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单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌液相芯片检测方法的建立
目的 是建立一种快速检测单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的液相芯片检测方法.采用基于间接竞争法的原理,将3种细菌抗原分别与不同的聚苯乙烯微球偶联,以藻红蛋白(PE)荧光标记二抗为信号,优化反应条件,对建立的方法进行灵敏度、特异性和可重复性验证.结果显示,3种细菌检测抗体佳加入量分别为10ng、10ng、5ng,建立的方法检测单增李斯特菌、副溶血弧菌和沙门氏菌的低检测限均可达到103 CFU/mL,检测其他常见食源性致病菌无交叉反应.结论表明,建立了一种快速检测食品中金黄色葡萄球菌的液相芯片检测方法,能够应用于实际样品的检测.
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8种重大烈性传染病病毒液相芯片检测方法的建立
目的 建立基于多重PCR技术结合液相芯片技术同时检测汉坦病毒(HTV)、裂谷热病毒(RVFV)、黄热病毒(YFV)、西尼罗病毒(WNV)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV)、拉沙热[下同]病毒(LFV)、埃博拉病毒(EBV)和马尔堡病毒(MBV)的方法.方法 建立8种病毒同时扩增的多重PCR反应体系,分别用各种病毒特异的核酸探针偶联不同编码的微球,将获得的PCR产物与偶联核酸探针的微球混合物进行杂交,建立液相芯片检测方法,并对建立的液相芯片检测方法进行灵敏度及特异性检测评价.结果 建立的8种重大烈性传染病病毒的液相芯片筛查方法具有较高的特异性和敏感性,能对8种病毒进行特异的检测.灵敏性实验结果表明,RVFV为10ng/PCR、WNV为1 ng/PCR、EBV为10ng/PCR、CCHFV为10 pg/PCR、MBV为1 ng/PCR、HTV为100 pg/PCR、LFV为1ng/PCR、YFV为10 pg/PCR.结论 本研究建立的病毒液相芯片筛查方法能快速、敏感、特异地同时检测8种重大烈性传染病病毒,对口岸入境人员是否携带重大烈性传染病病毒的快速筛查具有广阔的应用前景.
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四种重要生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法的建立
[目的]建立包括蓖麻毒素B(Ricin toxion B,RTB)、肉毒梭菌毒素A(Clostri botulinum toxin A,CBTA)、金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)及产气荚膜毒素ε(Clostridium perfringens toxin ε,CPTε)在内的4种重要生物恐怖因子的多重液相芯片检测方法.[方法]采用双抗夹心法原理和液相芯片技术平台,通过优化偶联抗体浓度和检测抗体浓度以及抗原抗体佳孵育时间,建立4种生物恐怖因子液相芯片多重检测方法.[结果]反应条件优化实验结果表明,RTB、CBTA、SEA和CPTε偶联抗体的佳用量分别为20 μg、40μg、80 μg、80μg; RTB、CBTA、SEA和CPTε检测抗体的佳稀释比分别为1:5000、1:1000、1:2000、1:4000:4种毒素抗原抗体佳孵育时间为60min.多重检测结果表明,本研究建立的毒素液相芯片多重检测方法可有效检测上述任意1种毒素、任意2种毒素组合、任意3种毒素组合并能同时检测4种毒素.灵敏度检测结果表明,RTB、CBTA、SEA、CPTε检测灵敏度分别为1 ng/ml、10 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml.[结论]本研究建立的4种常见生物恐怖毒素液相芯片多重检测方法通过1次检测能同时检测RTB、CBTA、SEA、CPTε,是一种准确、灵敏、快速和高通量的检测方法.
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两种出血热病毒新型液相芯片检测体系的建立
目的 建立两种出血热生物恐怖病毒(马尔堡病毒、埃博拉病毒)的新型液相芯片检测方法.方法针对马尔堡病毒、扎伊尔埃博拉病毒的特异性基因序列设计2对引物和相应的TSPE引物.经多重PCR扩增之后、加入连有TAG的TSPE引物特异性识别靶目标,标记有生物素的dCTP加入到延伸序列中,TAG与微球上的anti-TAG互补,SAPE与生物素反应,SAPE发射荧光信号,信号由液相芯片仪器检测.结果液相芯片检测体系能够正确的鉴定和检测两种出血热病毒,特异性强、灵敏度高,可用于病毒的高通量筛查.结论建立了多重PCR基因液相芯片快速检测两种出血热病毒的新方法.
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新型液相芯片复合检测5种鼠传病原体方法的建立
目的 建立一种能同时检测5种鼠传病原体:流行性出血热病毒(Epidemic hemorrhagic fever,EHF)、斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi,TY1)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis,YP)、恙虫病立克次体(Rickettsia tsutsugamushi,RST)、钩端螺旋体(Leptospira,Lep)的液相芯片多重检测方法；方法 针对5种病原的全基因组序列,分别设计特异性引物,并将上游引物5'端分别偶联一些特定的核酸片段作为标签(TAG),下游引物5’端标记生物素,PCR扩增后产物与微球进行杂交,后利用液相芯片检测系统分析结果.结果 建立的方法能同时完成对5种病原体Bio-plex100病原体及其中任何1种的检测,特异性好,灵敏度低可达3 fg/test.结论 通过利用偶联有TAG及生物素的引物对,成功建立了可同时检测5种鼠传病原的液相芯片检测方法,具有较高的灵敏度和特异性.该方法对于鼠传病原体的检测具有较好的应用前景.
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液相芯片检测3种发热伴出疹病毒方法的建立
目的 建立一种能同时检测发热伴出疹症候群中的肠道病毒71(EV71)、柯萨奇病毒A组16(CA16)和麻疹病毒(MV)的高通量液相芯片检测方法.方法 针对EV71、CA16和MV全基因组序列,分别设计特异性引物和探针,经多重PCR扩增并用生物素标记相应的基因片段,建立EV71、CA16和MV高通量核酸液相芯片检测方法.并对该方法灵敏度、特异度进行验证.结果 液相芯片检测方法对EV71、CA16和MV的检测结果与多重PCR的检测结果一致.该方法能同时完成对其中任何1种及3种病毒的检测,特异性好,灵敏度低可达2.14 pg/μl.结论 该方法用于3种发热伴出疹症候群病毒的检测具有较高的灵敏度和特异性,可用于EV71、CA16和MV的实验室检测.
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基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法的建立
目的 建立基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒核酸液相芯片检测方法.方法 建立探针偶联至荧光微球、多重PCR扩增方法、杂交检测方法,并对所建立的液相芯片检测方法的灵敏度和特异性进行评价.结果 建立的液相芯片检测方法能对基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒中的任意1种、任意2种或者3种同时进行筛查检测,基孔肯亚热病毒检测的灵敏度为1×104 copies/PCR,克里米亚-刚果出血热病毒检测的灵敏度为1×105copies/PCR,裂谷热病毒检测的灵敏度为1×103 copies/PCR.该方法对汉坦病毒、埃博拉病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、马尔堡病毒的检测结果均为阴性.结论该方法具有高通量、多重检测、快速、敏感、特异的特点,为基孔肯亚热、克里米亚-刚果出血热、裂谷热病毒的筛查检测提供一种新方法.
关键词： 基孔肯亚热病毒 克里米亚-刚果出血热病毒 裂谷热病毒 液相芯片 检测 -
液相芯片技术在传染病快速诊断中的应用
液相芯片是20世纪90年代中期发展起来的被喻为后基因组时代的新型芯片技术,液相芯片以其特异、灵敏及高通量等特点已在传染病快速诊断中得到广泛应用.本文详细介绍了其原理、优点,并对该技术在传染病病原体筛查方面的应用进展作一综述.表明其可用作蛋白质和核酸等生物分子的高通量检测平台.
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液相蛋白芯片法与BAS-ELISA法检测病原抗体的方法比较
[目的]分别建立流感病毒、禽流感病毒、鼠疫耶尔森菌、SARS病毒、结核分支杆菌等发热病原抗体的液相蛋白芯片定量检测方法,比较液相蛋白芯片方法与生物紊-亲和素系统(BAS-ELISA)方法的检测能力.[方法]用诊断抗原包被编码微球,应用间接法检测模式,建立液相蛋白芯片定量检测病原抗体的方法,用液相蛋白芯片和BAS-ELISA方法检测相当样品并进行比较分析.[结果]建立的液相蛋白芯片分别检测流感、禽流感、鼠疫、SARS、结核特异性抗体,低检测限分别为5.68ng/ml、1.50ng/ml、50.30pg/ml、105.57pg/ml、14.06pg/ml.液相蛋白芯片方法和BSA-ELISA方法的检测性能,在一定浓度范围内,对于相同样品2种方法有很好的相关性.[结论]与BAS-ELISA方法相比,液相蛋白芯片检测灵敏度高,动态范围宽,为同时检测多种病原抗体、任意组合检测目标物提供了平台.
关键词： 液相芯片 生物素-亲和素系统-ELISA 病原抗体 检测 比较 -
液态芯片技术及其应用
液态芯片(liquid array)或液相芯片(liquid chip)也称悬浮芯片(suspension array),是20世纪70年代美国Luminex公司研制出的新一代生物芯片技术,利用带编码的微球体作为载体,流式细胞技术作为检测平台,对核酸、蛋白质等生物分子进行大规模测定.
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悬浮芯片技术在生物医学领域中的应用
Luminex悬浮芯片技术是美国Luminex公司在20世纪90年代中期开发的一种多功能的液相芯片分析平台,也称xMAP (flexible multiple-analyte profiling)、多功能悬浮点阵(multi-analyte suspension arrays,MASA)或液体芯片(liquidchip).它有机地整合了有色微球(color-coded microspheresor beads)、激光技术、新的高速数字信号处理和计算机技术,集中了分子生物学、免疫学、高分子化学、激光物理学、微流体学和计算机科学等多门学科,使得Luminex悬浮芯片技术的检测特异度和灵敏度得到了前所未有的发展.
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液相芯片技术检测痰湿体质人群TNF-α、IL-6、CRP及MCP-1的表达研究
目的 应用液相芯片技术研究20~50岁痰湿体质及平和体质人群外周血血清炎症因子--肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)及单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的表达变化及其与肥胖的关系.方法 选择2011年4-12月北京普仁医院体检中心体检人群101名.以体重指数(BMI)为依据,将研究对象分为痰湿体质肥胖组(OBT,BMI≥24 kg/m2)30 例,痰湿体质非肥胖组(NOBT,BMI<24 kg/m2)25例,肥胖非痰湿体质组(OBNT,BMI≥24 kg/m2)28 例以及平和体质组(P,BMI<24 kg/m2)18例.比较各组BMI及体脂肪率(FAT%);采用液相芯片法测定各组血清TNF-α、IL-6、CRP及MCP-1水平.结果 OBT和OBNT组BMI显著高于NOBT及P组,差异有统计学意义(P <0.05);OBT和OBNT组体FAT%高于P组,差异均有统计学意义(P <0.01).OBT组血清TNF-α高于P组,差异有统计学意义(P <0.01);OBT、OBNT组及NOBT体质组血清CRP及MCP-1含量均高于P组,差异有统计学意义(P <0.05,P <0.01);痰湿体质评分与TNF-α、IL-6及MCP-1呈正相关(P <0.05).结论 20～50 岁痰湿体质人群存在炎症因子异常,且痰湿体质人群和肥胖人群均存在慢性低度炎症状态.
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星形细胞瘤和髓母细胞瘤患儿血清IL-6、IL-8和MIP-1α水平变化
目的 研究星形细胞瘤和髓母细胞瘤患儿血清IL-6、IL-8和MIP-1α含量变化及临床意义.方法 应用Luminex 200多功能液相芯片分析仪检测54例健康儿童和55例星形细胞瘤、46例髓母细胞瘤患儿血清IL-6、IL-8和MIP-1α浓度.结果 两肿瘤组血清IL-6、IL-8、MIP-1α浓度均显著高于正常对照组(均P＜0.01),而且星形细胞瘤组IL-6水平显著高于髓母细胞瘤组(P＜0.01),两组患儿血清中三种细胞因子浓度两两正相关(均P＜0.01).男、女患儿间比较,星形细胞瘤组只有IL-6水平差异具有统计学意义(P＜0.05)；髓母细胞瘤组IL-6、MIP-1a水平差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 血清IL-6、IL-8和MIP-1α浓度变化与儿童恶性脑肿瘤的发生密切相关,三种因子彼此间协同发挥作用.
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肠道病毒71感染手足口病患者27种细胞因子的研究
目的 基于液相芯片分析平台,揭示EV71感染手足口病患者细胞因子表达水平与病情严重程度的关系.方法 收集济南市2009-2014年43例EV71感染手足口病患者血清,其中16例为轻症患者、27例为重症患者,同时随机选取10例健康人群血清作为对照组.利用Bio-plex液相芯片平台检测分析血清中27种细胞因子表达水平.结果 EV71感染手足口病患者重症组血清中22种细胞因子表达水平较对照组有不同程度升高(P＜0.02),包括IL-1 ra、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-15、IL-17、etotaxin、G-CSF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、PDGF-BB、MIP-1β、RANTES和TN F-α;轻症组血清中21种细胞因子表达水平较对照组显著升高(P＜0.02).GM-CSF在重症组和轻症组表达水平均较对照组明显降低(P＜0.02).等级相关分析显示12种细胞因子表达水平与病情严重程度呈中度正相关(IL-1 ra、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17、etotaxin、IP-10、PDGF-BB、MIP-1β、RANTES和TNF-α),GM-CSF与病情程度呈中度负相关.结论 济南市EV71感染手足口病患者血清中多种细胞因子表达水平在病情发展过程中发生显著变化,并与病情严重程度密切相关.液相芯片为手足口病细胞因子研究提供了一种高效平台.
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Luminex XMAP液相芯片技术检测人乳头瘤病毒基因型的应用评价
目的 评价Luminex XMAP液相芯片技术在HPV感染检测中的临床价值.方法 取宫颈组织标本231份和正常宫颈脱落细胞33份,采用液相芯片技术和杂交捕获Ⅱ(HC Ⅱ)对所有标本进行HPV DNA检测.比较两种方法检测结果,对不一致标本及HPV单一型感染标本进行基因测序.结果 两种方法检测结果一致性极好(Kappa=0.8889).根据液相芯片检测结果,HPV检出率为82.95%,不同基因型感染率从高到低依次为:HPV 16、52、58、18、11、31、6、39、33、56、70.其中117份单一型感染,102份多重感染.高危型感染占87.43%,低危型12.57%.以组织病理学为确诊标准,液相芯片和HCⅡ检测CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌HPV DNA的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别依次为:93.07%、87.88%、98.17%、64.44%和94.81%、87.88%、98.21%、70.73%.所有液相芯片检出的单一型经基因测序验证准确率为98.29%.结论 所选宫颈病变患者HPV感染的常见型别是16、52、58、18、11、31、6.Luminex XMAP液相芯片技术是HPV分型检测及大规模筛查的理想方法.
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7种非洲多发病毒病基于荧光微球的多元核酸检测方法的建立与初步评价
目的 建立非洲地区较为高发的7种重要病毒病基于荧光微球的多重核酸检测方法完成初步的评价分析.方法 比较分析引起裂谷热、黄热,马尔堡,埃博拉、拉沙热、克里米亚-刚果出血热和基孔肯雅热等病原体的基因组序列,结合前期实时荧光PCR检测方法,设计合成特异性多重扩增引物和杂交探针,建立基于荧光微球的核酸检测方法,采用化学合成DNA和体外转录RNA等方法制备相关病原体模拟样本和参考品,评价检测方法的灵敏度和稳定性,利用30份登革热、汉城出血热等疑似患者标本和32份正常人血标本评价特异性.结果 所建立的基于荧光微球的针对7种非洲多发病毒病核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102 ～105拷贝/μl,特异性为100％,组内变异系数均在12％以下,组间变异系数在15％以下,具有较高的稳定性.结论 初步建立了基于荧光微球的7种非洲多发病毒病核酸检测方法,为相关疑似传染病筛查提供了新的选择.
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应用 Luminex xMAP 液相芯片技术研究miRNAs 对 THP-1细胞产生细胞因子的影响
目的：研究let-7e单独作用或miR-106b和miR-20a共同作用对THP-1细胞产生细胞因子的影响。方法用Cy3标记的miRNA阴性对照瞬转THP-1细胞24 h、36 h和48 h，免疫荧光法检测其转染效率；let-7e、miR-106b及miR-20a mimic分别瞬转THP-1细胞24 h、36 h和48 h，qRT-PCR检测各miRNA表达量并筛选各miRNA的佳转染时间；1 mg／L LPS刺激各miRNA转染的THP-1细胞1 h后，Luminex xMAP液相芯片技术检测THP-1细胞产生的IL-8、干扰素诱导蛋白-10（ IP-10）、单核细胞趋化蛋白-1（ MCP-1）、IL-1α、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-α和 IFN-β，并进行差异性分析。结果转染后90％以上的THP-1细胞带有红色荧光；let-7e mimic的佳转染时间是48 h，miR-106b及miR-20a mimic的佳转染时间是24 h；相对于各自的对照组，let-7e mimic组IL-8、IP-10和MCP-1表达量增加，而在miR-106b和miR-20a mimic共转染组各趋化因子表达量减少。结论 let-7e促进THP-1细胞中IL-8、IP-10和MCP-1的表达，miR-106b和miR-20a共同抑制它们的表达。
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液相芯片法检测终末期肾病患者胞外Th1/Th2细胞因子与促炎细胞因子
目的 探讨终末期肾脏病(ESRD)忠者胞外Th1/Th2细胞因子的状况和临床意义.方法 选取12例ESRD患者为实验组,12例健康人为对照组,运用液相芯片技术(SA)测定各实验组血清中Th1/Th2和促炎因子的水平,同时用酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量检测细胞因子白细胞介素-8(IL-8)的水平.通过用ELISA和液相芯片法同时检测IL-8的相关性来评估液相芯片法的稳定性和准确性.结果 ESRD患者血液透析前IL-10水平与对照组相比有所上升;血液透析后IL-1β水平与对照组相比降低;而血液透析前后肿瘤坏死因子-β(TNF-β)和IL-β水平均降低.ESRD患者血液透析后IL-1β、IL-4、IL-8和IL-10水平与血液透析前相比均有下降.在检测IL-8时,液相芯片法和ELISA表现出显著的相关性(P<0.001,r=0.946).结论 血液透析后ESRD患者体内存在着细胞因子的变化,即Th2细胞因子IL-10上升而Th1细胞因子TNF-β和促炎因子IL-8降低.血液透析影响ESRD患者的细胞因子谱.
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Luminex液相芯片技术检测与胰岛素抵抗相关的脂肪细胞因子水平在妊娠期糖耐量受损孕妇中的相关性研究
目的 研究汉族妇女血清中的与胰岛素抵抗相关脂肪细胞因子水平,并且比较在妊娠期正常血糖水平组和糖耐量受损组中的水平差异.方法 采用Luminex液相芯片技术对IL-6、TNF-α、瘦素、MCP-1等脂肪细胞因子在共80例孕妇血清中的表达水平进行检测,并进行差异性检测.结果 瘦素水平在2组中具有显著性差异(P＜0.01),其他各细胞因子则无明显区别(P＞0.05).结论 血清瘦素水平与妊娠期糖耐量受损(GIGT)密切相关,如果改善血清瘦素水平,提高胰岛素敏感性,将对GIGT的防治有重要的临床意义.而IL-6、TNF α、MCP-1等细胞因子水平与GIGT则无关,其与GIGT的关系需要进一步的研究.
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胃癌患者血清多种细胞因子联合检测的临床意义
目的 探讨胃癌患者血清中各细胞因子表达及其与临床特征间的关系.方法 运用高通量液相芯片技术对46例胃癌术前患者(胃癌组)和30名健康人(对照组)血清中ITAC、Fractalkine、白细胞介素8(IL-8)、IL-17A、IL-7、肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达水平进行检测,以中位数(四分位数间距)表示.探讨各种细胞因子之间的相关性,并分析各个细胞因子与胃癌患者临床特征之间的关系.结果 胃癌组与健康对照组比较,血清中ITAC、Fractalkine、IL-8、IL-17A、IL-7、TNF-α表达水平升高,两组间各指标中位数(四分位数间距)比较差异均具有统计学意义[22.26 pg/ml(32.83 pg/ml)比11.95 pg/ml(9.99 pg/ml) ,P=0.001;62.21 pg/ml(82.23 pg/ml)比26.47 pg/ml(50.87 pg/ml),P=0.050;4.50 pg/ml(10.38 pg/ml)比2.06 pg/ml(3.17 pg/ml) ,P=0.002;0.83 pg/ml(2.01 pg/ml)比0.21 pg/ml (0.85 pg/ml),P=0.013;3.46 pg/ml(1.90 pg/ml)比2.11 pg/ml(1.48 pg/ml),P=0.001;1.21 pg/ml(1.13 pg/ml)比0.79 pg/ml(0.37 pg/ml),P＜0.001].各细胞因子表达之间具有相关性(均P＜ 0.05).胃癌有无淋巴结转移患者血清中各细胞因子表达水平差异无统计学意义(均P＞ 0.05).结论 ITAC、Fractalkine、IL-8、IL-17A、IL-7、TNF-α的高表达可能与胃癌的发生、发展有关.血清中高水平IL-8可能是预后不良的指标.各细胞因子之间的相互作用、相互影响与肿瘤的发生有着一定的关系.
