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三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究
目的 检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域.方法 采用重叠区扩增基因拼接法构建三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量.结果 激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上.CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC50分别为33.18、32.84、33.45、34.29 μmol·L-1,与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC50为33.96 μmol·L-1)无显著差异,均高于空载体转染对照组(IC50为19.01μmol·L-1).转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC50为19.95 μmol·L-1,与空载体对照组无显著差异,显著低于野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组.原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失三磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致.结论 成功构建了5个三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上.突变体(除胞外第6环外)仍然具有一定的抗砷性,提示三磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域.
关键词： 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 突变体 重叠区扩增基因拼接法 抗砷性 第2跨膜结构域 -
应用SOEing方法构建SOD1-G93A的真核表达载体
目的：构建铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase, SOD1）-G93A的真核表达载体。方法应用重叠区扩增基因拼接法（SOEing）分别扩增前段M1基因与包含突变位点的后段M2基因，然后将2段基因拼接起来，得到SOD1-G93A基因，并克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体上。结果成功扩增出SOD1-G93A基因，测序结果与GenBank完全一致；对重组质粒SOD1-G93A-pcDNA3.1(-)进行双酶切鉴定，测序结果与预期完全一致。结论成功构建了SOD1-G93A-pcDNA3.1(-)真核表达载体。
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重叠区扩增基因拼接法拼接hIL-2信号肽基因和CVB3的VP1基因
目的:将hIL-2信号肽基因拼接到CVB3 VP1基因的5'端,以获得分泌型VP1(sVP1)基因.方法:采用重叠区扩增基因拼接法.结果:凝胶电泳见到预期大小DNA条带,经测序表明基因序列与报导的hIL-2信号肽及CVB3 VP1的基因序列一致.结论:成功获得了融合基因sVP1.
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HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒的构建及鉴定与表达
目的:应用重叠区扩增基因拼接法(gene SOEing)获得HBV X-HCV C融合基因,构建HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒.方法:应用gene SOEing法扩增HBV X-HCV C融合基因并将其克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-XC,经PmeⅠ酶切线性化后电转化BJ/AdEasy菌,构建重组腺病毒质粒pAd-XC;鉴定正确的pAd-XC经Pac Ⅰ酶切线性化后脂质体法转染293细胞进行包装,扩增,利用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)监测病毒滴度和感染效率,Western-blot法检测目的蛋白的表达.结果:测序结果显示,pAdTrack-CMV-XC构建成功;PCR及PacⅠ酶切鉴定结果表明pAd-XC构建成功;经Pac Ⅰ酶切线性化的pAd-XC转染293细胞后24 h即可观察到GFP的表达;回收的病毒可重复感染293细胞,Western-blot法检测到目的蛋白的表达,证实有感染能力且可表达目的蛋白的病毒颗粒包装成功.结论:HBV X-HCV C融合基因重组腺病毒构建成功,为进一步研究HBV X蛋白和HCV C蛋白的生物学功能奠定了基础.
关键词： HBVX基因 HCVC基因 融合基因 重叠区扩增基因拼接法 腺病毒 -
乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及特异片段的制备
目的 制备HBV基因分型芯片模板.方法 通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变.结果 在所选位点上成功引入点突变.结论 SOEing法是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型检测基因所需的模板DNA.
关键词： 重叠区扩增基因拼接法 乙型肝炎病毒 基因分型 -
C型乙型肝炎病毒基因SOEing法引入228位点突变
目的 为获取乙型肝炎病毒(HBV)基因分型芯片病毒靶序列,对C型HBV第228位碱基进行点突变.方法 通过不同基因型HBV全基因组的序列比对分析,显示基因型A,C,D,G在228位上的碱基为G,而基因型B,E,F,H为A,所以检测该位点的碱基类型可以实现HBV基因型的初步分型.结果 将C型乙肝病毒第228位上的单位碱基由G突变为A,经测序后证明突变成功.结论 重叠区扩增基因拼接法(SOEing)是一种简便引入点突变的方法 ,可以应用此法制备HBV基因分型芯片检测基因片段序列.
关键词： 乙型肝炎病毒 基因分型 重叠区扩增基因拼接法 -
重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定共刺激分子融合基因上的应用
目的将小鼠共刺激分子B7-1(mB7-1)基因的胞外区与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列进行拼接,探讨其形成融合基因的作用.方法利用重叠区扩增基因拼接法,分别扩增hPLAP-1 C末端信号肽序列和mB7-1基因的胞外区序列,然后将二段基因拼接起来,拼接后与pGEM-T克隆载体连接,酶切和测序鉴定.结果分别成功扩增出hPLAP-1 C末端信号肽序列155 bp和mB7-1基因的胞外区序列764 bp,并将二段基因序列成功拼接(891 bp),经测序是正确的.结论重叠区扩增基因拼接法能拼接mB7-1基因的胞外区与hPLAP-1C末端信号肽序列,能形成融合基因.
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重叠区扩增基因拼接法在构建膜锚定金黄色葡萄球菌肠毒素A融合基因上的应用
目的:将超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA)基因与人胎盘碱性磷酸酶(hPLAP-1)C末端信号肽序列进行拼接,形成融合基因.方法:利用重叠区扩增基因拼接法,分别扩增hPLAP-1 C末端信号肽序列和SEA基因序列.然后,将二段基因拼接并与pGEM-T克隆载体连接,酶切和测序鉴定.结果:成功扩增出hPLAP-1 C末端信号肽序列131 bp和SEA基因序列796 bp;经测序证实,二段基因序列成功拼接(901 bp).结论:重叠区扩增基因拼接法能将SEA基因与hPLAP-1C末端信号肽序列拼接,形成融合基因.
关键词： 金黄色葡萄球菌肠毒素A 碱性磷酸酶 重叠区扩增基因拼接法 -
用改进的重叠区扩增基因拼接法构建中间缺失突变体
目的构建缺失第325～373位氨基酸密码子的磷脂酸磷酸化激酶β(phosphatidylinositol 4-kinase beta,PI4K-β)基因,以探索一种简便的构建中间缺失突变体的方法. 方法应用重叠区扩增基因拼接法的原理,在拼接延伸后,再进行一次PCR扩增,得到缺失第325～373位氨基酸密码子的PI4K-β基因,克隆至pCMV-Tag4A真核表达载体. 结果成功地构建出缺失第325～373位氨基酸密码子的PI4K-β突变体. 结论这种改进的重叠区扩增基因拼接法可以有效而可靠地构建中间缺失突变体, 具有推广价值.
关键词： 重叠区扩增基因拼接法 中间缺失突变体 克隆
