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荧光微球分析技术及其应用
荧光微球分析技术是近年来化学材料科学活跃发展的产物,各种大小(0.02～10 μm)可产生荧光和色彩的人工微球应运而生,目前各种材料人工合成、多种颜色和规格的荧光微球有2大类,一种是表面不带修饰基团的微球,另一种是携带各种化学修饰基团,包括羧基化修饰、氨基修饰、巯基或醛巯基修饰等的微球.
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液态生物芯片技术及其应用
目前,在核酸和蛋白质研究领域出现了一种全新的、称之为悬浮式点阵(suspension array)的检测手段和技术,该技术在很大程度上依赖近在光电转换和数字信号处理的进步,通过一束激光识别高分子(如聚苯乙烯)微球所产生的特异性荧光,另一束激光识别微球表面发生生物学反应后所产生的荧光信号,荧光编码不同的微球来实现检测指标的分类,进而实现高通量生物样品的分析;而通过生物学反应所产生的荧光信号可以实现分析的特异性.目前,这种基于荧光编码微球的高通量分析技术可提供快速、敏感、对一个样品进行至多可达100个分析指标的检测.分析荧光微球的速度高可达5000个/秒.应用时,把对应不同检测物的乳胶颗粒混合后再加入微量样品,在悬液中与微球进行特异性结合.结合的结果可以在瞬间经激光判定后由电脑数据信息的形式记录下来.因为分子杂交是在悬浮溶液中进行,检测速度快,所以又有"液态生物芯片"之称.
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荧光微球免疫层析技术定量检测降钙素原方法的建立及性能评估
目的 建立一种能够定量检测人降钙素原的荧光微球免疫层析方法,用于诊断细菌感染,并对试纸条进行性能评估.方法 采用荧光微球标记技术与免疫层析技术相结合的方式,依据双抗体夹心原理,制备降钙素原荧光微球免疫层析试纸条;并从灵敏度、特异性、抗干扰性、精密度、回收率、稳定性以及与Roche试剂盒的符合率等方面进行全面的方法学评价.结果 试纸条的灵敏度为0.05 ng/mL;具有高的特异性和抗干扰性;批间和批内变异系数均<10.93%;回收率在95%~105%;试剂盒的有效期>12个月;且与Roche降钙素原试剂盒(电化学发光法)的相关性良好,回归方程为Y=0.8709X+0.8549,r=0.9519.结论 PCT荧光微球免疫层析试纸条能够实现定量、灵敏、准确检测,满足临床检测PCT的需求.
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7种非洲多发病毒病基于荧光微球的多元核酸检测方法的建立与初步评价
目的 建立非洲地区较为高发的7种重要病毒病基于荧光微球的多重核酸检测方法完成初步的评价分析.方法 比较分析引起裂谷热、黄热,马尔堡,埃博拉、拉沙热、克里米亚-刚果出血热和基孔肯雅热等病原体的基因组序列,结合前期实时荧光PCR检测方法,设计合成特异性多重扩增引物和杂交探针,建立基于荧光微球的核酸检测方法,采用化学合成DNA和体外转录RNA等方法制备相关病原体模拟样本和参考品,评价检测方法的灵敏度和稳定性,利用30份登革热、汉城出血热等疑似患者标本和32份正常人血标本评价特异性.结果 所建立的基于荧光微球的针对7种非洲多发病毒病核酸检测方法可特异性检出相应病原体核酸,检测限可达102 ～105拷贝/μl,特异性为100％,组内变异系数均在12％以下,组间变异系数在15％以下,具有较高的稳定性.结论 初步建立了基于荧光微球的7种非洲多发病毒病核酸检测方法,为相关疑似传染病筛查提供了新的选择.
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慢性乙型肝炎患者外周血CD14+细胞的功能状态
目的:研究慢性乙型肝炎患者外周血CD14+细胞早期活化抗原分子表达、炎症因子生成和吞噬能力.方法:采用四色荧光分析方法,运用流式细胞术检测正常对照人群(10例)、慢性活动性乙型肝炎患者(11例)外周血单个核细胞(PBMC)CD14+细胞率和CD14抗原量;并行CD14设门,检测CD14+细胞前向角(FSC)、侧向角(SSC)值、细胞早期活化抗原(CD69)的表达率、TNF-α表达率、细胞内TNF-α水平、细胞吞噬率及吞噬力.结果:HB组CD14+细胞SSC值高于对照组(P＜0.01);HB组和对照组间外周血CD14+细胞比例、CD14抗原水平无统计学意义差别,抗原水平与CD14+细胞率呈正相关;HB组CD14/CD69双表达细胞明显多于对照组(P＜0.01);HB组CD14/TNF-α+(细胞内)双染细胞与对照组间无差别,HB组CD14+细胞TNF-α水平高于正常对照组(P＜0.05);对照组TNF-α+细胞率与细胞颗粒度呈正相关,与CD14/69双表达并发生吞噬细胞率一致.HB组CD69/CD14双阳性细胞荧光球吞噬率与对照组无差别(P＞0.05);HBV组CD14+细胞荧光球吞噬率显著高于对照组(P＜0.01),吞噬力低于对照组(P＜0.05),荧光微球吞噬率与CD14抗原表达的量负相关;CD14+细胞SSC,TNF-α+细胞率同CD14抗原表达的量也呈负相关.结论:慢性乙肝患者外周血存在过度活化CD14+单核细胞,细胞吞噬力弱、胞内TNF-α生成增多.
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混凝沉淀法富集分离水中隐孢子虫卵囊的实验研究
目的 建立混凝沉淀富集回收水中隐孢子虫卵囊的方法.方法 以4 μm荧光微球为研究对象,采用混凝沉淀试验,通过正交设计筛选出佳混凝剂[聚合氯化铝(PAC)、水溶性壳聚糖(WSC)、1 mol/L的NaOH溶液用量]的配方,并观察不同pH值(6～9)、浑浊度(0～15 NTU)和水温(5～15℃)对回收率的影响.结果 确定了佳混凝配方,聚合氯化铝浓度为80 mg/L,壳聚糖浓度为30 mg/L,1 mol/L氢氧化钠溶液用量为0.6 ml.当pH值在6～9范围内,回收率均在86％以上；当水温在5～25 c℃范围内,回收率在55％以上；当浑浊度为0～15 NTU范围内,回收率均在90％以上.且回收率均随着pH值、水温和浑浊度的升高而上升.向实际水样投加隐孢子虫,采用混凝沉淀法与EPA1623法进行富集比较,差异无统计学意义.结论 该方法能够高效富集回收水中的隐孢子虫卵囊,并对实验条件要求较低,适用于一般实验室对水中隐孢子虫卵囊的检测.
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水产品中无色孔雀石绿的悬液芯片检测方法研究
目的 建立水产品中无色孔雀石绿(LMG)的悬液芯片检测法.方法 向聚苯乙烯微球中加入14μg/100μl的LMG抗原,利用碳二亚胺法使抗原与微球偶联构成捕获抗原.加入含LMG的样品,使用1∶800倍稀释的LMG单克隆抗体及藻红蛋白标记的二抗,37℃孵育1h后在悬液芯片仪上检测平均荧光强度值并计算样品中LMG的含量.结果 在10～100ng/ml的线性范围内,所得体系的回归方程为△F=2 035.6c+22.4,r=0.999 8.方法的检出限为0.125 ng/ml,加标回收率在88.7％～93.6％之间,RSD为3.2％～7.6％.结论 该方法的灵敏度高,特异性好,可作为一种高通量检测的新技术用于水产品中无色孔雀石绿残留的分析.
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荧光微球在生物检测中的应用研究进展
荧光微球是随着化学材料的发展而出现的一种新型功能材料,因其具有比表面积大、吸附性强、凝集作用大和表面反应能力强等特性,而在许多领域尤其是生物医学领域被广泛应用.文章简要介绍了荧光微球在微生物、蛋白质、基因及生物小分子检测方面的应用进展.
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流式荧光微球技术的应用现状及进展
流式荧光微球技术是一种新的高通量检测技术,该技术是以荧光编码微球作为传统免疫学测定、亲和力测定及DNA杂交测定的固相载体,通过流式细胞仪进行检测的新的可用于高通量筛查的多路测定法.通过使用不同荧光编码的微米大小的聚合微球,流式荧光微球技术可以同时分析复杂样品中的多种分析物.每一种微球表面被修饰使其与相应的待测抗原、抗体或寡核苷酸反应,将不同微球混合即可进行多重复合测定.该技术结合了荧光编码微球的特异性与流式细胞仪的高度敏感性.作为一个技术分析平台,流式荧光微球技术在科研及临床应用中将具有重要的潜力.就其应用现状及进展作一综述.
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聚苯乙烯荧光微球的制备及性能考察
目的 制备—种应用于流式细胞术的绝对计数试剂.方法 以乙醇为分散介质,聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,PVP)为分散剂,偶氮二异丁腈(azodiisobutyronitrile)为引发剂,采用分散聚合法,制备聚苯乙烯(polystyrene,PS)微球.以三氯甲烷和异丙醇为溶胀剂,吖啶橙(acridine orange,AO)和罗丹明101(rhodamine 101,R101)为荧光素,通过溶剂逐渐挥发法对PS微球染色.结果 制备了粒径范围在1 ～5 μm的单分散PS微球,染色后的微球在荧光显微镜下可观察到被激发出红、绿、蓝等多种颜色的荧光.结论 制备的PS荧光微球荧光发射光谱宽,能满足流式细胞仪对不同荧光微球的检测.
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兔免疫球蛋白液相悬浮芯片的制备及制备条件的优化
目的:制备兔的免疫球蛋白液相悬浮芯片并对其制备条件进行优化,为进一步建立兔免疫球蛋白液相悬浮芯片检测技术提供基础.方法:分别将亲和纯化的兔IgG、IgM和IgA偶联至荧光编码微球,然后优化捕获抗体的偶联量、检测抗体、Streptavidin-PE抗体的佳工作浓度以及微球-血清反应时间、检测抗体反应时间和Streptavidin-PE抗体反应时间等因素,建立兔IgG、IgM和IgA液相悬浮芯片.结果:1.25×106个荧光微球的佳偶联抗体浓度分别为10 μg IgG、20 μg IgM和15 μg IgA;biotin 标记的IgG、IgM和IgA检测抗体佳工作浓度分别为2、2 和5 μg/ml;IgG、IgM和IgA的佳Streptavidin- PE抗体浓度均为2 μg/ml;微球-血清、血清-检测抗体及Streptavidin- PE抗体佳反应时间分别为60、60和30分钟.结论:制备荧光编码微球兔免疫球蛋白悬浮芯片是可行的方法.
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荧光免疫层析定量检测髓过氧化物酶方法的建立
目的:通过荧光免疫层析技术初步建立MPO荧光免疫层析定量检测方法.方法:采用羧基荧光微球,利用EDC一步法偶联标记抗体,对过程中EDC量、标记蛋白量与标记时间、保护液进行研究,选出佳条件,并对线性范围、灵敏度、精密性等进行性能评价.结果:确定偶联过程中EDC 160 μg,标记蛋白125μg、标记1.5h;线性范围3.125～600 ng/ml,低检出限0.9 ng/ml;精密性质控品(高、中、低)批内、批间变异系数均小于10％;通过与国外试剂盒(ELISA法)检测比对45份临床血清,相关性良好,R2=0.979 5.结论:成功建立荧光免疫层析快速定量检测MPO的方法,为冠心病的辅助诊断提供一种技术手段.
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流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的方法学探讨
目的：探讨利用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞吞噬荧光微球能力试验方法的灵敏性、稳定性以及易操作性，以期获得一套优化的方案。方法：取ICR小鼠腹腔巨噬细胞，以原液和1∶1稀释液使用，采用三个微球浓度（5×106/孔、1×107/孔和1.5×107/孔），经1 h、1.5 h和2 h孵育，通过酶消化或细胞刮刀法将贴壁细胞消化处理后，利用流式细胞仪检测含不同数量荧光微球的巨噬细胞数值，计算吞噬率及吞噬指数。为验证实验条件的可靠性，取ICR小鼠每日灌胃金葵素胶囊30 d后，取腹腔巨噬细胞分别用流式细胞术和传统鸡红细胞方法检测吞噬能力。结果：微球浓度越高，吞噬率和吞噬指数越大；细胞浓度为1×105～2×105 ml-1，孵育时间1.5 h，微球浓度为1.5×107/孔时吞噬率（PP）和吞噬指数（PI）高（89.87％，1.54），孵育至2 h时出现下降（57.71％，1.51）；细胞浓度对吞噬率和吞噬指数的影响与荧光微球浓度呈负相关。贴壁巨噬细胞经胰酶加EDTA消化后PP为44.51％，PI为0.68，单独使用EDTA消化后PP为37.92％，PI为0.57，均低于使用细胞刮刀处理组。流式细胞术法与鸡红细胞法测定金葵素胶囊对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力影响的结果一致，均为高剂量组吞噬率与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：小鼠腹腔巨噬细胞浓度调整为1×105～2×105，孵育1 h，1×107/孔微球浓度可使实验快速而又精确地反映巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数，且与传统方法结果有良好的一致性。
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联合检测炎症因子IL-6、TNF-α和MCP-1对冠心病临床诊断价值
冠状动脉粥样硬化性心脏病指冠状动脉粥样硬化使血管腔狭窄或阻塞,或(和)因冠状动脉功能性改变(痉挛)导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病."炎症假说"是动脉粥样硬化主要发病机制[1],白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和单核细胞趋化因子-1(MCP-1)等炎症性因子在其过程中发挥着重要的作用.目前流式细胞仪在临床上的应用不断扩大,鉴于此本研究应用荧光微球编码技术,建立了流式微球分析技术(cytometric bead assay,CBA)联合检测IL-6、TNF-α和MCP-1的方法,对冠心病患者血清进行检测,发现其对冠心病的诊断具有一定的临床应用价值,现报道如下.
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风疹病毒再感染儿童鼻粘膜组织T细胞亚群测定
对近3年在我院住院的风疹病毒再感染的患儿鼻粘膜组织T细胞亚群测定,报告如下:1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂 风疹病毒抗体IgM、IgG检测试剂盒(美国Hope公司).T细胞细胞亚群流式分析试剂盒(荧光标记CD4+、CD8+抗体,荧光微球)(Beckman Coulter 公司).CD4、CD8单克隆抗体试剂盒(丹麦Dako公司).
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高通量流式荧光微球悬液芯片检测乙肝病毒基因分型
目的:建立HBV基因分型高通量液相芯片检测技术,并探讨其应用价值.方法:对GenBank中收录的明确分型的HBV基因序列进行分析,选择preS2-S区设计引物和A、B、C和D型特异性探针.与荧光编码微球偶联的特异型探针与一条引物生物素标记的PCR产物直接杂交反应,然后结合亲和素标记的藻红蛋白,用流式检测仪(Bio-Plex 200)检测荧光信号.检测182份阳性乙肝患者血清DNA,其中35份样品检测结果与测序法比较.用B、C型质粒DNA倍比稀释及混合样品检测灵敏度来评估该方法.结果:建立了HBV基因分型的快速高通量液相芯片检测方法.182份患者血清检测结果为:B型占24.2％ (44/182),C型占71.4％(130/182),D型为6.6 ％(12/182),BC混合型4.4％(8/182).其中35份样本与测序法比较,除3份混合型测序法未检出外,其它32例结果均相同本方法的灵敏度检测下线为1×103 copies/mL.结论:应用悬液芯片技术进行乙肝病毒的基因分型分析,具有较好的特异性和较高的灵敏度,并有简便、灵活和高通量等优势.该检测系统不仅在科研中有广泛的前景,也有望成为临床推广的多重分子诊断和基因分型的新方法.
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下肢缺血模型中微循环功能研究方法的建立
目的 通过建立大鼠下肢缺血模型,探索在整体动物中评价微循环功能的标准,为缺血后微循环功能研究提供实验方法.方法 结扎大鼠一侧股动脉及其分支,建立下肢缺血模型,4 wk后用荧光微球法检查肌肉内血液灌注,血管造影检查侧支循环形成,CD34免疫组化检查毛细血管密度.结果 缺血侧肌肉血流量明显下降,形成部分造影可见的螺丝钻样侧枝血管,毛细血管密度降低.结论 在下肢缺血模型中建立了定量研究微循环功能的方法.
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Heartland病毒血清学诊断方法的初步建立
目的 初步建立Heartland病毒血清学诊断方法.方法 利用原核表达系统及杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达并纯化Heartland病毒核蛋白(Nucleocapsid protein,NP),通过间接免疫荧光法、间接ELISA法及基于Luminex技术的荧光微球法建立Heartland病毒核蛋白IgG抗体血清学检测方法,并利用原核系统表达纯化的Heartland NP所制备的兔免疫血清进行评价.结果 原核及真核两系统纯化后的Heartland病毒核蛋白经SDS-PAGE鉴定,均呈现单一蛋白条带,相对分子量约为25 kDa.Heartland NP兔免疫血清经间接免疫荧光检测,其IgG抗体滴度可达1:6 400;经间接ELISA法检测可达1∶409 600以上,经Luminex荧光微球法检测可达1∶4 096 000.上述3种方法检测EV 71 VP1兔免疫血清,均无明显非特异性反应.结论 本研究初步建立了3种Heartland病毒血清学诊断方法,需进一步完善以应用于实验室诊断.
关键词： Heartland病毒 荧光微球 血清学诊断 -
明胶墨汁与荧光微球显示大鼠视网膜微血管灌流效果的对比研究
目的:比较明胶墨汁灌注与荧光微球灌注对大鼠视网膜微血管灌流情况的显示效果.方法:12只成年健康SD大鼠随机分成荧光微球组(6只)和明胶墨汁组(6只).明胶墨汁组分两步经左心室灌注明胶墨汁40 ml.荧光微球组经股静脉注射荧光微球0.5 ml.视网膜行铺片和切片,观察荧光微球和改良墨汁灌注显示的微血管灌流情况;两组视网膜切片还进行NeuN、Parvalbumin和GFAP的免疫组化染色.结果:荧光微球零散分布于视网膜铺片周边部和中央部视的网膜血管中;不能显示铺片的血管轮廓和切片中的血管截面.荧光微球与NeuN、Parvaibumin或GFAP免疫组化双标不能在同一组织中准确显示视网膜血管与神经细胞的紧密空间关系.改良墨汁灌注能清晰显示大鼠视网膜铺片中周边部和中央部的血管网,以及切片中的血管截面,而且此方法与NeuN、Parvalbumin或GFAP免疫组化双标能在同一组织中准确显示视网膜血管与神经细胞的紧密空间关系.结论:改良明胶墨汁灌注在显示大鼠视蚓膜微血管灌流情况方面优于荧光微球,适宜于在视网膜疾病研究中广泛使用.
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HPV16/18 E6蛋白荧光免疫层析联合检测方法的建立
目的 建立宫颈上皮细胞中人乳头瘤病毒 (HPV) 16/18型E6蛋白的荧光免疫层析联合定量检测方法.方法 采用荧光免疫层析原理和双抗体夹心法, 制备荧光免疫层析联合检测试纸条, 并对线性范围、精密性、特异性等性能指标进行评价.结果 实现了对HPV16/18 E6蛋白的联合定量检测;HPV16 E6蛋白线性范围为2.0200 ng/ml, HPV18 E6蛋白线性范围为2.0200 ng/ml;与鳞状细胞癌抗原 (SCCa) 、人附睾蛋白4 (HE4) 无明显交叉反应;批内CV均小于10％, 批间CV均小于15％, 平均回收率分别为102.4％和98.1％;检测经临床病理确诊的宫颈癌样本46份、癌前病变CINⅢ样本38份及健康样本52份, 本方法敏感性分别为91.3％、84.2％, 特异性达到100％.结论 初步建立了联合定量检测HPV16/18 E6蛋白的荧光免疫层析方法, 为临床筛查宫颈癌提供一种新的检测手段.
关键词： 人乳头瘤病毒16/18型E6蛋白 荧光微球 免疫层析 联合检测
