裸鼠移植瘤的生长和转移、促进其凋亡.
关键词： 溶瘤腺病毒 特异性核基质结合区结合蛋白1 前列腺癌 -
溶瘤腺病毒ZD55-特异性核基质结合区结合蛋白1对雄激素非依赖前列腺癌细胞DU145增殖和侵袭的影响
目的 观察携带特异性核基质结合区结合蛋白1(SATB1)基因短发卡RNA (shRNA)的溶瘤腺病毒ZD55-SATB1对雄激素非依赖前列腺癌细胞DU145增殖和侵袭的影响.方法 同源重组法包装溶瘤腺病毒ZD55-SATB1;转染倍数(MOI)=10.0的病毒感染DU145细胞72 h后,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测ZD55-SATB1对前列腺癌细胞SATB1基因的mRNA表达的影响;Western blot检测ZD55-SATB1对前列腺癌细胞SATB1蛋白表达的影响及病毒复制能力;结晶紫染色法、细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测ZD55-SATB1对细胞的增殖抑制和毒性作用;细胞侵袭试验检测细胞侵袭力改变.结果 成功包装病毒ZD55-SATB1;RT-PCR和Western blot结果显示:ZD55-SATB1组SATB1表达量明显减少,与对照组比较差异有统计学意义.E1A蛋白表达水平在前列腺癌细胞DU145显著高于人正常前列腺上皮细胞PZ-HPV-7,差异有统计学意义,表明ZD55-SATB1具有肿瘤靶向性;结晶紫染色示:ZD55-SATB1组DU145有明显的细胞病效应.CCK-8结果显示:细胞感染后4d,ZD55-SATB1组细胞存活率为(31.60±3.31)％,显著低于ZD55-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)组(61.70 ±2.42)％ (P=0.025)和Ad-SATB1组(82.40±3.54)％(P=0.017),差异有统计学意义.Transwell细胞侵袭实验结果显示:ZD55-SATB1组侵袭细胞数为(61.30±17.25)个,显著低于Ad-SATB1组[(170.10 ±25.44)个,P=0.043],ZD55-EGFP组[(295.40±23.36)个,P=0.013]和磷酸盐缓冲液(PBS)组[(490.50 ±33.36)个,JP=0.009],与对照组比较差异有统计学意义.结论 携带SATB1基因shRNA的溶瘤腺病毒ZD55-SATB1可有效沉默前列腺癌细胞DU145中SATB1基因的表达,同时有效抑制DU145细胞的增殖和侵袭.
关键词： 溶瘤腺病毒 特异性核基质结合区结合蛋白1 增殖 侵袭 -
携带肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体基因的溶瘤腺病毒联合表柔比星对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响
目的 观察携带肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)基因的溶瘤腺病毒(ZD55-TRAIL)联合表柔比星(EPB)对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响.方法 将转染倍数(MOI)=10.0的ZD55-TRAIL联合1 mg/L的EPB、MOI=10.0的ZD55-TRAIL、1 mg/L的EPB、MOI=10.0的ZD55-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和磷酸盐缓冲液(PBS)分别作用于膀胱癌T24细胞.反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测TRAIL基因mRNA的表达;Western blot法检测腺病毒TRAIL蛋白的表达;细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞存活率;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)法检测细胞凋亡.结果 RT-PCR结果示:ZD55-TRAIL成功的将TRAIL基因转入到膀胱癌细胞中,并且ZD55-TRAIL联合EPB组和ZD55-TRAIL组mRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05).Western blot结果表明ZD55-TRAIL联合EPB作用的T24细胞能高效表达TRAIL.CCK-8法检测结果表明干预4d后,MOI=10.0的ZD55-TRAIL+1 mg/L EPB细胞存活率为(18.44±2.38)％,与对应剂量的ZD55-TRAIL (40.75±4.12)％、EPB(53.62±1.41)％、ZD55-EGFP(61.65 ±4.53)％比较,差异有统计学意义(P＜0.01).单独使用EPB在2d要达到与联合治疗(MOI=10.0的ZD55-TRAIL+1 mg/L EPB)相同的效果,其浓度需达到2 mg/L;在3d则需更高的浓度4 mg/L.细胞凋亡检测结果ZD55-TRAIL联合EPB组晚期凋亡细胞数目分别为ZD55-TRAIL、EPB、ZD55-EGFP的2.01、2.21、2.95倍,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 携带TRAIL基因的溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL联合化疗药物EPB对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡有协同作用.
关键词： 溶瘤腺病毒 肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体 表柔比星 -
荷载肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体基因的溶瘤腺病毒联合吉西他滨对裸鼠人膀胱癌T24细胞移植瘤的抑制作用
目的 观察荷载肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体基因的溶瘤腺病毒ZD55-肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体(TRAIL)联合吉西他滨(Gemcitabine)对膀胱癌T24细胞移植瘤的抑制作用.方法 T24细胞以2×106个(0.2 ml)接种于裸鼠右腋皮下,建立裸鼠膀胱癌T24细胞移植瘤模型,分别给予ZD55-TRAIL[转染倍数(MOI)=10]联合Gemcitabine(4.0g/L)、ZD55-TRAIL(MOI=10)、Gemcitabine(4.0 g/L)、磷酸盐缓冲液(PBS)各10μl连续瘤体内注射3d.每周测量裸鼠肿瘤生长体积,免疫组织化学法检测T24细胞移植瘤组织TRAIL、早期区1A基因(E1A)蛋白表达,原位末端标记法(TUNEL)检测移植瘤细胞凋亡.结果 ZD55-TRAIL联合Gemcitabine能显著抑制肿瘤的生长,干预9周后ZD55-TRAIL联合Gemcitabine、ZD55-TRAIL、Gemcitabine、PBS处理组肿瘤平均体积分别为(129.0±8.3)、(1760.6±83.3)、(1 129.3±73.2)、(2 501.0±221.8) mm3,各组差异有统计学意义(P＜0.01).免疫组织化学表明,ZD55-TRAIL联合Gemcitabine高效表达TRAIL、E1A蛋白.TUNEL表明:ZD55-TRAIL联合Gemcitabine、ZD55-TRAIL、Gemcitabine、PBS处理组细胞凋亡率分别为(85.8±5.6)％、(61.4±3.8)％、(44.0±3.8)％、(15.8±3.2)％,表明ZD55-TRAIL联合Gemcitabine能有效诱导肿瘤细胞凋亡.结论 ZD55-TRAIL联合Gemcitabine可协同抑制膀胱癌T24细胞移植瘤的生长.
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携带人黑色素瘤分化相关基因-7/白细胞介素-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24和干扰素联合治疗裸鼠肝癌
目的 利用携带人黑色素瘤分化相关基因(MDA)-7/白细胞介素(IL)-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24与干扰素(IFN)联合治疗肝癌裸鼠移植瘤.方法 构建携带人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24,单独使用该病毒或IFN以及两者联合治疗裸鼠肝癌模型,观察其抗肿瘤效应.结果 成功构建携带人MDA-7/IL-24基因的溶瘤腺病毒SG600-IL24载体,SG600-IL24+IFN联合治疗组裸鼠平均生存时间为(111.20±2.60)d,与其他3组[对照组为(35.20±1.53)d,IFN组为(67.60±2.10)d,SG600-IL24组为(59.20±1.16)d]比较生存期明显延长(P＜0.01),且有3例生存时间超过120 d,达到长期生存；SG600-IL24+ IFN组裸鼠肝癌体积也明显小于SG600-IL24组或IFN组(P＜0.01).结论 溶瘤腺病毒SG600-IL24联合IFN对裸鼠人肝癌移植瘤模型有协同抗肿瘤作用.
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双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用
目的 构建双调控溶瘤腺病毒,携带小鼠内皮抑素基因(mE),研究其对裸鼠肝癌移植瘤的抗瘤活性.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)调控腺病毒E1a和E1b基因,基因组插入mE基因,构建双调控溶瘤腺病毒CNHK500-mE；在裸鼠模型中观察CNHK500-mE对肝癌移植瘤模型的疗效.结果 CNHK500能够在hTERT阳性的肝癌细胞中增殖[24 h:(16.67±4.04)％；48 h:(65.33 ±7.02)％;P＜0.01],并介导mE高效表达；与空白对照组( 1895.80±323.37) mm3比较,CNHK500-mE和Ad-mE的抑瘤率分别为50.95％[(929.80±211.10) mm3,P＜0.01]和29.99％[(1327.23 ±319.36) mm3,p＜0.05]；CNHK500-mE对癌组织间质血管的抑制作用明显强于Ad -mE(P ＜0.05).结论 将mE与溶瘤腺病毒结合,发挥病毒增殖的溶瘤作用和基因产物的血管抑制作用,表现出明显的协同抗瘤作用.
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表达金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控溶瘤腺病毒载体的构建、鉴定及其抗膀胱肿瘤作用
目的 构建表达超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的高靶向、双调控选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA,并探讨其潜在的抗膀胱肿瘤作用.方法 将超抗原SEA基因片段经SpeⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆入经同样酶切后的非增殖溶瘤腺病毒载体pSG218中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pDC318-SEA.同样方法将超抗原SEA基因片段克隆入双调控特异性增殖溶瘤腺病毒载体pSG502中,将鉴定正确的腺病毒载体命名为pSG502-SEA.将以上两种携带SEA基因的病毒载体与病毒骨架质粒PPE3-ccdB共转染293细胞,9～14 d出现病毒空斑,经过3次病毒空斑纯化,提取腺病毒DNA,应用PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒分别命名为DC318-SEA和SG502-SEA.大量扩增后,氯化铯梯度离心纯化腺病毒,测病毒滴度.结果 经PCR及酶切鉴定,SEA基因成功克隆到两病毒载体中,可以表达SEA基因,且病毒滴度为2.5 × 1010pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的双调控、高靶向选择增殖型溶瘤腺病毒SG502-SEA及对照组携带超抗原SEA基因的非增殖溶瘤腺病毒DC318-SEA.
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表达端粒酶逆转录酶siRNA的溶瘤腺病毒对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用
目的 观察表达针对端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(hTERT siRNA)的溶瘤腺病毒(ZD55-hTERT)抑制肾癌移植瘤生长作用.方法 荷肾癌裸鼠随机分4组,每组8只.瘤体内分别注射ZD55-hTERT、增殖缺陷型腺病毒(Ad-hTERT)、溶瘤腺病毒ZD55-EGFP及磷酸盐缓冲液(PBS),每次注射病毒7×108pfu/只,连续注射3 d.注射后第7天,每组处死3只取肿瘤组织,免疫组织化学检测肿瘤hTERT、E1A表达及凋亡.第50天时处死动物测量肿瘤体积.结果 ZD55-hTERT、Ad-hTERT、ZD55-EGFP及PBS处理组肿瘤体积(mm3)分别为:124.1±27.5、609.0±102.5、499.8±77.1、1552.1±206.4,ZD55-hTERT处理组与各组之间差异有统计学意义(P<0.01).Ad-hTERT处理组肿瘤无E1A表达,ZD55-hTERT处理组E1A大量表达,表明病毒复制.ZD55-hTERT处理组肿瘤hTERT表达显著低于Ad-hTERT处理组,凋亡细胞阳性率均显著高于Ad-hTERT处理组.结论 表达hTERT siRNA的溶瘤腺病毒ZD55-hTERT具有更强的抑制肾癌生长作用.
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携带超抗原SEA基因的特异性溶瘤腺病毒载体的构建和鉴定
目的 构建携带超抗原SEA基因的肿瘤特异性溶瘤腺病毒表达载体.方法 采用聚合酶链反应(PCR)技术,从产SEA的葡萄球菌标准菌株ATCC13565基因组DNA中获得SEA全长基因序列,酶切后克隆入pCA13质粒,构建重组病毒质粒pCA13-SEA.将鉴定正确的pCA13-SEA与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3通过Lipofectamine 2000共转染HEK293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-SEA.Ad-SEA在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化、测定其滴度.结果 克隆得到771bpSEA全长基因.经PCR扩增、酶切鉴定、序列测定证实,SEA基因成功克隆到溶瘤腺病毒载体中,可实现SEA基因的表达,且病毒滴度达6.5×109pfu/ml.结论 成功构建表达超抗原SEA基因的溶瘤腺病毒载体.
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表达白细胞介素-18的溶瘤腺病毒对裸鼠肾癌移植瘤的治疗作用
目的 观察表达IL-18的溶瘤腺病毒(ZD55-IL18)对裸鼠肾癌移植瘤生长及血管形成的抑制作用.方法 荷肾癌裸鼠随机分4组,每组8只.瘤体内注射ZD55-IL18、溶瘤腺病毒ZD55-EGFP、表达IL-18的增殖缺陷腺病毒Ad-IL18及PBS,每次注射病毒7×108PFU/只,连续注射3 d.注射后第7天,每组处死3只取肿瘤组织,免疫组织化学检测肿瘤E1A、IL-18、CD34、VEGF表达及凋亡.第50天时处死动物测量肿瘤体积.结果 ZD55-IL18、ZD55-EGFP、Ad-IL18及生理盐水处理组肿瘤体积(mm3)分别为:299.7±52.9、536.8±90.3、570.3±99.0、766.1±145.8,ZD55-IL18与各组之间差异有统计学意义(P<0.01).Ad-IL18处理组肿瘤无E1A蛋白表达,ZD55-IL18处理组有大量E1A蛋白表达,表明病毒复制.ZD55-IL18处理组肿瘤IL-18表达及凋亡细胞阳性率均显著高于Ad-IL18处理组.ZD55-IL18处理组肿瘤CD34、VEGF表达均显著低于Ad-IL18处理组.结论 表达IL-18的溶瘤腺病毒ZD55-IL18比增殖缺陷腺病毒Ad-IL18具有更强的抑制肾癌生长及血管形成作用.
