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三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第二跨膜结构域缺失突变体的构建及其抗砷性研究
目的 检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)蛋白第2跨膜结构域(the second transmembrane domain,TMD2)中关键的抗砷结构域.方法 采用重叠区扩增基因拼接法构建三磷酸腺苷结合盒转运体A1基因TMD2的一系列缺失突变体,分别转染至HeLa细胞,激光共聚焦观察其定位,Cell Counting Kit-8检测48 h急性砷中毒后生存率的变化,原子荧光吸收光谱法检测细胞内的总砷含量.结果 激光共聚焦证实各突变体的编码蛋白均定位在HeLa细胞的细胞膜上.CCK-8结果显示,转染胞外第4、5环,胞内第4、5环缺失突变体的HeLa细胞IC50分别为33.18、32.84、33.45、34.29 μmol·L-1,与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒的HeLa细胞(IC50为33.96 μmol·L-1)无显著差异,均高于空载体转染对照组(IC50为19.01μmol·L-1).转染胞外第6环缺失突变体HeLa细胞的IC50为19.95 μmol·L-1,与空载体对照组无显著差异,显著低于野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1质粒转染组.原子荧光分光光度法结果显示,转染胞外第6环缺失三磷酸腺苷结合盒转运体A1的HeLa细胞内砷含量与转染空载体接近,而转染其他突变体的结果与转染野生型三磷酸腺苷结合盒转运体A1的结果基本一致.结论 成功构建了5个三磷酸腺苷结合盒转运体A1蛋白第2跨膜结构域的缺失突变体,且其表达的蛋白仍然正确定位于HeLa细胞的细胞膜上.突变体(除胞外第6环外)仍然具有一定的抗砷性,提示三磷酸腺苷结合盒转运体A1胞外第6环可能是关键抗砷结构域.
关键词： 三磷酸腺苷结合盒转运体A1 突变体 重叠区扩增基因拼接法 抗砷性 第2跨膜结构域 -
硫氧还蛋白还原酶2基因抗砷作用
目的 研究硫氧还蛋白还原酶2(thioredoxin reductase,TrxR2)基因在抗砷细胞(As-ECV304)中的抗砷作用.方法 蛋白印迹法(Western Blot)检测As-ECV304和对照组细胞TrxR2蛋白水平,流式细胞仪检测细胞周期分布,化学合成TrxR2基因小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染As-ECV304细胞,Western Blot验证干扰效率,细胞急性毒性试验检测细胞抗砷性的改变.结果 As-ECV304细胞中TrxR2蛋白水平较对照组细胞高,As-ECV304细胞G0/G1期细胞所占比例高于对照细胞.3个siRNA中有一个能特异性抑制TrxR2基因表达,干扰组细胞的生存率低于阴性对照组和未干扰组,3组细胞的半数抑制率IC50>分别为9.13,15.88和18.52 μmol/L.结论 siRNA干扰TrxR2基因表达后能明显降低抗砷细胞的抗砷性,提示该基因在细胞抗砷机制中发挥了重要作用.
关键词： RNA干扰 硫氧还蛋白还原酶2(TrxR2) 抗砷性 -
ARG1基因对人胚肾细胞293砷染毒前后增殖及凋亡的影响
目的:观察ARG1基因对不同浓度的亚砷酸钠(NaAsO2)染毒后的293细胞的增殖及凋亡的影响,并讨论ARG1的抗砷性.方法:将ARG1表达质粒pcDNA3.1-ARG1及空载体对照质粒pcDNA3.1分别经阳离子脂质(Lipofectamine2000)介导转染293细胞后,荧光共聚焦显微镜观察细胞转染率;将实验组pcDNA3.1.ARG1-293细胞、空白对照组pcDNA3.1-293细胞及阴性对照组293细胞用不同浓度的NaAsO2浓度染毒48h后,使用MTT法检测ARG1基因对砷染毒后293细胞的增殖的影响;将实验组、空白对照纽及阴性对照组按不同浓度NaAsO2染毒,加入Annexin V FITC/PI凋亡试剂,采用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果:(1)荧光共聚焦显微镜观察转染结果显示转染率可达75-85%;(2)NaAsO2在1-8 μ mol/L时其对实验组细胞增值的抑制率明显低于对照组,而在浓度>8μ mol/L时则没有明显差异;(3)实验组细胞在NaAsO2浓度<8 μ mol/L其凋亡率明显低于对照组.结论:ARG1能够降低NaAsO2对293细胞增值的抑制率,减轻其对293细胞的促凋亡作用,主要是在低浓度时发挥作用.
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三磷酸腺苷结合盒转运子A1在真核细胞中的表达及对细胞抗砷性的影响
目的 研究含有三磷酸腺苷结合盒转运子A1(ABCA1)基因的真核表达载体pcDNA3.1/ABCA1转染真核细胞后,在细胞中的表达及对细胞抗砷性的影响.方法 由脂质体介导将pcDNA3.1/ABCA1重组质粒转染入人HeLa细胞中(转染重组质粒组),同时设转染空质粒组及未转染组作为对照,用实时定量PCR法检测各组细胞ABCA1 mRNA表达水平,用蛋白免疫印记法(Western blot)检测ABCA1蛋白的表达.转染48 h后,以不同剂量[0(对照)、4、8、16、32、64、128 μmol/L]亚砷酸钠(NaAsO2)染毒,用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞生存率.结果 转染重组质粒组、转染空质粒组及未转染组ABCA1 mRNA表达量分别为(2.09±0.08)×10-4、(0.09±0.02)×10-4、(0.08±0.02)×10-4,组间比较差异有统计学意义(F=1499.23,P<0.01),其中转染重组质粒组ABCA1 mRNA表达量高于转染空质粒组和未转染组(P均<0.01).转染重组质粒组、转染空质粒组及未转染组在相对分子质量(Mr)为254 × 103处均有特异性蛋白条带,其大小与ABCA1蛋白大小相符,且转染重组质粒组蛋白表达量明显高于转染空质粒组及未转染组.在NaAsO2剂量为4、8、16、32、64、128μmol/L时,转染重组质粒组细胞生存率[(94.8±0.9)%、(86.5±2.6)%、(77.8±2.0)%、(56.0±2.0)%、(23.8±1.7)%、(18.6±0.6)%]均高于转染空质粒组[(85.3±1.1)%、(78.7±0.6)%、(67.8±2.4)%、(43.2±1.5)%、(14.5±1.3)%、(8.0±0.4)%],二者比较差异有统计学意义(t值分别为18.985、6.689、5.922、9.504、9.481、32.634,P均<0.01).结论 ABCA1基因经转染后在HeLa细胞中呈现高表达状态,并使HeLa细胞对砷的耐受性提高.
关键词： 三磷酸腺苷结合盒转运子A1 质粒 转染 真核细胞 抗砷性 -
人骨髓间充质干细胞抗砷性的获得
目的低剂量NaAsO2诱导骨髓MSCs,获得抗御细胞以探讨抗砷机制.方法用1 μmol NaAsO2对骨髓MSCs进行低剂量慢性诱导,利用MTT计算细胞生存率及半数致死量(LC50),反映细胞抗砷性是否产生.结果NaAsO2诱导18周后,人骨髓MSCs产生稳定抗砷性,砷诱导组细胞LC50为25.8 μmol,同步对照组细胞LC50为11.4 μmol,砷诱导组细胞LC50是同步对照组细胞LG50的2.2倍.结论低剂量NaAsO2长期诱导人骨髓MSCs,可使细胞获得抗砷性.
